生物技术制药-(动物细胞制药)--课件

第四章 动物细胞制药 第一节 概述4细胞是一切动、植物体的基本组成结构单位。4一、细胞培养的发展4先后经历了细胞的发现、细胞学说的建立、细胞的早期体外培养实验、组织培养和细胞培养以及细胞工程学的建立等阶段。1医学资源4细胞的发现：1665年人类首先发现了细胞。英国物理学家Hooke和荷兰科学家Leeuwenhoek用自制显微镜首先发现了细胞。4细胞学说的建立：19世纪中期，1838和1839年，德国科学家Schleiden和Schwann建立了细胞学说，是19世纪自然科学三大发现之一。2医学资源4细胞的早期体外培养实验：19世纪末至20世纪初，1885年1907年，用生理盐水培养鸡胚组织，用血清和血浆培养血液中和结缔组织中的细胞，用淋巴液培养蛙神经组织中的细胞。3医学资源4组织培养和细胞培养：20世纪20年代70年代，利用细胞培养生产疫苗，利用血清和血浆体外培养动物细胞，使用培养基体外无菌条件下培养细胞。4细胞工程学：20世纪80年代至今。4医学资源4二、组织培养或细胞培养4将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体体内的生理条件进行培养，使之生存和生长，以获得生物体株系或从中制备目的产物。5医学资源4三、细胞工程学及其内容41、细胞工程学（Cell engineering）:以细胞为单位，应用细胞生物学、分子生物学等学科的理论和技术，按人们的意志改变细胞的某些遗传特性，以达到改良或创造新品种的目的，以及使细胞增加或获得产生某种特定产物的能力，并通过在离体条件下进行细胞的大量培养、增殖，并从中提取对人类有用的产品。4它是一门应用科学和技术，是当今高新技术生物工程研究领域的重要组成部分。6医学资源42、细胞工程学的研究内容4真核生物的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术；4细胞融合的理论和技术；4细胞器移植的理论的技术；4染色体改造的理论和技术；4转基因动、植物特性研究的理论和技术；4细胞大规模培养的理论和技术；4目的产物提取纯化的理论和技术7医学资源4四、动物细胞在生物制药领域中的应用4细胞虽小，但组成结构精密、复杂，有着巨大的生产效率，可生产许多维持机体生命所需的产物。4许多基因产物不能在原核细胞内表达，需要经真核细胞所特有的翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一样的功能和抗原性。8医学资源4因此，动物细胞成为基因工程重要的宿主细胞，以生产多种非常重要的生物制品。4（1）利用动物细胞培养病毒来生产疫苗：包括乙肝疫苗、乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、狂犬疫苗等。4（2）淋巴因子：、和干扰素，1、2和6白细胞介素。4（3）酶原激活剂：纤维蛋白溶酶原激活剂（ProUK），组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）等。9医学资源4（4）单克隆抗体：McAb4（5）红细胞生成素：EPO4（6）其它：第8因子、肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白C、粒细胞克隆刺激因子（G-CSF）、上皮生长因子（EGF）及SOD等。10医学资源第二节 动物细胞的形态和生理特点 4一、动物细胞的结构和形态4（一）动物细胞的结构4动物细胞的结构较原核细胞复杂得多，无细胞壁，有微管、微丝、微体、纤毛、伪足、微绒毛、胞饮沟、由核膜延伸形成的内质网、核糖体、高尔基体、线粒体、中心粒、酶原粒、核膜、核仁等。11医学资源4（二）动物细胞的形态4动物细胞不是靠一个细胞包办一切生理活动，各种细胞有明确的分工，相应有不同的形态。这种随功能不同所产生的形态变化称分化。4肌肉细胞成纺缍形，起收缩伸展的作用。4神经细胞细长并有很长的分支和纤维，便于接受和传递刺激。12医学资源4红细胞呈圆盘状，使与外界的接触面相对增大，有利于与周围环境交换气体和在血管内流动。4上皮细胞相互挤压成不规则的立方形、锤形等。4 但这些分化的形态，当细胞离体培养时经常会发生变化。13医学资源4（三）离体培养细胞的形态41、贴壁细胞（贴壁依赖型）anchorage dependent:4这类细胞生长必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基提供的贴附因子才能在该表面上生长繁殖。4当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态。