分子细胞遗传学技术与产前诊断课件

分子细胞遗传学技术分子细胞遗传学技术与产前诊断与产前诊断分子细胞遗传学技术与产前诊断1基因诊断的中心问题是认识基因诊断的中心问题是认识遗传变异遗传变异、基因突变基因突变及与及与表型表型之间的关系之间的关系基因诊断的中心问题是认识2一、分子细胞遗传学技术一、分子细胞遗传学技术一、分子细胞遗传学技术3荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in site fluorescence in site hybridization,FISHhybridization,FISH）：用荧光物质标记特异性）：用荧光物质标记特异性DNADNA探针，探针，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达5050500 kb.500 kb.荧光原位杂交技术（fluorescenceinsite4荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（Fluorescence in site Fluorescence in site hybridization,FISHhybridization,FISH）的特异性）的特异性DNADNA探针探针基基因因座座特特异异性性探探针针：克克隆隆扩扩增增获获得得。在在基基因因制制图图方方面面的的努努力，越来越多的这方面探针可以使用力，越来越多的这方面探针可以使用着着丝丝粒粒重重复复序序列列探探针针：这这些些特特异异性性的的探探针针可可在在中中期期染染色色体体和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。全全染染色色体体涂涂染染探探针针：通通过过对对来来自自特特异异性性染染色色体体分分检检库库或或仅仅含含一一条条人人类类染染色色体体的的杂杂种种细细胞胞DNADNA扩扩增增制制备备。这这种种DNADNA序序列列的的混混合合物物与与一一条条染染色色体体上上的的多多个个位位点点同同源源。因因此此在在中中期期核核内内，整整条条染染色色体体得得以以被被涂涂染染。通通过过使使用用不不同同的的荧荧光光素素，在在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsite5应用应用1515号染色体一基因特异性号染色体一基因特异性探针（红色）杂交确定其是否探针（红色）杂交确定其是否缺失；绿色探针鉴定缺失；绿色探针鉴定1515号染色号染色体着丝粒。体着丝粒。2424种不同染色体涂染探针杂种不同染色体涂染探针杂交得到的彩色染色体交得到的彩色染色体应用15号染色体一基因特异性探针（红色）杂交确定其是否缺失；6染色体技术的染色体技术的应用应用1 1inv(14)(p12q24)t(2;11)(2q34;11q13)染色体技术的inv(14)(p12q24)t(2;11)(7细胞遗传学研究中染色体技细胞遗传学研究中染色体技术的应用术的应用FISHFISH技术检出技术检出t(2;14)t(2;14)细胞遗传学研究中染色体技术的应用FISH技术检出8染色体技术的染色体技术的应用应用2 2inv(9)(p12q13)染色体技术的inv(9)(p12q13)9分子细胞遗传学：分子细胞遗传学：DMD基因第基因第46号外显子缺失号外显子缺失分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失10细胞遗传学研究中染色体技术的应用细胞遗传学研究中染色体技术的应用9 9号染色体涂染探针杂交。号染色体涂染探针杂交。箭头示易位到箭头示易位到1010号染色体上号染色体上的来自的来自9 9号染色体的片段号染色体的片段2121号染色体涂染探针号染色体涂染探针FISHFISH杂交，杂交，显示显示2121三体三体细胞遗传学研究中染色体技术的应用9号染色体涂染探针杂交。箭头11比较基因组杂交（比较基因组杂交（comparative genomic comparative genomic hybridization,CGHhybridization,CGH）近近年年在在FISHFISH技技术术基基础础上上发发展展起起来来的的一一种种新新的的分分子子细细胞胞遗遗传传学学技技术术（19921992，KallioniemiKallioniemi）。其其基基本本原原理理是是用用不不同同荧荧光光物物质质分分别别标标记记肿肿瘤瘤细细胞胞DNADNA和和正正常常人人细细胞胞DNADNA，然然后后与正常人中期细胞染色体杂交。与正常人中期细胞染色体杂交。通通过过检检测测染染色色体体上上两两种种荧荧光光信信号号的的相相对对比比值值，了了解解肿肿瘤瘤细胞细胞DNADNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。拷贝数的变化，并可在染色体上定位。这一技术已广泛这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测应用于肿瘤基因组不平衡的检测。