目的基因的表达与调控课件

大家好大家好1目的基因的表达与调控2基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。基因工程技术的核心是基因表达技术。基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。3基因表达在原核生物与真核生物中的差别真核生物基因表达系统中，转录在核内进行，生成hnRNA，核内加工：剪接内含子和外显子，修饰5和3末端后形成成熟mRNA。而后在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。目前已构建出多种基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。原核生物基因表达以操纵子的形式进行;操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用，结构基因开始转录成mRNA，同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录与转译近乎同时完成，mRNA随之被水解掉。4本章主要内容8.1 基因表达的机制基因表达的机制8.2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件8.3 外源基因表达系统外源基因表达系统 8.3.1 大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌基因表达系统（重点重点）8.3.2 芽孢杆菌表达系统（了解）8.3.3 链霉菌表达系统（了解）8.3.4 蓝藻表达系统（了解）8.3.5 酵母表达系统（酵母表达系统（自学自学）8.3.6 哺乳动物细胞基因表达系统（哺乳动物细胞基因表达系统（自学自学）8.3.7 植物细胞基因表达系统（植物细胞基因表达系统（自学自学）8.4 基因表达产物的检测与分离纯化基因表达产物的检测与分离纯化8.5 基因工程的争论和安全措施基因工程的争论和安全措施58.1 基因表达的机制8.1.1 外源基因的起始转录外源基因转录起始的速率转录起始的速率是基因表达的关键（限速）环节。选择恰当的启动子（例如，可调控的启动子）和相关的调控序列，是构建一个高效表达系统的首要问题。原核生物启动子原核生物启动子诱导型启动子诱导型启动子：组成型启动子组成型启动子：如如laclac、trptrp、PRPR、PLPL、tactac等的启动子等的启动子如如T7T7噬菌体的启动子噬菌体的启动子真核生物启动子较复杂，可分为：真核生物启动子较复杂，可分为：诱导型诱导型、组成型组成型和和特异特异性启动子性启动子等类型等类型68.1.2 mRNA的延伸与稳定外源基因起始转录后，保持保持mRNA的有效延伸的有效延伸、终止终止及稳定存在稳定存在是外源基因有效表达的关键。涉及两个问题：1、要防止要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的 mRNA转录的提前终止转录的提前终止；2、要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的防止产生不必要的转录产物转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。78.1.3 外源基因mRNA的有效翻译外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：AUG(ATG)是首选的起始密码子起始密码子。SD序列序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离之间的距离为39个碱基。在翻译起始区周围序列翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。8不同基因组使用密码子具有选择性。主密码子（major codon）罕用密码子（rare codon）如果外源基因外源基因mRNA的主密码子的主密码子与受体细胞基因组受体细胞基因组的主密码子的主密码子相同或接近相同或接近，则基因表达效率就高；否则，其表达效率就低。98.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白融合蛋白表达系统构建分泌蛋白分泌蛋白表达系统构建包涵体包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统108.1.5 目的基因沉默基因沉默的作用机制基因沉默的作用机制基因在基因组中的位置对其表达的影响DNA水平上的基因调控RNA水平上的基因调控位置效应位置效应的基因沉默：转录水平转录水平的基因沉默：转录后水平转录后水平的基因沉默：118.2 基因表达的调控元件8.2.1 启动子启动子启动子（promoter）：是一段提供提供RNA聚合酶识别和结聚合酶识别和结合合的DNA序列序列，它位于基因的上游位于基因的上游。RNA聚合酶通过与它的结合而启动基因的转录。原核基因启动子具有10 和35 序列等结构元件，而真核基因启动子则具有TATA盒及上游元件等特征结构。序列特异性方向性位置特性种属特异性启动子的特征128.2.1.1 原核生物的启动子转录起始位点转录起始位点：多数细菌启动子转录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基起始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。Pribnow框框：10bp处的TATA区（10序列区）序列区）Sextama框框：35bp处的TTGACA区（35区）区）间隔区间隔区：内部无明显的保守性，其序列长度序列长度比碱基组成对启动子的功能更重要对启动子的功能更重要。13原核生物启动子序列特征 示意图（The prokaryotic promoter）RNA聚合酶结合和起始转录的序列聚合酶结合和起始转录的序列（The sequence of DNA needed for RNA polymerase to bind to the template and accomplish the initiation reaction）TTGACATATAATTranscriptional start site53-35-1016-19 bp5-9 bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45CAT148.2.1.1 真核生物的启动子型：rRNA 基因启动子型：mRNA 基因启动子型：tRNA 基因启动子15型启动子所属基因编码的产物为rRNA前体，经剪切加工后成为各种成熟的rRNA分子。