14医学资源4纤维样细胞型4主要来源于中胚层组织的细胞（成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞或成骨细胞等）。4离体培养时，细胞呈梭形或不规则的三角形，细胞群常连接成网，生长时呈放射状、漩涡状或火焰状。15医学资源4上皮样细胞型4主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤、肠管和肺泡上皮细胞等。4贴壁培养时，细胞呈扁平的不规则的多角形，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。4上述形态不是绝对的，会随着培养条件的变化而有所变化。16医学资源42、悬浮细胞（非贴壁依赖型）anchorage independent4生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，常呈圆形。如血液内的淋巴细胞和产生干扰素的Namalwa细胞等。17医学资源43、兼性贴壁细胞4有些细胞并不严格地依赖支持物，即可以贴附于支持物表面生长，还可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长，这类细胞称兼性贴壁细胞。4在贴壁生长时呈上皮样或纤维样细胞的形态，而悬浮生长时呈圆形。如：中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。18医学资源4二、动物细胞的生理特点4动物细胞的培养与微生物和植物细胞的培养有很大不同，这是由动物细胞的生理和生长特点决定的。41、细胞分裂周期长4动物细胞分裂所需时间一般为1248h。不仅随细胞种属的不同而不同，同一种属、不同部位的细胞所需的时间也不同；4培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。19医学资源4整个分裂周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）4G1期：DNA合成前期。4S期：DNA合成期。4G2期：DNA合成后期。4细胞分裂一次，即传代一次。20医学资源42、离体培养常需贴附于基质，并有接触抑制（contact inhibition）现象4（1）贴附生长：除少数悬浮培养的细胞外，大多数正常二倍体（diploid）细胞的生长都需在一定的基质（玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖。在无血清培养基内由于不能合成贴附因子，不能实现贴附生长。21医学资源4（2）接触抑制现象（contact inhibition）4当细胞贴附在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，若保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但密度不再增加，该现象称之接触抑制或密度依赖抑制现象。4若细胞转化为异倍体后，该现象随之消失，细胞可多层生长，密度也可大大增加。22医学资源43、正常二倍体细胞生长寿命是有限的4细胞离体培养开始，我们称为原代培养。经传代后，即成为有限细胞系。4即使培养条件都很理想，有限细胞系也只能生长有限时间，经若干代传代培养后将逐渐死亡。23医学资源4该时间的长短取决于种属和年龄。4如：人成纤维细胞可培养50代，鸡胚成纤维细胞可传代30代，小鼠成纤维细胞只能培养8代。而且年龄越大，培养代数越少。4但在培养基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的培养寿命从50代增至150代。24医学资源4当细胞经自然或人为的因素转化为异倍体后，可转变成无限细胞系，或称连续细胞系，此时细胞的寿命是无限的，更适合工业化生产的需要。25医学资源44、动物细胞对周围环境十分敏感4动物细胞培养难度很大，对环境条件非常敏感。4因其无细胞壁，仅有细胞膜，一切能影响脂质和蛋白质分子变性的因素都会影响动物细胞的存活。4对多种物理化学因素，如渗透压、pH、离子强度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱。26医学资源45、对培养基要求高4不仅需要12种必需氨基酸，8种以上的维生素，多种无机盐和微量元素，以及碳源葡萄糖外，还需多种生长因子和贴壁因子。27医学资源46、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同4其蛋白质的合成除了在游离的核糖体上进行外（用于细胞质基质内），还在与糙面内质网上结合的核糖体上进行（分泌性的和膜中的整合蛋白）。