比较基因组杂交（comparativegenomichy12比较基因组杂交的原理比较基因组杂交的原理比较基因组杂交的原理13 待测待测DNADNA（肿瘤（肿瘤细胞细胞DNADNA，test test DNA)DNA)为绿色为绿色 参照参照DNA(DNA(正常细正常细胞胞DNADNA，reference DNAreference DNA）为红色为红色 复染为蓝色复染为蓝色人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交待测DNA（肿瘤细胞DNA，testDNA)为绿色人食管14A.A.中期染色体的中期染色体的DAPIDAPI的的B.B.复染图复染图B.中期染色体比较基因组杂中期染色体比较基因组杂 交（交（CGHCGH）：红色区域表示）：红色区域表示 丢失，绿色区域表示扩增。丢失，绿色区域表示扩增。中期染色体的DAPI的B.中期染色体比较基因组杂15CGHCGH的优点：的优点：经经一一次次染染色色体体原原位位杂杂交交实实验验即即可可在在整整条条染染色色体体或或染染色色体体区区带带水水平平对对待待检检基基因因组组DNADNA序序列列拷拷贝贝数数改改变变进进行行检检测测和和定定位。位。无无需需进进行行染染色色体体培培养养，对对于于不不易易制制备备良良好好分分裂裂相相的的实实体体瘤尤为适用。瘤尤为适用。所所需需染染色色体体DNADNA可可来来自自各各种种组组织织，如如新新鲜鲜组组织织、福福尔尔马马林林固固定定的的组组织织、石石蜡蜡包包埋埋组组织织，可可在在很很少少量量的的基基础础上上检检测测，利于做回顾性研究。利于做回顾性研究。CGH的优点：经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色16CGHCGH的局限性：的局限性：难难以以检检出出以以下下异异常常：平平衡衡易易位位，微微小小突突变变，基基因重排，倍体水平改变。因重排，倍体水平改变。结结果果可可能能受受到到一一些些因因素素影影响响：正正常常细细胞胞存存在在，肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。灵灵敏敏度度：限限于于检检测测较较大大范范围围的的缺缺失失（10 10 30MB30MB）CGH的局限性：难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基因重17二、突变分析与分子诊断二、突变分析与分子诊断二、突变分析与分子诊断18（一）基因突变类型（一）基因突变类型点点突突变变：只只有有一一个个或或几几个个核核苷苷酸酸的的改改变变，是是突突变中最多见的形式。变中最多见的形式。稳定突变稳定突变：传递中不改变原有的突变。：传递中不改变原有的突变。动动态态突突变变：传传递递中中不不断断改改变变自自己己，多多见见于于短短重重复复序序列列的的突突变变，在在一一代代代代传传递递中中重重复复次次数数发发生生明显变化。明显变化。（一）基因突变类型点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突变19点突变的结果：点突变的结果：（1 1）同同义义突突变变（samesense samesense mutationmutation）：碱碱基基替替换换后后，虽虽然然密密码码子子发发生生改改变变，但但编编码码氨氨基基酸酸没没有有改改变变（遗遗传传密密码码的兼并性），亦称的兼并性），亦称静止突变静止突变。（2 2）错错义义突突变变（missense missense mutationmutation）：碱碱基基替替换换，密密码码子子发发生生改改变变后后，编编码码氨氨基基酸酸亦亦发发生生改改变变，编编码码另另一一个个氨氨基基酸。酸。（3 3）无无义义突突变变（nonsense nonsense mutationmutation）：碱碱基基替替换换后后，使使编编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。（4 4）中中性性突突变变：包包含含两两种种情情况况，即即“同同义义突突变变”和和不不改改变变蛋白质功能的蛋白质功能的“错义突变错义突变”点突变的结果：（1）同义突变（samesensemutat20基因突变形式基因突变形式碱基的插入和缺失碱基的插入和缺失碱碱基基的的插插入入和和缺缺失失：基基因因编编码码序序列列中中插插入入或或丢丢失失一一个个或或几几个个碱碱基基，其其结结果果是是突突变变点点下下游游碱碱基基序序列列发发生生移移码码，编编码码氨氨基基酸酸序序列列都都发发生生改改变变，又又称称移移码码突突变变（frameshift frameshift mutmuta ationtion），并可在突变点下游提前出现终止密码。并可在突变点下游提前出现终止密码。