生物工程实验资料课件

WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院实验一克隆载体重组子的抽提（重组质粒的提取、电泳鉴定及酶切鉴定）WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 一、实验目的1、掌握碱裂解法提取质粒DNA。2、掌握质粒的电泳鉴定3、学习质粒的酶切鉴定WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院1）碱裂解提取质粒原理：）碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体主要利用宿主染色体DNA与质粒与质粒DNA之间的结构和大小之间的结构和大小的差异进行分离提取的。的差异进行分离提取的。二、实验原理染色体DNA质粒DNA WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院二、实验原理1）碱裂解提取质粒原理：）碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体主要利用宿主染色体DNA与质粒与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离之间的结构和大小的差异进行分离提取的。提取的。收集菌收集菌体并用体并用GTEGTE悬浮悬浮NaOHNaOHSDSSDS裂解裂解变变性性二者都沉淀二者都沉淀加入加入KACKAC小分子小分子蛋白蛋白大分子不溶性大分子不溶性蛋白和残渣蛋白和残渣离心离心分离分离取上清取上清异丙醇沉淀异丙醇沉淀质粒质粒DNADNA苯酚苯酚-氯仿除蛋白氯仿除蛋白获得较纯净质粒获得较纯净质粒染色体染色体DNADNAWenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院二、实验原理2）琼脂糖凝胶电泳：）琼脂糖凝胶电泳：agarose gel电泳是分离鉴定和纯化电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的的DNA片段，在琼脂糖电泳片段，在琼脂糖电泳中，中，DNA迁移的速率不仅与其分子浪的对数值成反比，即分子量越大，迁移的速率不仅与其分子浪的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关。如质粒开环移动速率越慢，而且还与分子构型有关。如质粒开环DNA线性线性DNA共共价闭合环状价闭合环状DNA染色体DNA质粒DNA WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院3）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNA分子内部的特异序列，并在识分子内部的特异序列，并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自身身DNA，限制外源，限制外源DNA。4-6碱基对，具有回纹结构的碱基对，具有回纹结构的DNA片段；片段；水解水解DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键切割方式有切割方式有两种：黏性末端和平末端两种：黏性末端和平末端 切切4碱基，平均碱基，平均256bp出现一次切点，出现一次切点，切切6-8碱基时，每隔碱基时，每隔4-65kb出现一次切点出现一次切点二、实验原理WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤三、实验步骤1、质粒、质粒DNA的提取：的提取：在含抗生素、IPTG和X-gal的平板上随机挑出数个白色菌落，接种到5ml LB-AMP液体培养基中，37振荡培养过夜至对数生长期。取1.5ml对数生长期的菌体与EP管中，在台式离心机上8000rpm离心30秒收集菌体。弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。加100ul GTE缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置5分钟。加入200ul NaOH-SDS溶液，颠倒混匀10次，然后置冰浴5分钟。加入150ul预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5分钟。在4下于台式高速离心机12000rpm离心5分钟，并将上清移至另一支新的EP管中。加等体积的酚、氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新的EP管中，加等体积氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新的EP管中。加等体积异丙醇，置冰浴30min，12000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀用70%乙醇0.5ml洗一次，弃上清并真空干燥。用30ulTE溶解沉淀的DNA，加入2ug/ul Rnase溶液 2ul，3710min，置于4保存。