28医学资源4蛋白质的糖基化在高尔基体内加接的是O-链寡糖，在内质网中加接的是N-链寡糖。4原核生物由于缺少糙面内质网结构，无法对蛋白质进行糖基化和其他一系列翻译后修饰。29医学资源第三节 生产用动物细胞的要求和获得 4一、生产用动物细胞的要求4什么样的细胞允许用以生产人用的药品，这是多年来人们争论的焦点。41、早期的生物制品法规定4只有从正常组织分离的原代细胞才能用来生产生物制品，如鸡胚细胞、兔肾细胞。30医学资源4只要是二倍体细胞，即使经多次传代也可用于生产。但非二倍体细胞是绝对禁止使用的。4这种规定极大限制了细胞的来源和更大规模生产的可能性，因二倍体细胞的寿命一般都不会超过50代。4人们担心异倍体细胞的核酸会影响到人们正常的染色体，而有致癌的危险。31医学资源42、近年来的规定4取消了对异倍体传代细胞的限制；4需参照美国食品与药品管理局FDA对细胞株的要求，严格限制最终产品中残留的DNA量。32医学资源4自20世纪80年代以来，一大批用异倍体传代细胞生产的产品被批准上市。4如：用Namalwa细胞生产的干扰素；用杂交瘤细胞生产的单克隆抗体OKT3；用猴肾异倍体传代细胞生产的狂犬疫苗等。4因基因重组的大量试验证明，DNA体外重组率极低（109），体内由于存在大量胞外核酸酶，外来的核酸更难被整合。33医学资源4二、生产用动物细胞的获得4用于生产的动物细胞主要有：原代细胞、二倍体细胞系、可无限传代的异倍体转化细胞系（Continuous Cell Line）、以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系（genetially-engineered cell line）34医学资源41、原代细胞4是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬浮液。4由于组织块内常有多种细胞组成，而真正生产需要的只是其中的一小部分。因此，用原代细胞来生产生物制品常需要大量的动物，费钱费劳力。4常用的有鸡胚、兔肾或鼠肾原代细胞，以及血液的淋巴细胞。35医学资源42、二倍体细胞系（有限细胞系）4原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。36医学资源4该细胞仍具备“正常”细胞的特点。4它的染色体组型仍然是2n的核型。4具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性。4增殖能力有限，一般可连续传代50代。4无致癌性。4 一般从动物的胚胎组织中获取，广泛应用的有WI-38、MRC-5、2BS等。37医学资源43、异倍体转化细胞系4这类细胞是通过某个转化过程，由于染色体的断裂变成异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖能力。4（1）自发的转化过程：正常细胞在传代过程中，大部分细胞随着传代次数的增加寿命逐渐终结，但其中有个别细胞可自发地转化而形成有无限生命力的细胞系。这种转化多发生在啮齿动物。38医学资源4（2）人为诱发4在细胞培养过程接入某些病毒（如SV40）或加入某些化学试剂（如甲基胆蒽等），促进正常细胞转化成异倍体细胞系。4（3）直接从动物的肿瘤组织中分离制备的细胞系也是转化的细胞。39医学资源4转化细胞系的特点：4具有无限增殖能力；4倍增的时间较短；4对培养条件和生长因子等要求较低；4更适于大规模工业化生产的需要。4近年来常用于生产的转化细胞系有：Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等。40医学资源4获取上述所需细胞，除原代细胞需靠自己临时用动物组织制备外，一般都可从各国的细胞库或有关细胞研究机构的细胞保存中心获取。41医学资源第四节 动物细胞的培养特性和培养条件 4一、动物细胞的培养特性 动物细胞培养过程中具有以下特性：41、生长缓慢，易受杂菌污染，培养时需加抗生素。42、较微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差。42医学资源43、培养过程需氧量相对较少，不耐受强力通风搅拌。44、在动物机体中，细胞相互粘连以集群形式存在。培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性。43医学资源45、培养过程产物分泌于细胞内外，反应过程成本高，但产品价格昂贵。46、大规模培养时，不可套用微生物反应的经验。47、原代细胞和二倍体细胞系一般繁殖50代即退化死亡。44医学资源4二、动物细胞的培养条件4要使动物细胞在体外培养成功，必须提供尽可能与体内生活条件相接近的环境条件。