基因突变形式碱基的插入和缺失碱基的插入和缺失：基因编码序列21碱基的插入和缺失的结果碱基的插入和缺失的结果：将导致：将导致移码突变移码突变（frameshift mutframeshift muta ationtion），并可在突变点下游并可在突变点下游提前出现终提前出现终止密码止密码产生产生截短型蛋白截短型蛋白缺失突变缺失突变碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变（frameshift22基因突变形式基因突变形式框框内内突突变变（inframe inframe mutationmutation）：3 3个个或或是是的的倍倍数数的的碱碱基基缺缺失失或或插插入入导导致致的的突突变变，使使基基因因丢丢失或增加失或增加1 1个或几个氨基酸。个或几个氨基酸。DNA DNA 大大片片段段缺缺失失或或复复制制（large large deletion deletion or or duplication)duplication)：几几百百个个bpbp至至几几十十个个kbkb的的碱碱基基缺缺失或复制。失或复制。基因突变形式框内突变（inframemutation）：323各种类型病理性突变的比例各种类型病理性突变的比例1.1.无义突变和移码突变：无义突变和移码突变：60 602.2.稀有的错义突变：稀有的错义突变：20 203.3.DNADNA大片段缺失或重复大片段缺失或重复:2020另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态位点另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态位点微小突变微小突变各种类型病理性突变的比例无义突变和移码突变：60微24（二）（二）目前常用的对目前常用的对已知已知点突变的分析技术点突变的分析技术限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）等位基因特异性（等位基因特异性（PCRPCR）扩增（）扩增（ASAASA）等位基因特异性寡核苷酸杂交（等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASOASO）DNADNA芯片芯片（二）目前常用的对已知点突变的分析技术限制性片段长度多态性（251.1.限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）分析）分析当当突突变变影影响响到到某某一一限限制制性性内内切切酶酶位位点点时时，可可通通过过酶酶切切PCRPCR产物，电泳分析产物，电泳分析:限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析当突变影响到某一限制262.2.等位基因特异性（等位基因特异性（PCRPCR）扩增（）扩增（ASAASA）通通过过设设计计两两个个55端端引引物物，一一个个与与正正常常DNADNA互互补补，一一个个与与突突变变DNADNA互互补补。分分别别加加入入这这两两种种引引物物及及33端引物进行两个平行的端引物进行两个平行的PCRPCR，分析结果，分析结果。2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）通过设计两个5端273.3.等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASOASO）设设计计两两段段寡寡核核苷苷酸酸探探针针，其其中中包包含含发发生生突突变变的的位位点点，一一段段与与野野生生型型链链互互补补，一一段段与与突突变变型型链链互补互补。杂交分析是否存在突变杂交分析是否存在突变3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）设计两段寡核苷酸探284.4.基因芯片：基因芯片：SNP位点的检测位点的检测4.基因芯片：SNP位点的检测29Microarray-based method for genotyping of functional single nucleotide polymorphisms using dual-color fluorescence hybridization.Mutat Res.2004;548:97-105Microarray-basedmethodforge30（三）目前常用的（三）目前常用的未知未知基因突变分析技术基因突变分析技术异源双链体形成分析（异源双链体形成分析（Heteroduplex analysis,HA）单单 链链 构构 象象 多多 态态 性性 分分 析析（Single-strand conformation analysis,SSCP）变变 性性 梯梯 度度 凝凝 胶胶 电电 泳泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）变变性性高高效效液液相相色色谱谱分分析析（Denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）（三）目前常用的未知基因突变分析技术异源双链体形成分析（H31体外蛋白截短实验（体外蛋白截短实验（Protein