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤2、琼脂糖凝胶电泳鉴定：、琼脂糖凝胶电泳鉴定：DNA电泳时间为电泳时间为30-60min 1）用电泳缓冲液制作）用电泳缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，冷却至的琼脂糖凝胶，冷却至60后加入终浓度0.5ug/ml的EB-紫外下的显色物质 2）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳缓冲液的液面高出凝胶。缓冲液的液面高出凝胶。3）取）取20ulPCR产物，加入产物，加入4ul 6 的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微量进样器小心加入样品孔。量进样器小心加入样品孔。4）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以5V/cm的电压电的电压电泳泳30-60min。5）电泳结束后，带手套取出凝胶置透明薄膜上，紫外灯下观察结果 WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤3、质粒的酶切鉴定：、质粒的酶切鉴定：1）质粒质粒DNA酶切反应体系酶切反应体系10 酶切酶切buffer 3 l质粒质粒DNA 10 lEcoR1（10u/l）1 lBamH1（10u/l）1 l ddH2O加至加至 20 l 37水浴保温水浴保温1-2h；72 水浴水浴15min终止反应。终止反应。3、电泳检测目的基因片段（电泳方法同前）、电泳检测目的基因片段（电泳方法同前）4、结果分析、结果分析WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院四、注意事项1、抽提质粒过程应尽量保持低温2、质粒制备过程中要尽量除去蛋白，否则会影响后面的酶切或连接3、沉淀DNA常用等体积的异丙醇，但易将盐也沉淀下来，可以用二倍体积的冰乙醇避免盐的沉淀。4、EB是强致癌物，注意操作安全；5、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA的大小不同而配制不同的浓度；6、DNA的纯度对酶切和连接很重要；五、思考题1、碱裂解法提取质粒的原理？WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院实验二目的基因的回收、连接反应（酶切体系的电泳鉴定、回收、纯化、与载体连接）WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 一、实验目的1、掌握目的片段的电泳鉴定。2、DNA的胶回收实验3、掌握克隆的原理WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院二、实验原理1）琼脂糖凝胶电泳：）琼脂糖凝胶电泳：agarose gel电泳是分离鉴定和纯化电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的的DNA片段，在琼脂糖电泳片段，在琼脂糖电泳中，中，DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关。移动速率越慢，而且还与分子构型有关。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 二、二、实验原理实验原理2）T4DNA连接酶连接酶:DNA连接酶是一种封闭连接酶是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助于链上的缺口的酶，借助于ATP或或NAD+水解提供的能量，催化水解提供的能量，催化DNA的的3-OH与与5的磷酸基团生成磷酸二酯健。的磷酸基团生成磷酸二酯健。T4DNA连接酶则连接双链连接酶则连接双链DNA分子的粘性末端或平端。分子的粘性末端或平端。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 二、二、实验原理实验原理3）TA克隆克隆;利用利用Taq酶在延伸过程中会在酶在延伸过程中会在DNA的末端加的末端加A的特性，使的特性，使PCR扩增产扩增产物和带物和带T尾的载体在连接酶的作用下连接起来。尾的载体在连接酶的作用下连接起来。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤1、琼脂糖凝胶电泳鉴定：、琼脂糖凝胶电泳鉴定：DNA电泳时间为电泳时间为30-60min 1）用电泳缓冲液制作）用电泳缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，冷却至的琼脂糖凝胶，冷却至60后加入终浓度0.5ug/ml的EB-紫外下的显色物质 2）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳缓冲液的液面高出凝胶。缓冲液的液面高出凝胶。3）取）取20ulPCR产物，加入产物，加入4ul 6 的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微量进样器小心加入样品孔。量进样器小心加入样品孔。4）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以5V/cm的电压电的电压电泳泳30-60min。