45医学资源（一）基本条件 1、所有细胞培养用到的器材、设备和溶液都必须清洁和绝对无菌。（1）器材和设备必须经严格的清洗4一般需经过浸泡、刷洗、泡酸和冲洗4步。用3%的磷酸三钠溶液浸泡过夜，泡酸一般用重铬酸钾洗液，再用水充分冲洗。46医学资源 （2）器材、设备和溶液的消毒4可采用紫外线、干热、湿热和过滤除菌等物理消毒法或使用各类化学消毒剂和抗生素等化学消毒法。47医学资源42、必须有足够的营养供应，绝对不可含有有害的物质。即使是极微量的有害离子掺入。43、保证有适量的氧气供应。44、需随时消除细胞代谢中产生的有害产物。45、有良好的适于生存的外界环境，包括温度、pH、渗透压和离子浓度等。46、及时分种，保持合适的细胞密度。48医学资源 （二）动物细胞培养的环境条件 1、水质4培养液用水必须经严格处理，使水中金属离子降至最低，电阻值必须大于18M。4常将蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透以及中空纤维过滤等几种方法结合起来。49医学资源 2、温度4哺乳动物细胞培养温度为37+0.5，而昆虫细胞则为27左右。3、渗透压4由于无细胞壁，对培养液渗透压极敏感，通常最理想的渗透压为290300mOsm/kg，可用增减NaCl来调整渗透压。4培养过程中多使用平衡盐溶液（BSS）。50医学资源 4、pH4最适pH为7.27.4，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响。4通常可在培养基中加入缓冲液或缓冲剂来稳定所需的pH。51医学资源 5、供氧4动物细胞对氧的消耗约为0.0060.3mol/106细胞 h或24mg/106细胞d。4在摇瓶培养时，培养液的体积不超过瓶总容积的30%，通过液面的空气交换就可保证有足够的氧。4采用生物反应器大规模培养和生产时，则须专门通气，常用不同比例的O2、N2、CO2和空气的混合气。52医学资源第五节 动物细胞培养培养基的组成和配制 4动物细胞培养随着细胞的种系不同，对培养基的要求有很大差异。4动物细胞制药的成本之所以较高，培养基组分复杂且昂贵是其主要的原因之一。53医学资源 一、培养基的种类 1、天然培养基4在细胞培养的初期，大多采用完全天然来源的培养基，如血清、血浆、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。4天然培养基的特点：成分复杂，组分不稳定，未知因素多，来源有限，不适于大量培养和生产需要。54医学资源 2、合成培养基4采用成分明确的化学试剂配制成的培养基。目前，已有几十种商品在市场供应。4合成培养基的特点：成分明确且稳定，可满足大规模生产的需要。在使用时还需添加520%的血清以提供各种生长因子、激素和贴附因子等。55医学资源 3、无血清培养基4完全由成分明确的化学试剂和添加剂配制而成，使用时不需添加血清。（1）无血清培养基的特点4避免了血清各批次之间差异的影响，提高了细胞培养的可重复性。4减少了血清带来的病毒、支原体等微生物污染的危险。56医学资源4供应充足、稳定。4细胞产品易于纯化。4避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性。4便于实验结果的分析，减少了血清中蛋白对某些生物制品测定的干扰。57医学资源 （2）无血清培养基所需添加的添加剂4激素和生长因子4有胰岛素、甲状腺素、生育酚、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等。4结合蛋白、血蛋白和铁传递蛋白等。4贴附伸展因子：纤维结合蛋白、软骨素、胶原和昆布氨酸等。4其它因子和元素：谷胱甘肽，锌、钴、钼、硒等。58医学资源 二、培养基的组成 1、氨基酸类：合成蛋白质，维持细胞生命活动不可缺少的物质。4所有合成培养基至少含有13种氨基酸，包括12种必需氨基酸（精氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸）和谷氨酰胺。59医学资源 2、维生素类：维持生命活动的低分子量活性物质，多数形成酶的辅基或辅酶。4有B类维生素和C类维生素，其中脂溶性维生素有4种以上（有VA、VD、VE、VK等），水溶性有15种以上（VB1、VB2、VB12、VC、生物素、叶酸、胆碱等）。60医学资源 3、无机盐类：用来调节培养液渗透压、缓冲pH值，参与细胞代谢。4主要有K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cl、SO42、PO43和HCO3等。4、糖类：维持细胞生命活动的能量来源。4常用的有葡萄糖、谷氨酰胺，还有用到核糖、脱氧核糖和醋酸钠等。