生物大分子的分离与制备-课件

生物大分子的分离与制备引言v生物化学研究的三个主要发展时期:叙述生物化学时期(17701903年)。又称为静态或形态生物化学,研究内容以分析生物体内物质的化学组成、性质和含量为主。动态生物化学时期(19031950年)。又称为生理化学。主要研究生物体内组成物质的化学变化及相互转变。功能或分子生物化学时期(1950年至今)。研究生命的本质和神秘:运动、神经、内分泌、生长、发育、繁殖等的分子机理。2024/7/82生物化学研究技术方法v生物化学研究的方法:观察:生命现象分离:未知蛋白组分,新基因片段,新的次生代谢物。(抽提、过滤、离心、色谱)分析:结构与性质(序列分析,X-射线晶体衍射,核磁共振,波谱,质谱等)功能(实验设计与方法)代谢及其细胞调控改造及利用2024/7/83分离生命现象生化组分分析1、结构与性质2、功能3、代谢及其细胞调控改造利用生物化学研究技术方法v经典的研究步骤:分离生化组分(细胞器和生物分子);分析生化组分的结构;分析生化组分的功能和代谢(合成与分解)及其相互作用。2024/7/84生物化学研究技术方法生物化学研究技术:分离技术:沉淀、吸附、膜分离(过滤、透析等)、离心、层析、电泳等;分析检测技术:电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、分子标记等。分子生物学研究技术:基因重组、分子杂交、PCR与反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。2024/7/85生物化学研究技术方法研究技术的选择:？实验的目的:定性分析与定量分析;分离或分析物的物理化学性质;研究技术的精确性、准确性及检测限;研究成本;潜在的风险与危害。2024/7/86生物分子的结构与功能分析:1、蛋白质结构分析2、酶活力检测3、蛋白质组学分析4、DNA序列分析5、聚合酶链反应(PCR)6、分子杂交7、基因克隆8、基因组文库构建9、cDNA文库构建10、文库筛选11、报告基因检测12、基因芯片13、基因敲除14、RNAi15、转基因动物生物大分子相互作用分析:生化反应过程实际上是生物分子间的相互作用过程。生物大分子间的相互作用是它们的功能基础。随着分子生物学研究的进展,建立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技术。生物大分子相互作用分析技术:1.凝胶阻滞分析法2.DNA酶足纹分析法3.蛋白质芯片4.酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质第一章 生物大分子的分离纯化蛋白质(酶)、核酸存在于一切生物体中,是特别重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者,担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能;核酸是遗传信息的携带者,在生物体中指导各种蛋白质的合成。生物材料组成特别复杂。其中包括数百种甚至数生物材料组成特别复杂。其中包括数百种甚至数千种化合物千种化合物,同时在分离过程中同时在分离过程中,这些化合物仍在发这些化合物仍在发生代谢变化生代谢变化,如蛋白质和核酸的水解。如蛋白质和核酸的水解。l l 有些化合物的含量极微有些化合物的含量极微,如激素等。如激素等。l l 许多具有生物活性的物质一旦离开活体许多具有生物活性的物质一旦离开活体,特别特别易变变性破坏易变变性破坏,因此常选用比较温和的条件进行制因此常选用比较温和的条件进行制备。备。l l 生化分离制备几乎都在生化分离制备几乎都在溶液溶液中进行中进行,影响因素特影响因素特别多别多,实验方法经验性较强。实验方法经验性较强。生物化学分离方法与一般的化学分离方法相比生物化学分离方法与一般的化学分离方法相比,有下列几个有下列几个特点特点:生物大分子的制备通常可按以下步骤进行:确定要制备的生物大分子的目的和要求,是进行科研、开发依然要发现新的物质。建立相应的可靠的分析测定方法,这是制备生物大分子的关键。通过文献调研和预备性实验,掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。生物材料的破碎和预处理。分离纯化方案的选择和探究,这是最困难的过程。生物大分子制备物的均一性(即纯度)的鉴定,要求达到一维电泳一条带,二维电泳一个点,或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。产物的浓缩,干燥和保存。生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤盐析(硫酸铵盐析)等点电沉淀有机溶剂沉淀离心前处理 粗分级 细分级 材料选择与处理细胞破碎(机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理)生物组织 提取液 粗产品结晶 分子大小 溶解度 电荷性质 吸附性质 生物亲和力依据原理注意事项基本原则:防止生物分子变性、降解 1、控制适当的pH 2、控制低温 3、注意提取过程中的溶液环境 4、防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基第一节:生物材料的选择选择生物材料的原则:有效成分含量多,稳定性好;来源丰富,保持新鲜;提取方法简单;有综合利用价值等。生物材料一般能够分为两大类:天然生物材料和人工生物材料。生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的生物个体、器官或组织。人工生物材料又分为三种:1、新品种材料2、组织培养材料3、生物产品与生物制品材料要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有:p在水和各种有机溶剂中的溶解性。p在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。p固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。p各种物理性质:如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。p其他化学性质:如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。p对其他生物分子的特别亲和力。