多聚酶链式反应课件

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断1ppt课件.课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断1ppt课件.1概概念念：PCR即即_，是是一一种种体体外外迅迅速速扩扩增增DNA片片段段的的技技术术。它它能能以以极极少少量量的的_为模板，在短时间内复制出上百万份的为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。拷贝。多聚酶链式反应多聚酶链式反应DNA 遗传疾病的诊断、遗传疾病的诊断、刑侦破案、刑侦破案、古生物学、古生物学、基因克隆基因克隆 DNADNA序列测定。序列测定。2 、PCR技术技术 的应用的应用 2ppt课件.1概念：PCR即_，是一种体外一、基础知识一、基础知识（一）回忆（一）回忆DNA的复制的复制 回答相关问题回答相关问题1、发生时间发生时间：发生在细胞有丝分裂的发生在细胞有丝分裂的间期间期和减数第一次分裂和减数第一次分裂间期间期。2、特点特点(方式方式)：边解旋边复制边解旋边复制半保留复制半保留复制多起点复制多起点复制3、合成条件、合成条件模板模板：原料：原料：游离的脱氧核苷酸游离的脱氧核苷酸DNA两条链两条链能量：能量：ATP酶酶:解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶反应条件温和反应条件温和4 4、场所：、场所：细胞核细胞核(主主)、线粒体、叶绿体、线粒体、叶绿体3ppt课件.一、基础知识（一）回忆DNA的复制 回答相关问题1、DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸（二）（二）DNADNA复制的条件复制的条件4ppt课件.DNA母链：提供复制的模板（二）DNA复制的条件4ppt课件12345脱氧核苷酸结构脱氧核苷酸结构1DNA的平面结构：的平面结构：5ppt课件.12345脱氧核苷酸结构1DNA的平面结构：5ppt课件.OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖53磷酸二酯键磷酸二酯键DNA3DNA3端，端，端，端，55端指什么端指什么端指什么端指什么。DNADNA的的的的羟羟羟羟基基基基(-OH)(-OH)末末末末端端端端称称称称为为为为33端端端端，而而而而磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团的末端称为的末端称为的末端称为的末端称为55端端端端。脱氧核苷酸脱氧核苷酸 链链 结构结构6ppt课件.OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基目录上页下页习题参考书返回ATGCATGC5 5，端含磷酸基团端含磷酸基团端含磷酸基团端含磷酸基团3 3，端含羟基端含羟基端含羟基端含羟基3 3，端端端端5 5，端端端端7ppt课件.目录上页下页习题参考书返回ATGCATGC5，端含磷酸基团3目录上页下页习题参考书返回DNADNA聚合酶的特性聚合酶的特性 -专一性专一性 DNA DNA聚合酶不能从头开始合聚合酶不能从头开始合成成DNADNA，而只能从，而只能从3 3端延伸端延伸DNADNA链。链。因此，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。8ppt课件.目录上页下页习题参考书返回DNA聚合酶的特性-专一性观察图观察图 2复制的方向：复制的方向：2 方向：方向：子链的子链的5端向端向 3端延伸。端延伸。9ppt课件.观察图 2复制的方向：2 方向：子链的5端向 3端延10ppt课件.10ppt课件.（1 1）、）、DNADNA 分子的热变性原理分子的热变性原理DNADNA双链双链单链单链 变性（加热变性（加热80-10080-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）变性的目的：变性的目的：解开双链解开双链:解开氢键解开氢键 在80100 的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双螺旋结的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为构将解体，双链分开，这个过程称为2、PCR原理原理变性变性11ppt课件.（1）、DNA 分子的热变性原理DNA双链单链 变性（加热 高温解决了打开双链的问题，但高温解决了打开双链的问题，但是，又导致是，又导致DNADNA聚合酶失活的问题，聚合酶失活的问题，耐高温的耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶解决了高温聚合酶解决了高温导致导致DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCR技术的自动化。技术的自动化。（2 2）、）、Taq DNATaq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用12ppt课件.高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失（3 3）、）、PCR PCR 反应的条件反应的条件DNADNA模板；模板；分别与两条模板链相结合的分别与两条模板链相结合的两种两种引物引物（引物（引物和引和引物物）；）；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶（耐高温的聚合酶（Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶）；控制温度，但控制温度，但不需解旋酶不需解旋酶；需要在一定的需要在一定的缓冲液缓冲液中进行。中进行。PCR PCR PCR PCR 反应需要的这些条件的原因是什么？反应需要的这些条件的原因是什么？反应需要的这些条件的原因是什么？反应需要的这些条件的原因是什么？13ppt课件.