61医学资源 5、缓冲系统4常用磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等，通CO2、提高氨基酸浓度等。6、微量元素4在低清或无血清培养液中，需补充铁、铜、锌、钴、钼、硒等微量元素。62医学资源 7、有机补充物4如核苷酸、三羧酸循环中间产物、丙酮酸盐及类脂化合物。8、其它4低血清或无血清培养液需添加各种生长因子和激素、结合蛋白、贴附和伸展因子以及必需脂肪酸等。63医学资源 三、培养基的配制 1、培养基配制的要求和原则4配法简单，准确和稳定。4避免污染。4便于贮存和使用。4对组成中易变化的成分应有控制措施。4在有极微细的悬浮颗粒不能充分溶解时，可通入CO2气助其溶解。64医学资源 2、基本配制法 （1）先制备各组分浓缩母液4在配制多成分溶液时，要确保所有组分都能完全溶解，最简单的方法是先制备各组分的浓缩母液，浓缩母液可在低pH情况下制备（pH3.55.0），有利于各组分的溶解。65医学资源 （2）将各组分浓缩液按比例混合、稀稀4经计算，分别从各组分浓缩母液量取所需的体积混合，通过0.2m微孔滤膜过滤、消毒，冷冻贮存。使用时，取一定体积的混合浓缩母液，用消毒的平衡盐溶液稀释。66医学资源4由于谷氨酰胺不稳定，需单独配制并冷冻保存，使用时配入培养液。4在培养液中需添加血清时，由于血清几乎是等渗的，可以直接加入。配制含10%血清的培养液：1000ml完全培养液加入111ml血清。4各种常用合成培养液大多已商品化。一般有3种商品供应形式：1倍工作液、10倍浓缩液和粉末状。67医学资源 3、培养液的选择4一般通过检查克隆生长和测定专一功能的表达来进行选择。4、抗生素的使用4通用的是青霉素和链霉素的合并使用。4青霉素的用量为50100U/每毫升培养液，链霉素的用量是50100Ug/每毫升培养液。4其它还用到二性霉素、制霉菌素等。68医学资源第六节 动物细胞培养方法与操作方式 一、培养方法4生产过程中要根据所采用细胞的特点，采用适宜的培养方法和操作方式，以获得最高的生产效率和最大的经济效益。69医学资源 1、悬浮培养（suspension culture）4使细胞悬浮于培养基中生长增殖的过程。4适用于非贴壁依赖性细胞，如来源于血液、淋巴组织的细胞和许多肿瘤细胞（杂交瘤细胞）以及某些转化细胞等。70医学资源 特点：4操作简便，培养条件较均一。4传质和传氧效果好，容易扩大规模培养。4较难采用灌流培养，细胞密度较低。71医学资源4在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关微生物发酵工程的经验。4小规模培养多采用转瓶或滚瓶培养，大规模培养多采用发酵罐式的细胞培养反应器。72医学资源 例：4英国Wellcome公司采用8000L的搅拌罐式生物反应器培养Namalwa细胞大量生产-干扰素。4英国的Celltech公司则用2000L的气升式生物反应器大量培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。73医学资源 2、贴壁培养（anchorage-dependent culture）4使细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。4该法适用于一切贴壁依赖性细胞（贴壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。74医学资源 特点：与悬浮培养相反4优点是适用的细胞种类广，较易采用灌流连续培养的方式使细胞达到高密度。4缺点是操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的贴附面积。4培养条件不均一，传质和传氧较差。75医学资源4贴壁培养与悬浮培养的另一个不同之处在于传代或放大培养时，常需要用酶将细胞从基质上消化下来。4常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶和木瓜蛋白酶等，主要是使细胞间质和一些促使细胞贴附的蛋白因子水解。76医学资源4贴壁培养生产疫苗的早期大多采用转瓶（roller bottle）大量培养原代鸡胚或肾细胞，扩大规模采用增加瓶数，劳动强度高，占用空间大。4另一种普遍采用的贴壁培养方法是固定床式生物反应器，但由于该反应器中传质和传氧常会出现梯度式不均一现象，故放大常受到限制。77医学资源 3、贴壁-悬浮培养（pseudo-suspension culture）4将贴壁和悬浮培养结合起来，优势互补，形成一种更理想的、更适于工业化大规模生产的培养方法。