制备生物大分子的分离纯化方法多种多样,主要是利用它们之间特异性的差异,如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。1、动物组织:选材:必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。单酯酶,从含量看,尽管在胰脏、肝脏和脾脏中较丰如磷酸富,然而因其与磷酸二酯酶共存,进行提纯时,这两种酶特别难分开。因此实践中常选用含磷酸单酯酶少,但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。脱脂:脏器中含量较高的脂肪,容易氧化酸败,导致原料变质影响纯度操作和制品的率。常用的脱脂方法有:人工剥去脏器外的脂肪组织;浸泡在脂溶性的有机溶剂(丙酮,乙醚)中脱脂;采纳快速加热(50左右),快速冷却的方法,使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。1、动物组织保存:对预处理好的材料,若不马上进行实验,应冷冻保存。a、冰冻:剥去脂肪和筋皮等结缔组织,短期保存:10的冰箱内;长期保存:70低温冰箱内。b、干燥:关于像脑垂体一类小组织,可置丙酮液中脱水,干燥后磨粉储存备用;关于含耐高温有效成分(如:肝素)的肠粘膜,可在沸水蒸煮处理,烘干后能长期保存。冰箱的除霜循环,估计对細胞造成伤害,要特別小心。解冻時要越快越好,但幸免局部過熱。2、植物材料:选材:注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化特别大,另外与季节性关系紧密。种子须泡胀或粉碎才可使用。含油脂较多的也要进行脱脂处理。a a、提取核DNADNA:选用黄化苗(生长710天小麦,水稻),防止叶绿体DNA的干扰 b b、提取RNARNA:依照实验目的选用生长幼嫩组织为好。保存:冷冻采样后尽快放于420冰箱内。DNA,RNA 采样后,N2速冻,至70冰箱。对RNA样,如不马上使用,冷冻保存尤为重要。3、微生物为制备生命大分子物质的主要材料之一。用离心法收集到的上清液,可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分;可置低温下短时间贮存。收集到的菌体,经破细胞处理后则可从中提取其他有效成分;或制成冻干粉,在4保存(数月可不能变质)。第二节 细胞的破碎胞外物质直截了当提取胞内物质破坏细胞壁或细胞膜后提取细胞破碎的主要方法:机械破碎 溶胀和自溶 化学处理:如丙酮、氯仿、甲苯、SDS等 生物酶降解研 磨细胞破碎技术机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎有机溶剂:表面活性剂:酸碱酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力,使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用,使组织、细胞的外层结构破坏,而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,使细胞外层结构受到破坏,而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理1、机械破碎:(1)研磨法(小量样品)剪碎的动物组织如鼠肝、兔肝等置研钵中,用研磨棒研碎。为了提高研磨效果,可加入一定量的石英砂。用匀浆器处理,也能破碎动物细胞。此法较温和,适宜实验室使用。但加石英砂时,要注意其对有效成分的吸附作用。如系大规模生产时,可用电动研磨法。细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法。(2)组织捣碎器法:用捣碎器(转速8000-10000r/m)处理30-45s可将植物和动物细胞完全破碎。如用其破碎酵母菌和细菌的细胞时,须加入石英砂才有效。在捣碎期间必须保持低温,捣碎的时间不易太长,以防温度升高引起有效成分变性。现在多用细胞破碎仪。(大量样品)效果:作用强烈,但活性物质易受破坏 操作:低温、短时。(3)超声波法:借助声波的震动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。多用于微生物细胞的破碎,一般输出功率100-200W,破碎时间315min。假如在细胞悬浮液中加石英砂则可缩短时间。为了防止电器长时间运转产生过多的热量,常采纳间歇处理和降低温度的方法进行。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。超声波破碎的机理:一般认为在超声波作用下液体发生空化作用(cavitation),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力,使细胞内液体发生流动,从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热,需在冰水或外部冷却的容器中进行。JY92-II D超声波细胞粉碎机超声波破碎的适用范围超声波破碎是特别强烈的破碎方法,适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎,G-细菌比G+细菌易破碎,对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻,因此不易放大,但在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用。(4)压榨法:是一种温和、完全破碎细胞的方法。用30MPa左右的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔(细胞直径的孔),致使其被挤破、压碎。(5)冻融法:将细胞置低温下冰冻一定时间,然后取出置室温下(或40左右)迅速融化。如此反复冻融多次,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时,发生溶胀、破碎。2 非机械破碎非机械方法特别多1)酶解2)化学法溶胞3)物理法渗透压冲击冻结和融化干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广。四、酶解法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受到破坏后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1)外加酶法常用的溶酶溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等外加酶法酶解法的特点是专一性强,因此在选择酶系统时,必须依照细胞的结构和化学组成来选择。