目的基因的连接转化涂板培养培训课件

目的基因的连接转化涂板培养pp掌握目的基因的重组连接原理及方法。掌握目的基因的重组连接原理及方法。pp理解蓝白斑筛选鉴定的原理理解蓝白斑筛选鉴定的原理pp熟悉重组熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路和分子转化受体细胞的基本思路和方法方法目目的的2目的基因的连接转化涂板培养实验总设计实验总设计oo分分-PCR分离目的基因分离目的基因oo切切oo接接-目的基因与载体相连目的基因与载体相连oo转转-转入宿主细胞转入宿主细胞oo筛筛-筛选阳性重组体筛选阳性重组体3目的基因的连接转化涂板培养接接-目的基因与载体相连目的基因与载体相连原原 理：理：1.1.1.1.DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶反反反反应应应应时时时时都都都都有有有有在在在在PCRPCRPCRPCR产产产产物物物物的的的的3333末末末末端端端端添添添添加一个或者几个加一个或者几个加一个或者几个加一个或者几个A A A A碱基的特性碱基的特性碱基的特性碱基的特性 2.2.2.2.利利利利用用用用T T T T载载载载体体体体3333末末末末端端端端的的的的T T T T碱碱碱碱基基基基和和和和PCRPCRPCRPCR产产产产物物物物的的的的A A A A碱碱碱碱基基基基互补配对互补配对互补配对互补配对,经连接酶作用经连接酶作用经连接酶作用经连接酶作用,完成与载体的连接完成与载体的连接完成与载体的连接完成与载体的连接4目的基因的连接转化涂板培养 是一种高效克隆是一种高效克隆PCRPCR产物（产物（TA CloningTA Cloning）的专用）的专用载体。由载体。由pUC18pUC18载体改建而成，在载体改建而成，在pUC18pUC18载体的多克隆载体的多克隆位点处的位点处的Xba IXba I和和Sal ISal I识别位点之间插入了识别位点之间插入了EcoR VEcoR V识识别位点，用别位点，用EcoR VEcoR V进行酶切反应后，再在两侧的进行酶切反应后，再在两侧的3 3端添加端添加“T”T”而成。而成。pMDpMDTMTM18-T18-T Vector Vector5目的基因的连接转化涂板培养pMDpMDTMTM18-T18-T Vector Vector6目的基因的连接转化涂板培养7目的基因的连接转化涂板培养仪器与主要器与主要试剂：1.1.pMDTM18-T Vector（TaKaRa公司）2.PCR扩增增产物物3.T4 DNA连接接酶酶4.10T4DNA连接接酶酶缓冲液冲液8目的基因的连接转化涂板培养反应体系反应体系pMDpMDTMTM18-T Vector18-T Vector连接试剂盒使用说明（连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司）公司）pMDpMDTMTM18-TVector18-TVector0.5l0.5lPCR扩增产物扩增产物4.5lControlInsertDNA1lddH2O3.5lSolutionI 5l 5l总体积总体积10l10l1616反应反应反应反应30-60 30-60 分钟分钟分钟分钟9目的基因的连接转化涂板培养o感受态细胞感受态细胞o感受态细胞感受态细胞：经过电击、：经过电击、CaCl2、RuCl等化等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。分子通过时细胞的状态。转转-转入宿主细胞转入宿主细胞10目的基因的连接转化涂板培养实验原理实验原理 -CaCl -CaCl2 2法制备大肠杆菌感受态细胞法制备大肠杆菌感受态细胞目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细处理细菌的方法制备，即用菌的方法制备，即用低渗低渗低渗低渗CaCl2溶液在溶液在低温（低温（低温（低温（0 0）时时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌细菌细菌细菌膨胀成球形膨胀成球形膨胀成球形膨胀成球形，外源外源外源外源DNADNA分子分子分子分子在此条件下易形成在此条件下易形成抗抗抗抗DNADNA酶的羟基钙磷酸复合物酶的羟基钙磷酸复合物酶的羟基钙磷酸复合物酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过粘附在细菌表面，通过热激作热激作热激作热激作用用用用促进细胞对促进细胞对DNA的吸收。的吸收。11目的基因的连接转化涂板培养实验器材实验器材器材：器材：恒温摇床恒温摇床,电热恒温培养箱电热恒温培养箱,台式高速离心机台式高速离心机,无无菌工作台菌工作台,低温冰箱低温冰箱,恒温水浴锅恒温水浴锅,制冰机制冰机,分分光光度计光光度计,微量移液枪。微量移液枪。12目的基因的连接转化涂板培养1.LB1.LB琼脂固体和液体培养基。琼脂固体和液体培养基。2.2.含特定抗生素的含特定抗生素的LBLB固体培养基。固体培养基。3.100mM CaCl23.100mM CaCl2溶液。溶液。4.4.含含15%15%甘油的甘油的0.05mol/L CaCl2:0.05mol/L CaCl2:称取称取0.28g CaCl2(0.28g CaCl2(无水无水,分析纯分析纯),),溶于溶于50ml50ml重蒸水中重蒸水中,加入加入15ml15ml甘油甘油,定容至定容至100ml,100ml,高压灭菌。高压灭菌。5.5.待转化质粒。待转化质粒。试剂试剂 13目的基因的连接转化涂板培养实验步骤实验步骤1.1.挑取一挑取一DH5DH5单菌落于单菌落于2.5ml LB2.5ml LB培养液中培养液中3737过夜培养过夜培养14目的基因的连接转化涂板培养2.2.取其中取其中500ul500ul菌液于一含菌液于一含50mlLB50mlLB培养液的锥形瓶中，培养液的锥形瓶中，3737振摇培养至振摇培养至OD600OD600值达到值达到0.3-0.40.3-0.4之间之间 15目的基因的连接转化涂板培养3.3.取取50ml50ml菌液置于离心管内，菌液置于离心管内，4 4500g4 4500g离心离心5 5分钟分钟16目的基因的连接转化涂板培养5.4 4500g5.4 4500g离心离心5 5分钟收集细胞后，加分钟收集细胞后，加2 ml,100mM2 ml,100mM的冰的冰冷冷CaClCaCl2 2溶液轻轻悬浮细胞溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟冰上放置几分钟,即成感受态即成感受态细胞悬液。细胞悬液。18目的基因的连接转化涂板培养6.6.感受态细胞分装成感受态细胞分装成100l100l的小份的小份,暂且不用的贮存于暂且不用的贮存于-7070可保存半年。可保存半年。取其中一份进行转化。取其中一份进行转化。19目的基因的连接转化涂板培养7.7.向转化管中加入向转化管中加入DNADNA（不超过（不超过10ul10ul）,轻度摇晃混合后于轻度摇晃混合后于冰上放置冰上放置3030分钟。分钟。