78医学资源 （1）微载体培养（microcarrier culture）41967年，荷兰的Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁依赖性细胞，微载体是直径为60250m的微珠。4采用微载体系统培养动物细胞，细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，把贴壁培养和悬浮培养融汇在一起，具有两种培养方法的优点。79医学资源 特点：4微载体比表面积大，提供了相当大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖，满足了大多数细胞的基本要求。4微载体体积小，比重轻，可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。80医学资源4由于微载体系统有许多优点，现已被广泛用于动物细胞的大量培养以生产各种生物制品。4现已开发出一大批商品化的微载体，有葡聚糖类、聚苯乙烯类和胶原类等。420世纪80年代中后期，又开发出多孔微载体，使比表面积高达2.8m2/g。81医学资源 （2）包埋和微囊培养4细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。4包埋（entrapment）：细胞和高聚物的单体混合，随着凝胶的形成，细胞嵌入到高聚物网络中。4细胞处于活性状态，可减少细胞渗漏，保护细胞抵抗剪切。82医学资源4微囊培养：将包埋细胞后的颗粒经液化处理成为微囊。可降低培养对细胞的剪切力，使细胞生长良好。4具体方法：将包埋细胞的凝胶颗粒，用另一种电荷相反的材料与之作用，使其在载体外形成一层聚合膜，然后再使膜内的载体液化而成。83医学资源 特点：4即适合贴壁细胞又适合非贴壁细胞。4保护细胞免受剪切力的影响。4可使产品浓缩在微囊内，有利于分离纯化。4适于多种生物反应器进行大规模培养。84医学资源（3）结团培养（aggregate culture）4用细胞本身作为基质，相互贴附结成细胞团，再用悬浮的方法进行培养。4为了加速细胞结团，可先在培养基内加入一些直径较小的微粒（20m）。4特点：操作简便，节省了用于微载体的成本。85医学资源 二、动物细胞培养的操作方式 1、分批式培养4指将细胞和培养液一次性装入反应器进行培养，培养结束后终止整个反应系统。4操作简便，容易掌握。4不能使细胞始终处于最优条件下，所以不是最好的操作方式。86医学资源 2、流加式培养（补料分批培养）4是指先将一定量的培养液装入反应器，接种后随着细胞的生长新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢，培养结束后终止整个反应系统。87医学资源 特点：4整个过程培养液体积逐渐增加。4可避免某种营养成分初始浓度过高而导致的底物抑制现象。4可防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽。88医学资源 3、半连续式培养：反复分批式培养或换液培养4是指分批培养结束后，取出部分反应液，重新补充新培养液再按分批式培养操作。特点：4可反复多次获得反应液。4节省细胞扩培和接种操作，特别适合微载体和包埋法固定化细胞的培养。89医学资源 4、连续培养：4是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内，新鲜培养液不断加入反应器，反应液不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。特点：4使反应系统长期维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。4可连续不断地收获产物。4适于对细胞的生理或代谢规律的研究；90医学资源 5、灌注连续培养4是指细胞种子和培养液加一起加入反应器后，新鲜培养液连续加入而反应液连续不断取出，但细胞留在反应器内的培养方法。4特点：4适合高密度细胞培养。4使有毒代谢废物和产物在反应器内停留时间大大缩短，有利于保持细胞活性。91医学资源 三、动物细胞大规模培养系统 （一）气升式培养系统 1、基本原理4气体从底部的喷射管进入反应器的中央导流管，使得中央导流管内外的液体密度产生差异，从而形成循环。92医学资源气升式生物反应器93医学资源 2、结构要求4有外循环式和内循环式。4内置的环形气体喷射器，其孔径要保证在控制的气速范围内产生气泡的直径为12mm。4气流速一般控制在0.010.06m3/m3min。4反应器高径比一般为3:112:1。94医学资源 3、气升式反应器性能特点4器内无机械搅拌部件，有利于设备的密封。产生的湍动温和且均匀，剪切力相当小，对细胞的损伤率较低。4直接喷射空气供氧，氧传递速率高。4液体循环量大，使细胞和养分能均匀地分布。