l溶菌酶(lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4-1,4糖苷键,因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶,特别快就产生溶壁现象。但关于革兰氏阴性菌,单独采纳溶菌酶无效果,必须与螯合剂EDTAEDTA一起使用。l放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌,以肽聚糖为主要成分,因此也能采纳溶菌酶。l酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等,常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。l植物细胞壁的主要成分是纤维素,常采纳纤维素酶和半纤维素酶裂解。有时采纳几种酶的混合物会产生更好的效果,加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采纳酶法破碎时,先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构,使二者溶解,再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层,最后只剩下原生质体,这时若缓冲液的渗透压变化,则细胞膜破裂,释出胞内产物。酶解-自溶作用 l自溶作用是酶解的另一种方法,利用生物体自身 产生的酶来溶胞,而不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中,大多数都能产生一种能水 解细胞壁上聚合物的酶,以便生长过程接着下去。l自溶作用:改变其生长环境(温度、缓冲液),),能够诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶,以达到自溶目的。l缺点是:易引起所需蛋白质的变性,自溶后细胞悬浮液粘度增大,过滤速度下降。某些化学试剂,如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等,能够改变细胞壁或膜的通透性(渗透性),从而使胞内物质有选择地渗透出来。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。(2 2)化学处理法(Chemical permeationChemical permeation)酸处理能够使蛋白质水解成氨基酸,通常采纳6mol/L HCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。特点:成本低,反应激烈,不具选择性。1)酸、碱处理法细胞破碎常用的表面活性剂:十二烷基硫酸钠(SDSSDS,阴离子型););非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温(TweenTween)等 对疏水性物质具有特别强的亲和力,能结合并溶解磷脂,破坏内膜的磷脂双分子层,使某些胞内物质释放出来。2 2)表面活性剂 不管表面活性剂是阴离子、阳离子依然非离子型,都是两性的,既能和水作用也能和脂作用,能与细胞壁上的脂蛋白结合,形成微泡,使膜的通透性增加或溶解 能分解细胞壁中的磷脂,使细胞结构破坏,胞内物质被释放出来。有机溶剂可采纳丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 3 3)有机溶剂4 4)EDTAEDTA螯合剂 处理G-G-细菌,对细胞壁外层有破坏作用。G-G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子CaCa2+2+或MgMg2+2+结合脂多糖和蛋白质来维持,一旦EDTAEDTA将CaCa2+2+或MgMg2+2+螯合,大量的脂多糖分子将脱落,使细胞壁外层膜出现洞穴。u通用性差;u时间长,效率低,一般胞内物质释放率不超过50%50%;u有些化学试剂有毒。u化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难,并影响最终产物纯度化学处理法特点:缺点l对产物释放有一定的选择性,可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过,而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内;l细胞外形完整,碎片少,浆液粘度低,易于固液分离和进一步提取。优点(3 3)物理法u渗透压冲击法u冻结-融化法u干燥法选择破碎方法的依据:u细胞处理量;u细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度);u目标产物对破碎条件的敏感性;u破碎程度;u目标产物的选择性释放破碎技术的研究方向多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母,然后高压匀浆,95MPa95MPa压力下匀浆4 4次,总破碎率接近100%100%。而单独采纳高压匀浆法,同样条件下破碎率只有32%32%。有机溶剂与冻融法、干燥法结合第三节生物大分子的提取提取是在分离纯化前期,将样品研磨,把被破碎的细胞置于一定的溶剂(提取液)中,使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。提取液应具备的条件:对有效成分溶解度大,破坏作用小;对杂质溶解度小或不溶解;来源广泛、价格低廉、操作安全等。溶剂提取法原理:利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来。影响溶剂提取效率的因素(影响溶解度的的因素)1、溶剂的性质:(依照相似相溶原理)2、离子强度:离子强度是影响物质溶解度的主要因素,但离子强度对不同物质溶解度的影响不同,如高离子强度下DNA-核蛋白溶解度增加,而低离子强度下RNA-核蛋白溶解度增加;绝大多数蛋白质和酶,在稀盐溶液中溶解度增加(盐溶)。影响溶剂提取效率的因素(影响溶解度的的因素)3、PH值:溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态,离子状态的物质,不能是阳离子依然阴离子都易溶于水,而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。