生物大分子提取技术--课件

1ppt课件桂花赞几度风雨一场凉人间迎来桂花芳银桂周身亮繁星丹桂浓妆新嫁娘枝头鸟雀絮絮赞树下骚客搜枯肠清风淡云圆月下乾坤万里共清香2ppt课件生物大分子分离纯化的意义生物大分子分离纯化的意义生命生命科学研究科学研究的需要的需要：从生物材料中分离制备核酸、蛋白质，研究其结构与功能，对从生物材料中分离制备核酸、蛋白质，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。医学检验医学检验需要：需要：是分析标本中包含的分子信息的前提条件，对于精确诊断疾病是分析标本中包含的分子信息的前提条件，对于精确诊断疾病具有重要意义。具有重要意义。医疗实践医疗实践的需要：的需要：如用胰岛素治疗糖尿病。如用胰岛素治疗糖尿病。基因工程基因工程的需要：的需要：基因工程疫苗和药物。基因工程疫苗和药物。3ppt课件中心法则4ppt课件核酸、蛋白质（酶）是重要的生物大分子核酸、蛋白质（酶）是重要的生物大分子 存在于一切生物体中存在于一切生物体中核酸是遗传信息的携带者核酸是遗传信息的携带者 在有机体内指导各种蛋白质的合成。在有机体内指导各种蛋白质的合成。蛋白质是生物功能的执行者蛋白质是生物功能的执行者 担负着生物催化、物质运输、运动、防御、生长调担负着生物催化、物质运输、运动、防御、生长调控以及记忆、识别等多种生理功能。控以及记忆、识别等多种生理功能。5ppt课件核酸-DNA与RNA结构结构6ppt课件脱氧腺嘌呤核苷A7ppt课件A-T对 G-C对8ppt课件5C G A A TCAGAA33G C T T AGTCTT5 双链DNA高级结构高级结构9ppt课件核酸的性质DNA:双螺旋;RNA单链 带电性-电泳 水溶性-溶液 变性、复性-分子杂交 光吸收性质-浓度纯度测定 DNA增色效应-TM值测定10ppt课件蛋白质结构11ppt课件12ppt课件蛋白质性质 双带电性-电泳等电点 水溶性脂溶性-溶液 分子间识别-抗原抗体反应 光吸收性质-浓度纯度测定 变性13ppt课件生物大分子分离纯化的一般程生物大分子分离纯化的一般程序序 材料的选择和预处理材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（有时还需破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）要进行细胞器的分离）分离纯化：包括粗分级分离分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。分离纯化的前处理。14ppt课件一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理选材，选材，科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。临床选材则要考虑病人的依从性。实验目的即可。临床选材则要考虑病人的依从性。预处理预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。若不立即进行实验物需要将菌体与发酵液分开。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。或加工，应冷冻保存。15ppt课件应选择适当的方法将组织和细胞破碎，生物大应选择适当的方法将组织和细胞破碎，生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态和生物活性。出来，并保持原来的天然状态和生物活性。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。二、组织细胞的破碎二、组织细胞的破碎16ppt课件v一般动物组织和细胞可用一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器电动捣碎机或匀浆器破碎或破碎或用超声波处理破碎。用超声波处理破碎。v植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。的。v细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波、与石英砂研磨、非常坚韧。破碎的方法常有超声波、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。组织细胞的破碎方法组织细胞的破碎方法17ppt课件n细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。还有叶绿体。n如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。n采用采用差速离心法差速离心法分离细胞器，即将破碎后的细胞在适当的分离细胞器，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分心后，即可获得所需组分。三、细胞器的分离三、细胞器的分离18ppt课件将组织细胞破碎，使目标分子被释放出来，并将将组织细胞破碎，使目标分子被释放出来，并将其与其它细胞成分分离其与其它细胞成分分离,这就是提取。这就是提取。在此过程中，必须立即将细胞匀浆液置于一定条在此过程中，必须立即将细胞匀浆液置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，的分解破坏，四、提取四、提取19ppt课件从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离粗分级分离和细分级分离两两步进行。步进行。五、分离纯化五、分离纯化20ppt课件核酸核酸分离纯化的一般程序分离纯化的一般程序破碎细胞或组织破碎细胞或组织破碎细胞或组织破碎细胞或组织提取提取提取提取纯化纯化纯化纯化21ppt课件核酸提取技术DNA提取技术提取技术 原理、方法、应用原理、方法、应用RNA提取技术提取技术 原理、方法、应用原理、方法、应用22ppt课件核酸提取的要求核酸提取的要求1 1、纯度纯度：2 2、完整度完整度：3 3、活性活性：4 4、收率收率：5 5、速度速度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如用于基因扩增的模板主要取决于研究的目的和应用上的要求。如用于基因扩增的模板DNADNA纯度要纯度要求较低，而用于治疗的求较低，而用于治疗的DNADNA则纯度要求很高。则纯度要求很高。大分子完整度越高越好。大分子完整度越高越好。要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。多，损失越大。越快速越好。越快速越好。23ppt课件DNA的提取纯化的提取纯化本质：将本质：将DNA从组织或细从组织或细胞中分离沉淀出来胞中分离沉淀出来。要求：去除杂蛋白、多糖、要求：去除杂蛋白、多糖、脂类等大分子杂质，同时脂类等大分子杂质，同时要快速简便。要快速简便。常用的提取方法：常用的提取方法：酚酚-氯仿提取法氯仿提取法 盐析法盐析法 高温裂解法高温裂解法 固相吸附洗脱法固相吸附洗脱法 碘化钠提取法碘化钠提取法 磁珠分离法磁珠分离法24ppt课件举例举例:外周血外周血DNA提取的方法步骤提取的方法步骤1.1、标本预处理、标本预处理：2.1ml EDTA抗凝贮冻血于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500g离心15min,倾去上清。重复一次。用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉淀，37水浴温育1h。3.2、消化、消化：4.上述DNA提取液混悬白细胞，37水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。25ppt课件3.酚抽提纯化酚抽提纯化DNA：冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿异戊醇（241），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。