95医学资源 （二）搅拌罐式培养系统4最经典和最早采用的细胞反应器，最先从微生物发酵灌借鉴而来，现大多已根据动物细胞固有的特点改造成更适于动物细胞培养。96医学资源搅拌式生物反应器97医学资源4罐体的高径比（H/D）一般采用11.5:1，较微生物发酵罐高径比（23:1）小；罐体要求罐底为圆形，以避免细胞和载体沉积在周边。4为降低剪切力，采用较大的倾斜式浆叶搅拌器或船舶推进式浆叶搅拌器，以及新开发的笼式通气搅拌器，搅拌速度一般在20100r/min。98医学资源4采用无气泡通气系统，防止气泡破裂时产生的应力损伤细胞。4如笼式通气系统或采用聚丙烯中空纤维膜、透气的硅胶管等供气。4常配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离，使细胞保留在反应器内的装置。4因此，可实现高密度、长时期地培养，以尽可能地提高反应器的生产效率。99医学资源4搅拌罐式生物反应器主要用于悬浮培养、微载体培养、微囊培养以及结团培养，是目前大规模培养动物细胞，用以生产各种药物的主要设备。100医学资源 （三）中空纤维式培养系统4该反应器是由数千根中空纤维束组成。101医学资源中空纤维式生物反应器102医学资源 1、中空纤维的结构4材料为聚砜或丙烯共聚物4其壁厚为50100m，为海绵状多孔性结构。4内层为超滤膜，可以截留相对分子量1万、5万、10万的物质。4内腔直径为200m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。103医学资源 2、工作原理4适合培养贴壁和非贴壁细胞。4内腔用以灌流充以氧气的培养基。4外腔接种细胞后，用以培养细胞并浓缩产物。4细胞可附着于纤维表面，也可渗入海绵状纤维壁，13周后可占据所有纤维壁空间，并在纤维表面堆积10多层，细胞密度可达108细胞/cm2。4此时，细胞的分裂增殖停止，但其代谢和分化功能可达数月之久。104医学资源 3、该反应器的特点 优点：4占地面积小。4产品产量、质量高。4生产成本低，仅为搅拌式生物反应器生产成本的1/6。105医学资源 缺点：4纤维束不能重复使用。4不耐高压蒸汽灭菌，需用环氧乙烷或其他消毒剂灭菌。4难以取样检测。106医学资源 （四）透析袋或膜式培养系统 1、工作原理4利用透析袋或不同孔径的超滤膜将反应系统分成2室或3室系统。107医学资源透析袋或膜式生物反应器108医学资源 （1）2室培养系统4培养基和小分子的有害代谢产物于一室可实现输入与输出。4细胞和代谢产物于一室，可实现细胞的高密度增长和产品的积累浓缩。109医学资源 （2）3室培养系统4培养基与小分子的有害代谢产物于一室可实现连续输入和输出。4细胞于一室，可实现高密度增殖，4大分子代谢产物于一室，可实现产品的分离、浓缩和收集。110医学资源42、特点4可实现高密度细胞培养（108/ml）。4可透析除去小分子有害代谢产物。4实现产品的分离和浓缩。111医学资源4（五）流化床和固定床式培养系统41、CF-IMMO多级流化床反应器4该类反应器专用于比重较大的多孔微球载体的培养。4微球由胶原制成，直径为500m，孔径约2040m，由于加入了钛微粒，因此，微球比重较大，1.61.8g/ml。112医学资源4当培养基从流化床下部以一定流速往上输入时，微球可在一定范围内悬浮旋转，从而保证了微球内细胞可获得充分的养分和氧。4特点：细胞密度和产品浓度可达很高水平，1108细胞/ml，产品94mg/L。113医学资源流化床式生物反应器114医学资源 2、CelliGen plus 固定床生物反应器4该反应器是将通气搅拌与固定床巧妙结合的一种新型生物反应器。115医学资源Celligen plus生物反应器116医学资源4罐体中部有一篮筐，内装填由50%聚酯纤维和50%聚丙烯制备的直径为6mm的小圆盘（称Fibra-cel），它有很大的比表面积，（120cm2/cm3）和空体积（90%），即可用于贴壁细胞附着，又有利于悬浮细胞被固定。117医学资源4其特殊设计的搅拌装置在搅拌过程中可使中央导流筒形成负压，迫使培养基循环不断流经填料，有利于营养物质和氧的传递。4使用该反应器可使杂交瘤细胞密度达108细胞/cm3，单克隆抗体的产量较固体微载体培养法提高了12倍。118医学资源4作业：1、解释：组织或细胞培养，细胞分化，悬浮培养，贴壁培养，半连续培养，连续培养，灌流连续培养。2、贴壁依赖型动物细胞离体培养有哪些形态类型，与其来源有何关系？3、简述动物细胞的生理特点。4、简述动物细胞的培养特性。5、简述动物细胞培养的环境条件。6、动物细胞离体培养的无血清培养基除基本成分外，还需添加哪些特殊成分？7、动物细胞离体培养有哪些培养方法？各有何特点？8、动物细胞培养的操作方式有哪些？119医学资源