4、温度:温度的升高能够增加物质的溶解度。5、去垢剂:去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质,能够分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等,如SDS,Tween20,TritonX-100。一、分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸,研究其结构与功能,关于了解生命活动的规律,阐明生命现象的本质有重大意义。工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等工业,需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要二、分离纯化的要求1 1、纯度:主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构,一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂,都要求均一;工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂,达到一定纯度即可,不要求均一。2 2、活性:要求大分子保持天然构象状态,有高度的生物活性。3 3、收率:希望收率越高越好,但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多,损失越大。三、分离纯化的一般程序1、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取(有时还需要进行细胞器的分离)3、分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离其中前两个时期为生物大分子分离纯化的前处理。水溶液提取:蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好,溶解度大,是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是:1)盐浓度(即离子强度):离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响,有些物质,如DNA-蛋白复合物,在高离子强度下溶解度增加。绝大多数蛋白质和酶,在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度,如在纯水中加入少量中性盐,蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加,称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动,减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力,增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。为了提高提取效率,有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低,增加离子强度(如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4)能够增加溶液的极性。2)pH值:蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量幸免,一般控制在pH=68范围内,提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内,通常选择偏离等电点的两侧。3)温度:为防止变性和降解,制备具有活性的蛋白质和酶,提取时一般在05的低温操作。4)防止蛋白酶或核酸酶的降解作用:加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性,防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。5)搅拌与氧化:搅拌能促使被提取物的溶解,一般采纳温和搅拌为宜,速度太快容易产生大量泡沫,增大了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基,有些巯基常常是活性部位的必需基团,若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键,导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。1 1、蛋白质(酶)的提取水溶液提取法:通常采纳类似生理条件下的缓冲液,如20-50m mol/L20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7pH7、0-70-7、5 5)或0 0、1mol/L Tris-HCl1mol/L Tris-HCl(pH7pH7、5-85-8、0 0)缓冲液作提取液。有机溶剂提取法:如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。五、提取2、DNA提取:原则:保持核酸一级结构的完整性。去除杂质,保证核酸足够纯。步骤:破膜释放出目的核酸分子。分离通过酶、有机溶剂、调节pH值、离心等手段得到粗制品。纯化进一步去除杂质。浓度和质量检测:分光光度法、Agarose凝胶电泳。2 2、核酸的提取DNADNA的提取:一般是利用DNA-DNA-核蛋白(DNPDNP)易溶于1mol/L NaCl1mol/L NaCl溶液而不溶于0 0、14mol/L NaCl14mol/L NaCl溶液。RNARNA的提取:利用RNA-RNA-核蛋白(RNPRNP)易溶于0 0、14mol/L NaCl14mol/L NaCl溶液而不溶于1mol/L NaCl1mol/L NaCl溶液的性质,先提取得到RNPRNP。提取得到DNPDNP或RNPRNP后,再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。细胞的破碎细胞壁?