truncation test,PTTPTT）定定量量多多重重PCRPCR技技术术（Quantitative Quantitative multiplex PCR,QM-PCR）多多重重探探针针连连接接依依赖赖性性扩扩增增技技术术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation,MLPA)DNADNA序列分析（序列分析（DNA sequencing)体外蛋白截短实验（Proteintruncationte321.1.异源双链体形成分析（异源双链体形成分析（HAHA）由由突突变变型型和和野野生生型型DNADNA链链形形成成的的异异源源双双链链DNADNA在在其其错错配配处处形形成成一一个个凸凸起起，电电泳泳时时会会产产生生与与相相应应的的同同源源双双链链DNADNA不不同同的的迁迁移移率率，从从而而使使两两者者得得以以分分离。离。技技术术路路线线：PCRPCR产产物物9595 C C变变性性5 5分分钟钟，3737 C C复复性性 1010分分钟钟。10%10%聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳（0.2%0.2%硝硝酸酸银染色）银染色）1.异源双链体形成分析（HA）由突变型和野生型DNA链形成的332.2.变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）利利用用不不同同DNADNA序序列列开开始始变变性性时时对对变变性性剂剂浓浓度度的的要要求求不不同同，在在变变性性剂剂浓浓度度梯梯度度凝凝胶胶内内电电泳泳，野野生生型型DNADNA和和突突变变型型DNADNA序序列列的的差差异异所所导导致致其其变变性性点点不不同同使使两两者的电泳迁移率出现差异者的电泳迁移率出现差异2.变性梯度凝胶电泳（DGGE）利用不同DNA序列开始变性时343.3.单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCPSSCP）单单链链DNADNA在在中中性性条条件件下下会会形形成成二二级级结结构构。这这种种二二级级结结构构依依赖赖于于其其碱碱基基的的序序列列。即即使使只只有有一一个个碱碱基基的的不不同同，也也会会形形成成不不同同的的二二级级结结构构并并可可引引起起非非变变性性条条件件下下的的电电泳泳迁迁移移率率的差异。的差异。技技术术路路线线：PCRPCR产产物物9595 C C变变性性5 5分分钟钟，立立即即置置冰冰上上。10%10%聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳。条条件件：电电泳泳缓缓冲冲液液0.50.5 TBETBE，电电压压70v,470v,4 C C环境下电泳过夜（环境下电泳过夜（0.2%0.2%硝酸银染色）。硝酸银染色）。3.单链构象多态性分析（SSCP）单链DNA在中性条件下会形354.4.体外蛋白截短试验（体外蛋白截短试验（PTTPTT）从从蛋蛋白白质质水水平平检检测测基基因因的的突突变变。其其原原理理是是碱碱基基缺缺失失和和插插入入导导致致的的移移码码突突变变、碱碱基基替替换换出出现现的的无无义义突突变变均均可可使使基基因因提提前前出出现现终终止止密密码码，从从而而截短截短mRNAmRNA翻译的蛋白质。翻译的蛋白质。技技术术路路线线：血血细细胞胞RNARNAcDNAcDNART-PCRRT-PCR体体外外蛋蛋白白质质合合成成电电泳泳分分析析截截短短了了的的蛋蛋白白质质相相应应基基因片段的序列分析因片段的序列分析4.体外蛋白截短试验（PTT）从蛋白质水平检测基因的突变。其36上上 游游 引引 物物 55端端 均均 连连 接接 T7T7启启 动动 子子 序序 列列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG 3535SS甲甲硫硫氨氨酸酸，T7 T7 体体外外转转录录/翻翻译译体体系系（兔兔网网织织红红细细胞胞提提取取物物），3030孵孵育育90 90 minmin，完完成成体体外蛋白质合成。外蛋白质合成。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 上游引物5端均连接T7启动子序列GGATCCTAATACG375.5.变性高效液相色谱分析（变性高效液相色谱分析（DHPLCDHPLC）19951995年年Oefner Oefner and and Underhill Underhill 首首次次报报道道DHPLCDHPLC技技术术。其其原原理理是是在在接接近近DNADNA融融解解温温度度条条件件下下进进行行离离子子对对反反相相高高效效液液相相色色谱分析谱分析。