5）电泳结束后，带手套取出凝胶置透明薄膜上，紫外灯下观察结果 WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤2、DNA的胶回收：的胶回收：切取琼脂糖凝胶上目的片段，称量胶的重量切取琼脂糖凝胶上目的片段，称量胶的重量1、按、按Binding Buffe：PCR产物产物=4：1比例加入比例加入Binding Buffer，混匀；置于，混匀；置于50-60 水浴10min，使胶彻底融化2、把混合液转移到收集管的、把混合液转移到收集管的UNIQ-10柱中，室温放置柱中，室温放置2min，8000rpm离心离心1min3、倒掉收集管中的废液，加、倒掉收集管中的废液，加500ul Wash Solution 到到UNIQ-10柱子中，柱子中，8000rpm室温离心室温离心1min4、重复步骤、重复步骤35、倒掉收集管中的废液，将、倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集柱放入同一收集管中，管中，12000rpm离心离心15s6、将、将UNIQ-10柱放入新的柱放入新的1.5ml离心管中，在柱子膜中离心管中，在柱子膜中央加央加30ul Elution Buffer或者水，室温或或者水，室温或37放置放置2min7、12000rpm室温离心室温离心1min，离心管中的液体即为回收，离心管中的液体即为回收的的DNA片段。片段。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤3、与载体连接、与载体连接PCR产物克隆试剂盒产物克隆试剂盒连接反应体系：连接反应体系：10 Ligation Buffer 1ulpUCm-T vector 1ul纯化的纯化的PCR产物产物 3uldd H2O 3ulT4 DNA Ligase 1ulFinal Volume 10ul16 连接过夜连接过夜WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院四、注意事项1、EB是强致癌物，注意操作安全；2、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA的大小不同而配制不同的浓度；3、DNA的纯度对酶切和连接很重要；五、思考题1、T4连接酶与大肠杆菌DNA连接酶作用上有何区别？WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院实验三感受态细胞的制备、转化、培养WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 一、实验目的1、掌握感受态细胞的制备。2、掌握DNA转化过程3、掌握蓝白斑筛选的原理WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院二、实验原理1）感受态细胞转化的原理：）感受态细胞转化的原理：受体细胞处于感受态即能从环境中吸取受体细胞处于感受态即能从环境中吸取DNA的一种生理状态。在冰浴条的一种生理状态。在冰浴条件先，用件先，用0.1M的的CaCl2溶液悬浮活化的溶液悬浮活化的E.coli DH5a菌，使其膜的通透性菌，使其膜的通透性增大而成为感受态细胞，当外源重组增大而成为感受态细胞，当外源重组DNA与感受态细胞混合后在冰浴中与感受态细胞混合后在冰浴中孵育后，外源重组质粒孵育后，外源重组质粒DNA就有可能进入感受态细胞内，并通过自我复就有可能进入感受态细胞内，并通过自我复制实现遗传信息转移，使宿主细胞出现新性状，即感受态细胞转化制实现遗传信息转移，使宿主细胞出现新性状，即感受态细胞转化WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院2）转化子蓝白斑筛选的原理）转化子蓝白斑筛选的原理:使用的载体带有大肠杆菌的使用的载体带有大肠杆菌的DNA短区段，含有短区段，含有-半乳糖苷半乳糖苷酶基因（酶基因（lacZ）的调控序列和）的调控序列和N端端146个氨基酸的编码信个氨基酸的编码信息，这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读息，这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，宿主细胞携带编码框，宿主细胞携带编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列，虽然端部分序列，虽然宿主和质粒的片段各自都没有酶活性，但能融为一体，形宿主和质粒的片段各自都没有酶活性，但能融为一体，形成具有活性的酶蛋白质成具有活性的酶蛋白质-半乳糖苷酶，这种互补现象叫半乳糖苷酶，这种互补现象叫 互补，在生色物质互补，在生色物质X-gal存在下形成蓝色菌落，但在外源存在下形成蓝色菌落，但在外源基因插入到多克隆位点后，破坏了质粒载体基因插入到多克隆位点后，破坏了质粒载体-半乳糖苷基半乳糖苷基因读框，不能编码因读框，不能编码-半乳糖苷酶，就形成白色菌落。半乳糖苷酶，就形成白色菌落。二、实验原理WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤1、感受态细胞的制备：、感受态细胞的制备：1）新活化的E.coli DH5菌平板挑取一单菌落，接种于3-5ml的LB液 体培养基中，37振荡培养12小时左右，至对数生长期。