去除蛋白质核酸的沉淀研磨破碎CTAB、SDS苯酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)异丙醇、乙醇三大步骤去污剂法或有机溶剂法F去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合,从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液,使SDS-蛋白质复合物沉淀,并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。F有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂,当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液,蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性,与核酸分开。离心后可分为两相,一般上层为含核酸的水相,下层为有机相,交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇讲核酸沉淀离心收集即可。蛋白质的去除 RNA提取:哺乳动物细胞总RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核内小分子RNA(10%-15%)、mRNA(1%-5%)组成,其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。注意事项:使用RNA酶抑制剂;防止污染。第四节:生物大分子的浓缩p沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂,使有效的成分变为沉淀,经过离心或过滤收集的沉淀物,加少量缓冲液溶解后,在经离心出去不溶物,获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。p盐析法:有机溶剂沉淀法;等电点沉淀法;非离子多聚体沉淀法;生成盐复合物沉淀法;热变性沉淀法;酸碱变性沉淀法等。p吸附法:将干葡聚糖凝胶加入提取液中,由于凝胶吸水,提取液的体积可缩小三倍左右。p超过滤法:把提取液装入过滤装置,在空气或氮气的压力下,使小分子物质通过半透膜,大分子物质留在膜内。p透析浓缩法p减压蒸馏浓缩法:将提取液装入减压蒸馏装置中,在减压真空状态下进行蒸馏。p冰冻干燥法在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是:中性盐沉淀(盐析法):多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀:多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。选择性沉淀(热变性沉淀和酸碱变性沉淀):多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。选择适宜的溶剂,使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离,这种方法称为选择性溶剂沉淀法。在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇,振荡一段时间,使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去,核酸仍留在水溶液中。在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下,核酸的苯酚水溶液提取液中,DNA和RNA都进入水层,而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。在DNA与RNA的混合液中,用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。选择性溶剂沉淀法:一、硫酸氨盐析法原理:依照蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升(盐溶),但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。l 不同的蛋白质分子,由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同,其水化层厚度不同,故盐析所需要的盐浓度也不一样,因此调节蛋白质的中盐浓度,能够使不同的蛋白质分别沉淀。如:血清球蛋白清蛋白(NH(NH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和析出析出分段盐析 中性盐沉淀蛋白质的基本原理蛋白质和酶均易溶于水,因为该分子的COOH、NH2和OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒的亲水胶体,削弱了蛋白质分子之间的作用力,蛋白质分子表面极性基团越多,水化层越厚,蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大,因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个:即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,因此加入大量中性盐后,夺走了水分子,破坏了水膜,暴露出疏水区域,同时又中和了电荷,破坏了亲水胶体,蛋白质分子即形成沉淀。中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4,因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点:u 溶解度大:尤其是在低温时仍有相当高的溶解度,这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定,因而盐析操作也要求在低温下(04)进行。u分离效果好:有的提取液加入适量硫酸铵盐析,一步就能够除去75的杂蛋白,纯度提高了四倍。u 不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用23mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可达数年之久。u 价格廉价,废液不污染环境。影响蛋白质盐析的因素(主要的4个)蛋白质浓度对盐析的影响:蛋白质浓度过大,盐析时发生共沉现象,分离效果不行;蛋白质浓度太稀,耗盐量过大,蛋白质回收率也低。