DHPLCDHPLC分分析析突突变变的的原原理理：在在DNADNA部部分分变变性性的的条条件件下下，变变异异型型和和野野生生型型DNADNA可可形形成成同同源源双双链链和和异异源源双双链链根根据据其其在在层层析析柱柱上保留的时间可以分辨出变异性型上保留的时间可以分辨出变异性型DNA.DNA.5.变性高效液相色谱分析（DHPLC）1995年Oefner38用用离离子子对对反反相相高高效效液液相相色色谱谱检检测测DNADNA变变异异是是基基于于同同时时存存在在同同源源双双链链和和异异源源双双链链。异异源源双双链链的的检检出出取取决决于于高高效效液液相相色色谱谱的的温温度度。而而色色谱谱温温度度的的选定与野生型选定与野生型DNADNA融解温度（融解温度（TmTm）有关。）有关。DHPLCDHPLC与与其其它它突突变变分分析析技技术术的的比比较较:对对单单个个核核苷苷酸酸变变异异的的检检出出率率:SSCPSSCP技技术术,约约75%75%；DHPLC,DHPLC,90%.90%.用离子对反相高效液相色谱检测DNA变异是基于同时存在同源双链39DHPLC的优点：灵敏，准确；灵敏，准确；分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟；分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟；容易实现自动化操作；容易实现自动化操作；适用于较大样本中基因突变的筛选。适用于较大样本中基因突变的筛选。DHPLC的优点：灵敏，准确；40DHPLC分析：（野生型）分析：（野生型）DHPLC分析：（野生型）41DHPLC分析分析:突变型（单个碱基改变）突变型（单个碱基改变）DHPLC分析:突变型（单个碱基改变）42DHPLC分析分析:突变型（单个碱基改变）突变型（单个碱基改变）DHPLC分析:突变型（单个碱基改变）436.6.定量多重定量多重PCRPCR技术（技术（Quantitative Quantitative multiplex PCRmultiplex PCR，Q-M-PCRQ-M-PCR）目目前前各各实实验验室室普普遍遍采采用用的的突突变变基基因因分分析析技技术术对对基基因因微微小小突突变变的的检检测测具具有有较较高高的的敏敏感感性性，如如对对单单个个碱碱基基改改变变的的检检出出率率可可达达90%90%以以上上。但但对对于于较较大大的的DNADNA缺缺失失或或DNADNA重重复复产产生生的的突突变变，如如以以外外显显子子为为单单位位的的DNADNA缺缺失失，SSCPSSCP、DHPLCDHPLC等等均均难难以以将将其其检检出出。有有资资料料表表明明大大片片段段DNADNA缺缺失失可可占占基基因因突突变变的的三三分分之之一一6.定量多重PCR技术（Quantitativemulti44定量多重定量多重PCRPCR技术要点技术要点：涉涉及及至至少少2 2个个基基因因的的多多个个外外显显子子在在一一个个反反应应管管内内同同时时进进行行PCRPCR扩扩增增，其其中中一一个个外外显显子子作作为为参参照照外外显子，其余作为检测外显子；显子，其余作为检测外显子；控控制制PCRPCR循循环环数数，使使PCRPCR产产物物的的增增加加处处于于对对数数增增长长曲线内；曲线内；PCRPCR产产物物于于DNADNA测测序序仪仪电电泳泳，其其结结果果经经GeneScanGeneScan软软件处理；件处理；定量多重PCR技术要点：涉及至少2个基因的多个外显子在一个反45以以检检测测外外显显子子PCRPCR产产物物与与参参照照外外显显子子PCRPCR产产物物的的比比值值计计算算模模版版DNADNA相相对对拷拷贝贝数数，确确定定是是否否存存在在检检测外显子的杂合性缺失；测外显子的杂合性缺失；检检出出的的缺缺失失经经其其它它方方法法（长长片片段段PCRPCR或或缺缺失失断断裂裂点测序）确认。点测序）确认。以检测外显子PCR产物与参照外显子PCR产物的比值计算模版D467.MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcationMLPADenatured Denatured genomic genomic DNA DNA is is hybridized hybridized with with a a mixture of mixture of more than 40 probesmore than 40 probes.Each Each MLPA MLPA probe probe consists consists of of two two oligonucleotidesoligonucleotides,one one synthetic synthetic and and one one M13-M13-derived.derived.The two part of hybridized probes are ligated.The two part of hybridized probes