2.）上述菌液以1：50量接种到100ml液体培养基中。扩大培养至 A600nm=0.7（振荡培养2小时）3）培养液在水浴中冷却片刻后，取1.5ml菌液用冰预冷的1.5ml离心管 0-4 8000rpm离心5min收集菌体。4）去上清，用0.5ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰裕 放置，15-30分钟5）0-4 4000rpm离心10分钟收集菌体6）倾去上清，加入200ul预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞置于冰裕中3-5min后待用转化，或加15-20%的甘油置于-40保存 备用。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤2、重组、重组DNA的转化：的转化：1）上述上述Ep管中加入管中加入10ul连接反应混合物，轻轻连接反应混合物，轻轻 摇匀，摇匀，冰裕中放置冰裕中放置30分钟。分钟。2）再于再于42水浴中保温水浴中保温90秒，然后迅速在冰裕中冷却秒，然后迅速在冰裕中冷却3-5分钟。分钟。3）加入加入500ul LB培养液，摇匀后于培养液，摇匀后于37温裕温裕30-60分钟。分钟。4）将上述转化反应原液涂于含氨苄青霉素、将上述转化反应原液涂于含氨苄青霉素、IPTG和和X-Gal的的LB固体培养基中。固体培养基中。5）待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37培培养过夜，观察菌落。养过夜，观察菌落。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院四、注意事项1、转化实验必须在低温中进行，温度波动严重影响转化效率，所用的试剂均应冰浴，细菌保持在4以下；2、转化实验要做好对照，以检测感受态的细胞和重组质粒；以已知质粒转化感受态细胞做阳性对照；以TE缓冲也转化感受态细胞做阴性对照五、思考题1、重组DNA导入原核细胞有哪些方法？2、蓝白斑筛选的原理？WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院实验四 pET-28a-SOD表达重组质粒的鉴定（重组质粒的提取、酶切及电泳鉴定）WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 一、实验目的1、学习掌握重组子的筛选与验证2、掌握碱裂解法提取质粒DNA。3、掌握质粒的酶切电泳鉴定WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院1）碱裂解提取质粒原理：）碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体主要利用宿主染色体DNA与质粒与质粒DNA之间的结构和大小之间的结构和大小的差异进行分离提取的。的差异进行分离提取的。二、实验原理WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院二、实验原理1）碱裂解提取质粒原理：）碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体主要利用宿主染色体DNA与质粒与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离之间的结构和大小的差异进行分离提取的。提取的。收集菌收集菌体并用体并用GTEGTE悬浮悬浮NaOHNaOHSDSSDS裂解裂解变变性性二者都沉淀二者都沉淀加入加入KACKAC小分子小分子蛋白蛋白大分子不溶性大分子不溶性蛋白和残渣蛋白和残渣离心离心分离分离取上清取上清异丙醇沉淀异丙醇沉淀质粒质粒DNADNA苯酚苯酚-氯仿除蛋白氯仿除蛋白获得较纯净质粒获得较纯净质粒染色体染色体DNADNAWenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院二、实验原理2）琼脂糖凝胶电泳：）琼脂糖凝胶电泳：agarose gel电泳是分离鉴定和纯化电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的的DNA片段，在琼脂糖电泳片段，在琼脂糖电泳中，中，DNA迁移的速率不仅与其分子浪的对数值成反比，即分子量越大，迁移的速率不仅与其分子浪的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关。如质粒开环移动速率越慢，而且还与分子构型有关。如质粒开环DNA线性线性DNA共共价闭合环状价闭合环状DNAWenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院3）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNA分子内部的特异序列，并在识分子内部的特异序列，并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自身身DNA，限制外源，限制外源DNA。