人体细胞型启动子核心启动子核心启动子：紧邻转录起始位点，可以启动基因的转录。上游控制元件上游控制元件（UCE）：位于起始位点上游180190bp处，它可以大幅度增强转录效率16型启动子转录起始位点转录起始位点TATA框框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。其中心点位于转录起始点上游2030bp的位置CAAT框框：位于转录起始位点上游75bp处，与RNA聚合酶的结合有关。GC框框：位于转录起始位点上游100300bp处，与转录因子的结合有关。启动子启动子基本区基本区辅助区辅助区17型启动子内启动子内启动子：位于转录起始位点的下游，如 tRNA 和 5SRNA 的启动子。外启动子外启动子：位于转录起始位点的上游，缺乏相应的内部序列。例如：脊椎动物U6核小RNA和7SKRNA启动子，结构类似于真核生物型启动子。188.2.1.3 启动子与转录启动大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分 RNA聚合酶：聚合酶：核心酶核心酶(2)亚基全酶亚基全酶(2)1920 factor:218.2.1.4 启动子的分离随机克隆法随机克隆法PCR 扩增法扩增法待分离启动子的DNA分子酶切后，连接到含有 缺启动子的报告基因的载缺启动子的报告基因的载体上体上，挑选阳性克隆子后进一步分析获得的含有启动子的片段。聚合酶保护法聚合酶保护法过滤膜结合法过滤膜结合法根据根据RNARNA聚合酶与启动子特异性结合聚合酶与启动子特异性结合的原理的原理，取基因组文库中的重组质粒与RNA聚合酶在体外温浴一段时间，让RNA聚合酶与特异启动子序列结合。而后选择合适的限制性内切酶或外切酶消化重组质粒，以未加RNA聚合酶的DNA作对照。琼脂糖电泳分析酶切消化产物，被钝化的酶切位点或片段位于RNA酶保护区域内，即RNA聚合酶的结合位点，该位点可能含有启动子序列。进一步将该片段克隆到启动子探针质粒上，分析和检测启动子的转录活性。228.2.2 增强子增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，又称强化子。增强子的特性：增强子的特性：双向性。重复序列。增强子行使功能与所处的位置无关。特异性。增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。238.2.3 终止子本征终止子：本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。依赖终止信号的终止子：依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅助因子。24本征终止子发夹结构(茎环结构)：延缓RNA聚合酶的运动，不终止RNA的合成，但为转录终止创造条件。寡聚U组成的尾部：转录的终止信号。两大特征特征特征25依赖型终止子终止位点上游5090bp区域，是因子的识别位点。因子依赖型终止子也能形成茎环结构，但茎环的GC含量较低，因此RNA聚合酶在此移动的速度减慢，但停留时间较短，并且茎环结构的下游没有寡聚U结构，RNA聚合酶只能在因子的协助下才能有效终止转录。因子是一个相对分子量为2.0105的六聚体蛋白质分子，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由于它催化NTP的水解，因子能促使新生的RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。26在RNA合成起始以后，因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5-3方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。终止过程需要消耗能量，所以，因子有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。278.2.4 衰减子衰减子（attenuator）：是位于mRNA分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列发生弱化作用的转录终止信号序列，又称弱化子。衰减子最先发现于大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中。28trp前导区的4个片段（1、2、3、4）能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3配对。在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对tRNATrp的浓度很敏感。当培养基中trp浓度很低时，负载有trp的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻trp密码子的速度就很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp 密码子处），这时前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到trp操纵子中的结构基因全部转录。而当trp浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的trp密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可自由配对形成茎环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中衰减子的作用2930318.2.5 绝缘子绝缘子（insulator）：既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用；子起增强或抑制作用；绝缘子抑制增强子的功能是有极性的。它只能抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子的作用，而对处于同一结构域的增强子没有抑制作用；绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。328.2.6 反义子反义RNA（antisence RNA）：同某种天然mRNA反向互补的RNA分子称为反义RNA，它是由双链DNA中的无意义链转录产生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA的转译活性。（antisence techology）。反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。