are ligated.All All probe probe ligation ligation products products are are amplified amplified by by PCR using only one primer pairPCR using only one primer pair.Electrophoresis Electrophoresis of of PCR PCR productsproducts on on DNA DNA Sequencer in Sequencer in GeneScanGeneScan model model.7.MultiplexLigation-dependen47三、遗传性疾病的诊断三、遗传性疾病的诊断三、遗传性疾病的诊断48遗传性疾病的诊断：遗传性疾病的诊断：（一）临症诊断（一）临症诊断（二）症状出现前的诊断（二）症状出现前的诊断（三）产前诊断（三）产前诊断遗传性疾病的诊断：（一）临症诊断49（一）（一）临症诊断临症诊断根根据据就就诊诊患患者者的的临临床床表表现现作作出出（初初步步）判判断断：疾疾病病诊诊断断，遗遗传方式传方式（1 1）症状、体征）症状、体征（2 2）系谱分析）系谱分析部分遗传性疾病的诊断主要依赖于症状、体征部分遗传性疾病的诊断主要依赖于症状、体征对对于于同同时时存存在在散散发发病病例例和和遗遗传传性性病病例例的的复复杂杂性性疾疾病病，如如肿肿瘤瘤，建立相应的临床可疑病例的判定标准建立相应的临床可疑病例的判定标准根据不同的遗传性疾病，选择适当的实验室技术分析确诊：根据不同的遗传性疾病，选择适当的实验室技术分析确诊：生化技术、细胞技术、分子技术生化技术、细胞技术、分子技术多用于对多用于对先证者先证者的诊断的诊断（一）临症诊断根据就诊患者的临床表现作出（初步）判断：疾病诊50PedigreeofafamilyPedigreeofafamily51遗传性疾病基因诊断程序遗传性疾病基因诊断程序临床诊断和确定分析对象临床诊断和确定分析对象确定分析的目标基因确定分析的目标基因以检测目标基因的结构确定分析的技术构成和分析过程：以检测目标基因的结构确定分析的技术构成和分析过程：基基因因微微小小变变异异筛筛查查：SSCP,SSCP,DGGE,DGGE,DHPLC,DHPLC,PTT,PTT,DNADNA测测序分析序分析基因大片段变异（缺失或重复）的分析基因大片段变异（缺失或重复）的分析检出变异的性质评估和患者家族的遗传咨询。检出变异的性质评估和患者家族的遗传咨询。遗传性疾病基因诊断程序临床诊断和确定分析对象52DHPLCDHPLC突变分析突变分析DHPLC突变分析53体外蛋白截短试验体外蛋白截短试验（PTTPTT）HNPCC HNPCC遗传性突变遗传性突变体外蛋白截短试验（PTT）HNPCC遗传性突变54DNADNA序列分析序列分析碱基替换碱基替换DNA序列分析碱基替换55DNADNA序列分析序列分析移码突变移码突变DNA序列分析移码突变56DHPLCDHPLC外显子缺失外显子缺失DHPLC外显子缺失57APC APC 基因型和患者临床表型关系的研究基因型和患者临床表型关系的研究(1)APC(1)APC基因胚系突变与基因胚系突变与FAPFAP临床表型的相关临床表型的相关:位于位于第第13091309位位密码子附近的突变，患者临床症密码子附近的突变，患者临床症 状严重。状严重。(2)APC(2)APC基因体细胞突变与基因体细胞突变与CRCCRC生物学特征：生物学特征：APC基因型和患者临床表型关系的研究(1)APC基因胚58（二）症状出现前的诊断（二）症状出现前的诊断应用于发病年龄延迟的遗传性疾病。应用于发病年龄延迟的遗传性疾病。应应用用于于已已知知遗遗传传性性疾疾病病家家族族的的目目前前表表型型正正常常的的个个体。体。单基因显性遗传病的杂合子个体。单基因显性遗传病的杂合子个体。动态突变的分析。动态突变的分析。结合于遗传咨询工作。结合于遗传咨询工作。（二）症状出现前的诊断应用于发病年龄延迟的遗传性疾病。59对家庭其他人员进行症状出现前的基因分析对家庭其他人员进行症状出现前的基因分析A.A.异异源源双双链链体体形形成成分分析析（HDHD）B.B.单单链链构构象象多多态态性性分分析析（SSCPSSCP）AB对家庭其他人员进行症状出现前的基因分析AB60（三）产前诊断（三）产前诊断分析指征分析指征（1 1）夫妇之一存在染色体畸变，或曾生育染色体病患儿；）夫妇之一存在染色体畸变，或曾生育染色体病患儿；（2 2）有畸形儿生育史；）有畸形儿生育史；（3 3）有原因不明的习惯性流产孕妇；）有原因不明的习惯性流产孕妇；（4 4）夫妇之一有先天性代谢缺陷，或曾生育这类患儿；）夫妇之一有先天性代谢缺陷，或曾生育这类患儿；（5 5）X X连锁遗传病基因携带者孕妇连锁遗传病基因携带者孕妇（6 6）有遗传病家族史，有系近亲婚配的孕妇）有遗传病家族史，有系近亲婚配的孕妇出生缺陷监测出生缺陷监测（三）产前诊断分析指征61Thanks!Thanks!62