4-6碱基对，具有回纹结构的碱基对，具有回纹结构的DNA片段；片段；水解水解DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键切割方式有切割方式有两种：黏性末端和平末端两种：黏性末端和平末端 切切4碱基，平均碱基，平均256bp出现一次切点，出现一次切点，切切6-8碱基时，每隔碱基时，每隔4-65kb出现一次切点出现一次切点二、实验原理WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院实验步骤-PET-28a-Mn-SOD表达重组质粒的鉴定1、用灭菌牙签分别挑取5个菌落接种到2ml LB-Km（50ug/ml）液体培养基中，37振荡培养过夜；2、用碱裂解法提取质粒；3、用限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果：切出600bp Mn-SOD基因DNA片段的为阳性克隆。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院流流 程程 图图WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤三、实验步骤一、质粒一、质粒DNA的提取：的提取：1.在含抗生素、在含抗生素、IPTG和和X-gal的平板上随机挑出数个白色菌落，接种到的平板上随机挑出数个白色菌落，接种到5ml LB-AMP液体培养基中，液体培养基中，37振荡培养过夜至对数生长期。振荡培养过夜至对数生长期。2.取取1.5ml对数生长期的菌体与对数生长期的菌体与EP管中，在台式离心机上管中，在台式离心机上8000rpm离心离心30秒收集菌体。秒收集菌体。3.弃上清，将弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。管倒置在吸水纸上，吸干溶液。4.加加100ul GTE缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置置5分钟。分钟。5.加入加入200ul NaOH-SDS溶液，颠倒混匀溶液，颠倒混匀10次，然后置冰浴次，然后置冰浴5分钟。分钟。6.加入加入150ul预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5分钟。分钟。7.在在4下于台式高速离心机下于台式高速离心机12000rpm离心离心5分钟，并将上清移至另一分钟，并将上清移至另一支新的支新的EP管中。管中。加等体积的酚、氯仿抽提一次，加等体积的酚、氯仿抽提一次，12000rpm离心离心5分钟，取上层水相至分钟，取上层水相至另一支新的另一支新的EP管中，加等体积氯仿抽提一次，管中，加等体积氯仿抽提一次，12000rpm离心离心5分钟，分钟，取上层水相至另一支新的取上层水相至另一支新的EP管中。管中。8.加加0.6倍体积异丙醇，置冰浴倍体积异丙醇，置冰浴30min，12000rpm离心离心10分钟，弃上清。分钟，弃上清。9.沉淀用沉淀用70%乙醇乙醇0.5ml洗一次，弃上清并真空干燥。用洗一次，弃上清并真空干燥。用30ulTE（已加入（已加入2ug/ul Rnase）溶液溶解沉淀的）溶液溶解沉淀的DNA，3710min，置于，置于4保存。保存。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤3、质粒的酶切鉴定：、质粒的酶切鉴定：1）质粒质粒DNA酶切反应体系酶切反应体系10 酶切酶切buffer 3 l质粒质粒DNA 10 lEcoR1（10u/l）1 lBamH1（10u/l）1 l ddH2O加至加至 20 l 37水浴保温水浴保温1-2h；72 水浴水浴15min终止反应。终止反应。3、电泳检测目的基因片段（电泳方法同前）、电泳检测目的基因片段（电泳方法同前）4、结果分析、结果分析WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验步骤2、琼脂糖凝胶电泳鉴定：、琼脂糖凝胶电泳鉴定：DNA电泳时间为电泳时间为30-60min 1）用电泳缓冲液制作）用电泳缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，冷却至的琼脂糖凝胶，冷却至60后加入终浓度0.5ug/ml的EB-紫外下的显色物质 2）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳缓冲液的液面高出凝胶。缓冲液的液面高出凝胶。3）取）取20ulPCR产物，加入产物，加入4ul 6 的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微量进样器小心加入样品孔。量进样器小心加入样品孔。4）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以5V/cm的电压电的电压电泳泳30-60min。5）电泳结束后，带手套取出凝胶置透明薄膜上，紫外灯下观察结果 WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院四、注意事项1、抽提质粒过程应尽量保持低温2、质粒制备过程中要尽量除去蛋白，否则会影响后面的酶切或连接3、沉淀DNA常用等体积的异丙醇，但易将盐也沉淀下来，可以用二倍体积的冰乙醇避免盐的沉淀。