反义子在DNA的复制、转录和翻译的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑以对蛋白质合成的抑制最为普遍制最为普遍。33 复制水平的调节直接抑制反义RNA与引物RNA前体互补，使得引物RNA无法与DNA模板结合，进而抑制DNA复制的频率。间接抑制反义RNA通过阻断复制激活蛋白因子的合成而间接抑制DNA的复制。转录水平的调节反义RNA通过与mRNA的5 端互补结合而阻止转录的延伸；作用于mRNA的poly(A)区域，抑制mRNA的成熟及其运输；与真核生物mRNA结合而影响其剪切加工。34 翻译水平的调节通过与mRNA的5 端SD序列结合，改变其空间构象，从而影响核糖体在mRNA上的定位；通过与mRNA的5端编码区（如起始密码）结合，直接抑制翻译的起始。SD序列（SD sequence）：Shine-Dalgarno序列的简称，此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。它是原核生物中核糖体的结合位点，亦即存在于mRNA分子AUG起始密码子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可与16S rRNA的3-末端序列互补。SD序列在核糖体同mRNA的结合过程中起重要作用。358.3 外源基因表达系统外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。外源基因表达系统外源基因表达系统基因表达载体基因表达载体受体细胞受体细胞基因表达系统基因表达系统原核生物基因表达系统：原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。达系统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。哺乳动物细胞表达系统等。36原核生物作为基因表达系统的受体细胞的特点原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定378.3.1 大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。38与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统所具有的优越性：经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；大肠杆菌已被发展成为一种安全安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；实验证明：许多真核基因许多真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基因等都能在大肠杆菌细胞中都能在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达表达；培养方便培养方便、操作简单、成本低廉，易于工业化批量生产398.3.1.1 大肠杆菌基因表达载体40大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统41（1）DNA复制及重组载体的选择系统复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和反式因子作用区在内的DNA片段。大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子。注意：注意：同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存，但含不同类型复制子的不同质粒载体则可以共存体不能共存，但含不同类型复制子的不同质粒载体则可以共存常见的复制子常见的复制子pMB1pMB1、p15Ap15A、ColE1ColE1：松弛复制型，：松弛复制型，每细胞质粒拷贝数每细胞质粒拷贝数10102020个。个。pSC101:pSC101:严谨复制型，严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于每细胞质粒拷贝数少于5 5个。个。42选择标记目的：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来。在基因克隆中采用的质粒载体的选择标记记号，包括有新有新陈代谢特性、对大肠杆菌素陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性的免疫性，以及抗菌素抗性抗菌素抗性等多种。而绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，并且主要集中在氨苄青霉素抗性氨苄青霉素抗性、四环素抗性四环素抗性、链霉素抗性链霉素抗性、氯氯霉素抗性霉素抗性以及卡那霉素抗性卡那霉素抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。原因：1）由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；2）抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。4344（2）外源目的基因的转录系统这一系统包括启动子、抑制物基因和转录终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。启动子启动子启动子启动子（promotor）：是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。45启动子的特征启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用位点的特异性和种属特异性等特征。在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点间的距离为69bp，但对于要表达的外源基因来说，启动子与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定。46抑制物基因抑制物基因的产物是一种控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药物等）的诱导下，RNA聚合酶才开始启动转录，合成mRNA。47转录终止子转录终止子（terminator）：是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。