一般为2、5%-3、0%的蛋白质浓度较适中。离子强度和离子类型对盐析的影响:离子强度越大,蛋白质的溶解度越低,越容易产生盐析现象;离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强,离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。影响蛋白质盐析的因素(主要的4个)对盐析的影响:蛋白质所带净电荷越多,溶解度越大;在净电荷为零时,溶解度最低。一般将值调到蛋白质等电点附近,如此有利于盐析。温度对盐析的影响:在低离子强度或水中在一定范围内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加;但在高盐溶液中,温度的升高有时反而下降。一般情况下在-操作。三、透析浓缩法p原理:天然或人工半透膜只允许小分子通过而阻碍大分子通过。当膜的两侧存在小分子浓度梯度差时,小分子就从高浓度一侧向低浓度一侧扩散,直至达到平衡,假如能不断去除扩散出来的小分子,从而达到分离纯化的目的。p影响透析的因素1、半透膜的通透性:半透膜的通透性取决于膜孔径的大小,在能阻碍大分子扩散的前提下,孔径越大,透析速度越快。2、透析外液的更换3、温度:温度越高,透析速度越快。4、压力:用跨膜的压力梯度可加速大分子的分离速度。5、溶剂四、蛋白质(酶)的分离纯化蛋白质分离纯化的方法特别多,主要是依照蛋白分子之间特异性的差异,如分子大小,溶解度,电荷等建立起来的。性质 方法v分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤v 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀v电荷 电泳、离子交换层析v吸附性质 吸附层析(羟基磷灰石层析、疏水作用层析)v对配体分子 亲和层析 的生物亲和力1、盐析法盐离子与水分子作用,原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水,从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用,破坏蛋白质分子表面的水化层,暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合,形成沉淀。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是:等电点沉淀:用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀,但此法单独应用较少,多与其他方法结合使用。有机聚合物沉淀:是发展较快的一种新方法,主 要 使 用 PEG聚 乙 二 醇(Polyethyeneglycol)作为沉淀剂。盐析时的注意事项:(1)添加的硫酸铵的纯度要高,添加后,要放30min以上使其充分溶解,且要不断搅拌,防止局部过浓,发生共沉淀;(2)同一溶液中欲分离几种蛋白质时,可采纳分段盐析的方法。盐析通常与等电点沉淀法配合使用。(3)选择好温度,一般在室温下进行;(4)蛋白浓度不易过高,一般2530g/L;低浓度盐析,可用离心分离;高浓度盐析(7080),用过滤(因为粘度大,离心操作慢);盐析沉淀得到的蛋白质含量较高,纯品需经脱盐处理,如透析,凝胶过滤等。四、等电点沉淀在溶液pH值等于蛋白质等电点时,蛋白质的溶解度最小,容易互相吸引,聚合成沉淀;加入盐离子会破坏这些吸引力,使分子散开,溶入水中。五、有机溶剂沉淀降低水溶液的介电常数,增加蛋白质不同电荷之间的静电引力,使蛋白质产生沉淀;有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩,导致蛋白质脱水,蛋白质间的疏水作用增强,从而产生沉淀。有机溶剂沉淀法的优点是:分辨能力比盐析法高,即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐,过滤比较容易(如有必要,可用透析袋脱有机溶剂)。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作需在低温下进行。几种主要沉淀方法比较第五节 纯度鉴定生物大分子经过分离提纯,最后还要鉴定制品的纯度。蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采纳的方法有:SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。纯的蛋白质在一定条件下进行电泳,将以单一的速度移动,它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中,应以单一的沉降速度移动。选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度,必须同时采纳2-32-3种不同的方法才能确定。蛋白质、核酸的定性定量检测1、蛋白质的测定 凯氏定氮法(含N量 6、25)双缩脲法、Folin-酚法 紫外光度法(max=280nm)离心法、电泳法、层析法2、酶活力的测定 终点法、动力学法3、氨基酸的测定 茚三酮法 Sangerf法、Edmam法、DNS法4、核酸的测定 紫外光度法(max=260nm)分子杂交法 离心法、电泳法核酸的纯度鉴定一般采纳琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳,沉降分析和紫外吸收法(A260/A280A260/A280)等方法。v同蛋白质一样,核酸纯度鉴定也必须采纳2-32-3种方法才能确定。第六节 纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计 先粗放后精确;先快速后费时;先缩小体积后用少量样品法。依照各种方法的原理,从多种分离方法中反复比较认真权衡,筛选出两种或两种以上的方法,组成一个满足需要的合适的纯化方案。忌一种方法反复使用;初期设计的方案需不断修正调节。二、纯化方案的评价 评价指标:比活力,纯化倍数,收得率尽量增大纯化倍数和提高收得率！比活力:活力单位/毫克蛋白纯化倍数:每步比活力/粗抽提液的比活力收得率:每步总活力占粗抽提液的总活力的百分比有效成分纯度和性质的分析纯度鉴定:电泳、免疫分析、薄层层析、薄膜层析性质分析:光谱法和气相层析质量测定:凝胶过滤、电泳(分子量大小)核酸序列:化学或酶解直读法蛋白质序列:N端测序、与Endman降解法相结合的薄膜层析等。感谢您的聆听！感谢您的聆听！