20目的基因的连接转化涂板培养8.8.将上述混合物转移到预热到将上述混合物转移到预热到4242的水浴锅中，热休克的水浴锅中，热休克9090秒秒 (不要摇动试管不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1 12 2分钟。分钟。21目的基因的连接转化涂板培养9.9.向管内加入向管内加入800ul800ul的的LBLB培养液培养液。然后。然后37 37 培养培养4545分钟。分钟。生长培养基生长培养基22目的基因的连接转化涂板培养10.10.取适量体积的转化细胞转移到取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的含有适当抗生素的LBLB固固体平板体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟钟选择培养基选择培养基23目的基因的连接转化涂板培养11.11.倒置平板于倒置平板于37 37 培养培养12121616个小时。个小时。24目的基因的连接转化涂板培养实验流程实验流程感受态细菌感受态细菌100ulul连接产物连接产物 10ulul冰浴中冰浴中30混匀混匀420C水浴水浴 90冰浴冰浴1-2 加入加入500 l LB培养液培养液 370C振振荡培养培养45 涂板涂板培养过夜培养过夜勿勿勿勿动动动动热热热热激激激激25目的基因的连接转化涂板培养实验注意事项实验注意事项为了提高转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：实验中要考虑以下几个重要因素：1.1.细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:细胞生长密度以刚进入细胞生长密度以刚进入对数生长期对数生长期对数生长期对数生长期时时为好，可通过监测培养液的为好，可通过监测培养液的OD600 OD600 来控制。来控制。2.2.质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度:用于转化的质粒用于转化的质粒DNADNA应主要是应主要是超螺旋态超螺旋态超螺旋态超螺旋态DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)。一般情。一般情况下况下,DNA,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5 5 5 5。3.3.试剂的质量试剂的质量:所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 CaCl2 等均需是最等均需是最高纯度高纯度高纯度高纯度的的(GR.(GR.或或AR.),AR.),并用超纯水并用超纯水配制配制,最好分装保存于干燥的最好分装保存于干燥的冷暗处冷暗处冷暗处冷暗处。4.4.防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNADNA的污染：整个操作过程均应在的污染：整个操作过程均应在无菌条件无菌条件无菌条件无菌条件下进行。下进行。26目的基因的连接转化涂板培养原原原原 理：理：理：理：pMDpMDTMTM18-T Vector18-T Vector含有编码含有编码含有编码含有编码-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（LacZLacZLacZLacZ基因）的调控序列和基因）的调控序列和基因）的调控序列和基因）的调控序列和N N N N端端端端146146146146个氨基酸的编码序列，个氨基酸的编码序列，个氨基酸的编码序列，个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。当这种载体转入的宿主细胞是含有架，不影响功能。当这种载体转入的宿主细胞是含有架，不影响功能。当这种载体转入的宿主细胞是含有架，不影响功能。当这种载体转入的宿主细胞是含有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C C C端编码序列时，此酶的端编码序列时，此酶的端编码序列时，此酶的端编码序列时，此酶的N N N N端序列和端序列和端序列和端序列和C C C C端序端序端序端序列可以互补（称为列可以互补（称为列可以互补（称为列可以互补（称为互补互补互补互补），产生具有酶活性的蛋白质），产生具有酶活性的蛋白质），产生具有酶活性的蛋白质），产生具有酶活性的蛋白质（-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTGIPTGIPTGIPTG（强（强（强（强诱导剂）诱导剂）诱导剂）诱导剂）,X-galX-galX-galX-gal（生色底物）（生色底物）（生色底物）（生色底物）的培养基上呈蓝色。然而的培养基上呈蓝色。然而的培养基上呈蓝色。然而的培养基上呈蓝色。然而外源外源外源外源DNADNADNADNA片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏原有的片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏原有的片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏原有的片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏原有的阅读框，因此同样情况下，带重组质粒的细菌形成白色阅读框，因此同样情况下，带重组质粒的细菌形成白色阅读框，因此同样情况下，带重组质粒的细菌形成白色阅读框，因此同样情况下，带重组质粒的细菌形成白色菌落。菌落。菌落。菌落。筛筛-筛选阳性重组体筛选阳性重组体蓝白斑试验（蓝白斑试验（IPTG-Xgal IPTG-Xgal 试验试验）27目的基因的连接转化涂板培养lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解乳糖乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P大肠杆菌的大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系统系统28目的基因的连接转化涂板培养a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解乳糖分解乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P-肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M1529目的基因的连接转化涂板培养（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 端序列端序列LacZLacZ酶酶30目的基因的连接转化涂板培养31目的基因的连接转化涂板培养