转录终止子可分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。转录终止子的作用：1、它使转录在目的基因之后立即停止，避免多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量；2、正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。48（3）蛋白质的翻译系统在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码子于SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5端非翻译序列和蛋白编码区的5端序列等。蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统核糖体结合位点（核糖体结合位点（SD序列）序列）翻译起始密码子翻译起始密码子翻译终止密码子翻译终止密码子498.3.1.2 宿主菌重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因：大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统；大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子；大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。常见的大肠杆菌基因表达受体菌株常见的大肠杆菌基因表达受体菌株508.3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统Lac和Tac表达系统：是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。PL和PR表达系统：是以噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。T7表达系统：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。518.3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式表达形式：不溶性蛋白和可溶性蛋白两种。包涵体蛋白包涵体：包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。包涵体存在部位：细胞质、细胞周质52包涵体包涵体的组成的组成蛋白质蛋白质非蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物外源基因的表达产物：占大部分，具有正占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构象错误，因而包涵确的氨基酸序列，但空间构象错误，因而包涵体蛋白一般体蛋白一般没有生物学活性没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物受体细胞本身的表达产物：如如RNARNA聚合酶、聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。白等。：包括包括DNADNA、RNARNA和脂多糖等和脂多糖等。包涵体形成的本质包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：三个方面：折叠状态的蛋白质的聚集作用；折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；蛋白质折叠中间体的作用。蛋白质折叠中间体的作用。53融合蛋白稳定性好；表达效率高；较易于分离纯化。融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。融合蛋白的优点：（与单独表达的外源蛋白相比）54寡聚型外源蛋白在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串多个外源目的蛋白基因串连在一起连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白。外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：1 1、多表达单元的重组：、多表达单元的重组：3 3、多编码序列重组：、多编码序列重组：2 2、多顺反子重组：、多顺反子重组：55整合型外源蛋白将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。56分泌型外源蛋白外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。57优点：优点：（分泌型蛋白的形式表达外源基因）分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。简化了发酵后处理的纯化工艺。缺点：缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。588.3.1.5 在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略高效表达外源基因须考虑的基本原则：高效表达外源基因须考虑的基本原则：1）优化表达载体的设计。2）提高稀有密码子tRNA的表达作用。3）提高外源基因mRNA的稳定性。4）提高外源基因表达产物的稳定性。5）优化发酵过程。598.3.2 芽孢杆菌表达系统（了解）芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有枯草杆菌枯草杆菌和短小芽短小芽孢杆菌孢杆菌等。利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：芽孢杆菌多是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构象和生物学活性；某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。608.3.3 链霉菌表达系统（了解）为非致病性细菌，不产生内毒素；可进行外源蛋白的分泌表达；可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级代谢调控体系，表达外源蛋白的时间较长；链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化基础。