（3）、PCR 反应的条件DNA模板；PCR 反应需要的这1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮（1 1）、步骤：）、步骤：变性变性 复性复性延伸延伸二、二、PCR的反应过程的反应过程 14ppt课件.1234522557294时间（min）温度（）适温延伸高5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/15ppt课件.5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物变性95oC复性5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万（万（220）倍以上。）倍以上。16ppt课件.5引物15引物2第二次复制第一次复制55 55 2 2、PCRPCR的反应结果的反应结果从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物为模板参与反应，并且由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸的延伸 DNA DNA聚合酶只能特异性地聚合酶只能特异性地复制处于两个引物复制处于两个引物之间的之间的DNADNA序列序列，使这段固定长度的序列呈，使这段固定长度的序列呈指指数数扩增。扩增。17ppt课件.2、PCR的反应结果从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作三、三、PCR反应的实验操作反应的实验操作1 1 1 1、PCRPCRPCRPCR仪仪仪仪设备及用具设备及用具2 2 2 2、微量离心管、微量离心管、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容，总容积为积为0.5ml0.5ml3 3 3 3、微量移液器、微量移液器、微量移液器、微量移液器 用于用于用于用于定量转移定量转移定量转移定量转移PCRPCRPCRPCR配方中的配方中的配方中的配方中的液体液体液体液体，其其其其上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器18ppt课件.三、PCR反应的实验操作1、PCR仪设备及用具2、微量离心三、三、PCR反应的实验操作反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次94C,10min94C,10min94C,10min94C,10min30303030次次次次4444，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次4444，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min19ppt课件.三、PCR反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的污等因素的污染而造成干扰实验，染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：（6 6）、注意事项）、注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头20ppt课件.PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰四、结果分析与评价四、结果分析与评价DNA 含量的测定：含量的测定：稀释稀释对照调零对照调零测定测定计算计算（DNADNA含量（含量（g g/mL/mL）50(260nm50(260nm的读数的读数)稀释倍数稀释倍数）波长波长260nm处读数处读数蒸馏水蒸馏水做对照做对照50倍倍21ppt课件.四、结果分析与评价DNA 含量的测定：稀释对照调零波长2（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算四、课题成果评价四、课题成果评价1 1、一条、一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2 n n2 2、a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a x2 a x2 n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1、原理、原理 可以通过测量可以通过测量DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰值的大小与DNADNA的含量有关的含量有关22ppt课件.（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条D五、五、课题延伸课题延伸例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循环扩增量达轮循环扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。核酸扩增技术。它具有它具有特异性强、敏特异性强、敏感性高、产率高、感性高、产率高、快速、快速、简便、重复简便、重复性好、易自动化性好、易自动化等突出特点。等突出特点。23ppt课件.五、课题延伸例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细胞提供在解旋酶作用下，细胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全部解开，双链全部解开，不需解旋酶不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶（不耐高聚合酶（不耐高温）温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋边复制，半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。多起点复制。半保留复制，完全解旋后复半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制，从模板链的一端开始复制。制。复制的方向复制的方向子链的子链的55端向端向 3 3端延伸端延伸子链的子链的55端向端向 3 3端延伸端延伸24ppt课件.体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！此课件下载可自行编辑修改，供参考！