4、EB是强致癌物，注意操作安全；5、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA的大小不同而配制不同的浓度；6、DNA的纯度对酶切和连接很重要；五、思考题无WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院实验四(续)pET-28a-SOD表达重组质粒的鉴定（重组质粒的提取、酶切及电泳鉴定）WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院1 1、菌落、菌落PCRPCR扩增目的片段扩增目的片段-初步鉴初步鉴定表达转化子的正确定表达转化子的正确2 2、电泳鉴定目的条带的存在否？、电泳鉴定目的条带的存在否？3 3、验证正确后用于诱导表达目的蛋、验证正确后用于诱导表达目的蛋白白WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院实验六 重组蛋白的诱导WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 一、实验目的1、学习目的蛋白诱导表达的原理。2、掌握接种、培养定时取样、蛋白的提 取分离纯化3、掌握目的蛋白的分离鉴定方法WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院二、实验原理1 1）诱导表达的原理：）诱导表达的原理：pETpET系统也是在大肠杆菌系统也是在大肠杆菌E.coliE.coli中克隆表达重组蛋白功能最强中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。目的基因的表达受噬菌体大的系统。目的基因的表达受噬菌体T7T7强转录及翻译信号的调控。表达系统是以强转录及翻译信号的调控。表达系统是以大肠杆菌大肠杆菌laclac操纵子调控机理为基础设计的，操纵子调控机理为基础设计的，laclac操纵子的转录受正调控因子操纵子的转录受正调控因子CAPCAP和负调控因子和负调控因子lacIlacI的调控，在无诱导物情况下，的调控，在无诱导物情况下，lacIlacI形成四聚体阻遏蛋白，与形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始，在启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始，在IPTG(IPTG(-D-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷)等乳糖类似物是等乳糖类似物是laclac操纵子的诱导物，它与阻遏蛋白结合使之改变构象，导致其操纵子的诱导物，它与阻遏蛋白结合使之改变构象，导致其与操纵基因的结合而解离出来。与操纵基因的结合而解离出来。LacLac操纵子的转录因此激活。操纵子的转录因此激活。LacLac操纵子具有可操纵子具有可诱导调控基因转录的性质，因此用来构建到表达载体中。诱导调控基因转录的性质，因此用来构建到表达载体中。PET28PET28就有就有lacIlacI基因，基因，可用可用IPTGIPTG诱导。诱导。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院三、实验方法三、实验方法一、一、PET-28a-Mn-SOD表达重组质粒的诱导表达表达重组质粒的诱导表达（1）用灭菌牙签分别挑取阳性克隆和1个含PET-28a表达质粒菌落接种到2ml LB-Km（50ug/ml）液体培养基中，37振荡培养过夜；（2）按1：10接种到3ml LB-Km（50ug/ml）液体培养基中，37 250rpm振荡培养2小时（OD值约为0.2-0.6）；（3）于各管中加100mM IPTG 30ul（终浓度为1mM），37 250rpm振荡培养，分别在1小时、2小时和3小时各取1ml菌液，6000rpm离心2分钟收集菌体，用2ml PBS重悬菌体，加10mg/ml溶菌酶至终浓度为0.3mg/ml，冰上放置30分钟，加入10%TritonX-100（终浓度为0.1%），混匀，超声（200W 3秒,间隔3秒，60次）破碎细菌至细菌悬液变的清亮透明，12000rpm离心10分钟，收集上清和沉淀待用。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院（4）取上清和沉淀分别加等体积2蛋白上样液，沸水浴5分钟变性，SDS-PAGE（12%的分离胶）电泳，考马斯亮蓝染色分析，见图2。（5）结果：发现分子量约为30 KD，IPTG诱导3小时时重组蛋白表达量最高，约占总蛋白的50%，将3号菌种接种到另一含卡那霉素的LB固体培养基上并用15%甘油保种。WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院WenZhouMedicalCollegeWenZhouMedicalCollege检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院参考内容 5SDS上样缓冲液上样缓冲液10ml1.0mol/L TrisHCl（pH6.8）0.6 ml 2-巯基乙醇 0.5 ml10%SDS 2.0 ml 1%溴酚蓝 1.0 ml50%甘油 5.0 ml DTT 300 mM 去离子水 0.9 ml（混匀后，分装于1.5 m