链霉菌链霉菌 革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤中，能够产生多种生理活性物质。链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的特点：618.3.4 蓝藻表达系统（了解）蓝藻又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统(PS)和光合系统(PS)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。蓝藻与真核生物藻类最大的区别是：它无叶绿体，无真核，有70S核糖体，细胞壁中含有肽聚糖，因而对青霉素和溶菌酶十分敏感等。62蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物兼具微生物和植物的优点的优点。638.3.5 酵母表达系统酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。酵母菌的特点：酵母菌的特点：基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。648.3.5.1 酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。658.3.5.2 酵母基因表达载体的种类自主复制型质粒载体自主复制型质粒载体（yeast replicating plasmid，YRP）整合型质粒载体整合型质粒载体（yeast integration plasmid，YIP）含有酵母基因组的酵母基因组的DNADNA复制起始区复制起始区、选择标记选择标记和和基因克隆位基因克隆位点点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达200个，但经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。不含酵母不含酵母DNADNA复制起始区复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但但含有整合介导区含有整合介导区，可通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体DNA的同源重组主要有单交换整合和双交换整合两种方式。66着丝粒型质粒载体着丝粒型质粒载体（yeast centromeric plasmid，YCP）在自主复制型质粒载体的基础上，增加了酵母染色体有增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有12个拷贝。67酵母人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）在细胞分裂和遗传过程中，能将载体均匀分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定。酵母菌选择标记基因酵母菌选择标记基因SUP4SUP4表达时转表达时转化子菌落呈白色，不表达时呈红色化子菌落呈白色，不表达时呈红色。外源基因的插入可灭活SUP4基因，获得红色的重组转化子。YAC载体可插入2001000kb的外源基因片段，特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。在酵母细胞中以线性双链以线性双链DNADNA的形式存在的形式存在，每个细胞内单拷贝，包含酵母染色体自主复制序列酵母染色体自主复制序列、着丝粒序列着丝粒序列、端粒序列端粒序列、酵母酵母菌选择标记基因菌选择标记基因、大肠杆菌复制子大肠杆菌复制子和选择标记基因选择标记基因等。688.3.5.3 酵母基因表达系统宿主菌酵母表达系统的主要宿主菌酿酒酵母酿酒酵母*巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母乳酸克努维酵母乳酸克努维酵母多型汉森酵母多型汉森酵母698.3.6 哺乳动物细胞基因表达系统（自学）哺乳动物基因表达载体：质粒载体质粒载体和病毒载体病毒载体哺乳动物基因表达质粒载体是一类穿梭质粒穿梭质粒，能够在细菌（大肠杆菌）和哺乳动物细胞中进行扩增。哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞最高等的真核生物细胞，其结构、功能和基因表达调控更加复杂。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质加工等过程。要表达具有生物学功能的蛋白质和具有特异性催化功能的酶，需要在高等真核生物细胞中进行。708.3.7 植物细胞基因表达系统*时空特异性时空特异性 植物细胞基因表达与调控的特点718.4 8.4 基因表达产物的检测与分离纯化基因表达产物的检测与分离纯化8.4.18.4.1 基因表达产物的检测基因表达产物的检测外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。检测特异性检测特异性mRNAmRNA的方法的方法Northern杂交法杂交法检测特异性蛋白质的方法检测特异性蛋白质的方法生化反应检测法生化反应检测法免疫学检测法免疫学检测法生物学活性检测法生物学活性检测法目的基因表达产物没有可供直接检测的性质时，可将外源基因目的基因表达产物没有可供直接检测的性质时，可将外源基因与标记基因或报告基因一起构成嵌合基因，通过检测嵌合基因与标记基因或报告基因一起构成嵌合基因，通过检测嵌合基因中的标记基因或报告基因间接确定外源目的基因的存在和表达。中的标记基因或报告基因间接确定外源目的基因的存在和表达。728.4.1.1 外源基因转录产物的检测外源基因转录产物的检测SouthernSouthern杂交杂交可以检测到外源基因是否存在于受可以检测到外源基因是否存在于受体细胞中，但不能确定外源基因是否转录。体细胞中，但不能确定外源基因是否转录。NorthernNorthern杂交技术杂交技术可以检测外源基因是否转录出可以检测外源基因是否转录出mRNAmRNA。提取总提取总RNA分离分离mRNA。制备制备RNA探针。探针。Northern杂交。杂交。检测外源基因转录产物还可采用检测外源基因转录产物还可采用RT-PCRRT-PCR的方法。的方法。738.4.1.2 报告基因的酶法检测报告基因的酶法检测报告基因必须具备两大特点：报告基因必须具备两大特点：其表达产物及其功能在未转化的植物细胞中不存在；其表达产物便于检测。目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的编码酶的基因基因，主要有-葡萄糖苷酸酶基因（gus基因）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat基因）、冠瘿碱合成酶基因（胭脂碱合成酶基因、章鱼碱合成酶基因）、抗卡那霉素基因（npt-基因）等。74cat基因编码氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，而乙酰化的氯霉素不再具有氯霉素的活性，失去了干扰蛋白质合成的作用。真核细胞不含氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源性活性，因而cat基因可作为真核细胞转化的标记基因及报告基因。catcat基因转化的植物细胞能够产生对基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性氯霉素的抗性，并可通过对转化细胞中氯霉素乙酰转移酶活性的检测来了解外源基因的表达。cat的活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型CoASH的生成来测定，目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。cat（氯霉素乙酰转移酶）基因的检测（氯霉素乙酰转移酶）基因的检测氯霉素氯霉素最早是从放线菌属委内瑞拉链霉菌中分离出来的，现在使用的是化学合成品。氯霉素能选择地与原核细胞50S亚基或真核细胞线粒体核糖体大亚基结合，抑制蛋白质合成。75gus（-葡萄糖苷酸酶）基因的检测葡萄糖苷酸酶）基因的检测gus基因存在于某些细菌体内，编码-葡萄糖苷酸酶，该酶是一种水解酶，能催化许多-葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的gus活性，许多细菌及真菌也缺乏内源gus活性，因而gus基因被广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在基因外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用得最多。常用于常用于gusgus基因检测的底物基因检测的底物对应的检测方法对应的检测方法5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡萄糖苷酸酯葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）组织化学染色定位法组织化学染色定位法4-甲基伞形酮酰甲基伞形酮酰-D-葡萄糖醛酸苷酯葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）荧光测定法荧光测定法对硝基苯对硝基苯-D-葡萄糖醛酸苷葡萄糖醛酸苷（PNPG）分光光度测定法分光光度测定法76荧光素酶基因的检测荧光素酶基因的检测用作报告基因的荧光素酶主要来自用作报告基因的荧光素酶主要来自细菌细菌或或萤火虫萤火虫。萤火虫荧光素酶催化萤火虫荧光素酶催化的底物是的底物是6-6-羟基喹啉类，在羟基喹啉类，在MgMg2+2+、ATPATP及及O O2 2作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光素，作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光素，其发射光子后转变成常态的氧化荧光素，反应中化学能转变成其发射光子后转变成常态的氧化荧光素，反应中化学能转变成光能。光能。荧光素荧光素ATP+O2 氧化荧光素氧化荧光素CO2+AMP+PPi+光光萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶细菌荧光素酶细菌荧光素酶以脂肪醛为底物，需要还原型的黄素单核苷以脂肪醛为底物，需要还原型的黄素单核苷酸及氧参与，使脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子。酸及氧参与，使脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子。RCHO+O2+FMNH2 RCOOH+H2O+FMN+光光细菌荧光素酶细菌荧光素酶检测方法有两种：检测方法有两种：活体内荧光素酶活性检测活体内荧光素酶活性检测体外荧光素酶活性检测体外荧光素酶活性检测绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白GFP自身发光，不需底物。荧光素酶自身发光，不需底物。荧光素酶Luciferase需需要荧光素底物，当实验中可以加入足够的荧光素底物的时候，因要荧光素底物，当实验中可以加入足够的荧光素底物的时候，因为酶的放大效应，荧光素酶更灵敏。为酶的放大效应，荧光素酶更灵敏。77dhfr（二氢叶酸还原酶）基因的检测（二氢叶酸还原酶）基因的检测dhfrdhfr基因基因又称又称氨甲蝶呤抗性基因氨甲蝶呤抗性基因，编码，编码二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶。该酶能催化二氢叶酸还原为四氢叶酸，而四氢叶酸在胸该酶能催化二氢叶酸还原为四氢叶酸，而四氢叶酸在胸腺嘧啶核苷酸的合成中起重要作用。氨甲蝶呤与二氢叶酸结腺嘧啶核苷酸的合成中起重要作用。氨甲蝶呤与二氢叶酸结构类似，能竞争性抑制二氢叶酸还原酶的活性。构类似，能竞争性抑制二氢叶酸还原酶的活性。植物细胞的二氢叶酸还原酶对氨甲蝶呤极为敏感植物细胞的二氢叶酸还原酶对氨甲蝶呤极为敏感，而来，而来自于细菌或小鼠的二氢叶酸还原酶对氨甲蝶呤的敏感性很低。自于细菌或小鼠的二氢叶酸还原酶对氨甲蝶呤的敏感性很低。用用细菌的二氢叶酸还原酶作为报告基因细菌的二氢叶酸还原酶作为报告基因，可使转基因植，可使转基因植物细胞在一定浓度的氨甲蝶呤培养基中正常生长，而非转化物细胞在一定浓度的氨甲蝶呤培养基中正常生长，而非转化的植物细胞则不能生长。的植物细胞则不能生长。788.4.1.3 免疫学检测免疫学检测免疫学检测免疫学检测免疫沉淀法免疫沉淀法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法WesternWestern沉淀法沉淀法固相放射免疫法固相放射免疫法 免疫沉淀法免疫沉淀法可应用于表达产物的定性与定量分析。优点：优点：选择性好，灵敏度高，可检测出100pg水平的放射性标记蛋白，并可从蛋白质混合物中提纯出抗原抗体复合物。79免疫沉淀法的步骤：免疫沉淀法的步骤：对靶细胞进行放射性标记。对靶细胞进行放射性标记。细胞裂解。细胞裂解。形成特异性免疫复合物。形成特异性免疫复合物。靶蛋白的免疫沉淀。靶蛋白的免疫沉淀。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。80 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）ELISA是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液液抗原抗体反应体系不同之处是建立了固液抗原抗体反应体系，并采用酶标记。抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。由于酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高，可检出1pg的目的物。同时酶反应还具有很强的特异性。因此ELISA是基因表达研究中不可缺少的方法。除了可溶性抗原（抗体）之外，ELISA还可以检测含表面抗原的细胞。ELISAELISA检测外源基因表达蛋白的四个步骤：检测外源基因表达蛋白的四个步骤：抗体制备抗体制备抗体或抗原的包被抗体或抗原的包被免疫反应免疫反应特异性表达产物的检测特异性表达产物的检测81WesternWestern印迹法印迹法Western杂交是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定融为一体的蛋白质检测方法。它具有很高的灵敏性，可从植物细胞总蛋白中检测出50ng的特异蛋白质。若是提纯的蛋白质，可检至15ng。原理：原理：转化的外源基因正常表达时，转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位印迹到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。然后加入特异抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的标记的二抗，最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。82WesternWestern印迹法的五个步骤：印迹法的五个步骤：转基因植株蛋白质的提取转基因植株蛋白质的提取SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质蛋白质条带印迹蛋白质条带印迹探针制备探针制备杂交杂交83固相放射性免疫测定（固相放射性免疫测定（RIARIA）法（了解）法（了解）RIA法是一种定量测定外源表达蛋白的方法。该法具有很高的灵敏度，可检测出1pg的靶蛋白。RIARIA法的四种类型法的四种类型竞争性竞争性RIARIA固定抗原固定抗原RIARIA固定抗体固定抗体RIARIA双抗体双抗体RIARIA848.4.1.4 表达产物生物学活性检测表达产物生物学活性检测当外源基因的表达产物是一种酶蛋白时，可根据酶的催化反应来确定外源基因表达与否和表达的程度。该方法简便且易于操作，在反应体系中加入特定的底物和基因表达产物的抽提物就可根据反应现象进行定性和定量的分析。858.4.2 基因表达产物的分离纯化基因表达产物的分离纯化基因表达产物的分离纯化 1)细胞破碎 2)离心分离 3)特异性表达蛋白的初步分离 4)柱层析 5)聚丙烯酰胺凝胶电泳868.4.2.1 细胞的破碎细胞的破碎对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。对于非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。常见的细胞常见的细胞 破碎方式破碎方式变性剂裂解法变性剂裂解法超声波破碎法超声波破碎法机械破碎法机械破碎法酶裂解法酶裂解法878.4.2.2 离心离心离心力一般在数万离心力一般在数万g g范围以内，主要用来去除范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等；未破碎的细胞和细胞壁碎片等；高速离心：高速离心：超速离心：超速离心：离心力一般离心力一般100,000g100,000g以上，可用来去除细胞膜以上，可用来去除细胞膜碎片等高分子复合物。碎片等高分子复合物。v附：离心力和转速的换算公式：附：离心力和转速的换算公式：RCF=11.18(N/1000)2rRCFRCF：相对离心力：相对离心力，单位为重力加速度，单位为重力加速度g gN N：转头旋转速度（转速），：转头旋转速度（转速），用用r/minr/min表示表示r r：转头半径：转头半径，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离，单位为厘米（离，单位为厘米（cmcm）888.4.2.3 特异性表达蛋白的初步分离特异性表达蛋白的初步分离沉淀法沉淀法：超滤浓缩法：超滤浓缩法：根据蛋白质分子大小的不同而进行初步根据蛋白质分子大小的不同而进行初步分离的一种方法。分离的一种方法。简便有效，能处理大量的样品、并除去简便有效，能处理大量的样品、并除去大量的杂蛋白。常用硫酸氨或有机溶剂大量的杂蛋白。常用硫酸氨或有机溶剂对离心后的样品进行分步沉淀。该法也对离心后的样品进行分步沉淀。该法也常用于蛋白质的浓缩。常用于蛋白质的浓缩。898.4.2.4 柱层析柱层析柱层析：柱层析：包括包括凝胶柱层析、离子交换层析、吸附层析、金属凝胶柱层析、离子交换层析、吸附层析、金属螯合层析、共价层析、疏水层析螯合层析、共价层析、疏水层析和和亲和层析亲和层析等。等。层析的基本原理：层析的基本原理：所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，一个是固定相即层析介质，一个是流动相。利用混合溶液中蛋一个是固定相即层析介质，一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极白质分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两相中，并以不同的速度移动，最终彼此分开。两相中，并以不同的速度移动，最终彼此分开。柱层析纯化蛋白质的步骤：柱层析纯化蛋白质的步骤：装柱装柱柱平衡柱平衡上样上样洗脱洗脱分部收集分部收集检测检测908.5 8.5 基因工程的争论基因工程的争论 和安全措施和安全措施91基因工程技术尚不能做到十全十美！基因工程技术尚不能做到十全十美！转基因技术尚不够完善，转基因生物并非十全十美现代转基因工程产品的不确定性和存在破坏环境的风险转基因产品具有特殊性质。自身可繁殖、突变、变迁，可能造成生态问题伦理和宗教因素92课时安排32第1讲 学科进展与基因工程导论、基因工程的应用与安全性评价 5第2讲 基因工程的酶学基础 3第3将 基因工程载体 7第4讲 PCR技术与DNA测序 3第5讲 核酸分子杂交技术 2第6讲 电泳技术 3第7讲 目的基因的分离和制备 3第8讲 受体细胞与转化 3第9讲 外源基因的表达调控与检测 2 复习、讨论与疑难解答 193