4.沉淀沉淀DNA：加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的冷无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液适量溶解DNA，DNA完全溶解通常需12-24小时。26ppt课件5.DNA的浓度测定及纯度判定：的浓度测定及纯度判定：取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。按下面公式计算浓度：DNA浓度浓度(ug/ul)=A260*50*稀释倍数稀释倍数/1000DNA纯度的判定：A260/A280 比值应介于1.7-1.8之间。27ppt课件人基因组DNA 28ppt课件RNA的提取纯化意义：意义：完整RNA的提取和纯化，是进行RNA研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等实验的前提。29ppt课件关键点关键点:）样品细胞或组织的有效破碎；）有效地使核蛋白复合体变性；）对内源酶的有效抑制；）有效地将从和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。30ppt课件RNA的提取途径：的提取途径：1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；该提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前已很少使用。2)直接在酸性条件下用酚酸性条件下用酚-氯仿抽提氯仿抽提，异丙醇沉淀，再用乙醇洗涤沉淀，即可去除几乎所有残留的蛋白质和无机盐。因为酸性条件下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。31ppt课件举例：组织（细胞）总RNA提取1、试剂耗材准备试剂耗材准备RNA提取缓冲液：4M 异硫氰酸胍、25mM 柠檬酸钠、100mM-巯基乙醇；饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1）；3M 醋酸钠 pH5.2；DEPC处理的去离子水：0.5%DEPC的去离子水，充分摇匀，放置4小时以上，蒸汽高压灭菌，分装成小份；RNA酶抑制剂；15ml、1.5ml等离心管，0.1%DEPC浸泡过夜，蒸汽高压灭菌。32ppt课件2 操作步骤操作步骤1）将10-30mg组织加入1ml RNA提取缓冲液，匀浆化；或将1ml RNA提取缓冲液加入1瓶培养细胞（10E6-10E7细胞），充分混匀，并使细胞裂解；2）4/12000rpm离心10分钟，上清转移到另一干净的离心管；3）加入等体积饱和酚：氯仿：异戊醇，混匀，冰浴10分钟；4）4/12000rpm离心5分钟，小心转移水相；33ppt课件5）氯仿：异戊醇抽提一次，转移水相；6）加入1/10体积的3M 醋酸钠和2.5倍无水乙醇，混匀，冰浴1小时；7）4/14000rpm离心10分钟；8）弃上清，75%乙醇洗一次，真空干燥20分钟；9）加入20-50ul DEPC处理水溶解RNA，可加入少量RNA抑制剂；或加入1ml 乙醇和1/10体积3M 醋酸钠（pH5.2），-20-70保存34ppt课件核酸的纯化核酸的纯化1 1、粗分级分离、粗分级分离 从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。粗提纯中，进一步将蛋白质除去粗提纯中，进一步将蛋白质除去,可用去污剂或有机溶剂多可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。次反复提取。从从RNARNA除去混杂的除去混杂的DNADNA，可用，可用DNase将将DNADNA降解掉。降解掉。从从DNADNA中除去混杂的中除去混杂的RNARNA，可用，可用RNase将将RNARNA降解掉。降解掉。35ppt课件2 2、精分级分离、精分级分离 核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。方法。超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。电泳电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。前者凝胶孔径小，适合分离前者凝胶孔径小，适合分离10001000个核苷酸以下的核酸分子。个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。石柱层析。36ppt课件3 3、纯度鉴定：、纯度鉴定：核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收（泳，沉降分析和紫外吸收（A260/A280A260/A280）等方法。）等方法。RNA的浓度测定及纯度判定：取RNA溶液用DEPC处理的纯水做适量稀释，以纯水作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。按下面公式计算浓度：RNA浓度(ug/ul)=A260*40*稀释倍数/1000 RNA纯度的判定：A260/A280 比值应介于1.8-2.0之间。37ppt课件38ppt课件一、蛋白质（酶）的分离纯化一、蛋白质（酶）的分离纯化蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子特异性蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。性质性质 方法方法v分子大小分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤v 溶解度溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀v电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析v吸附性质吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层 析）析）v对配体分子对配体分子 亲和层析亲和层析 的生物亲和力的生物亲和力39ppt课件主要是利用主要是利用盐析法盐析法、等电点沉淀、有机溶剂、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。白质，但分辨率低。1 1、粗分级分离、粗分级分离40ppt课件（1 1）盐析）盐析l向蛋白质溶液中加入大量向蛋白质溶液中加入大量的中性盐的中性盐（NHNH4 4)2 2SOSO4 4，NaNa2 2SOSO4 4，NaNa2 2SOSO4 4，使蛋白，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。这种现象称为盐析。l盐析作用是由于当盐浓度盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化坏蛋白质分子表面的水化层。层。41ppt课件l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质溶液中的盐浓度，可一样，因此调节蛋白质溶液中的盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：以使不同的蛋白质分别沉淀。如：血清血清球蛋球蛋白白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析42ppt课件常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。会引起蛋白质活性丧失。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。性。蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用能进一步精提纯。脱盐常用透析法透析法。透析袋透析袋蛋白质溶液蛋白质溶液蒸馏水蒸馏水43ppt课件（2 2）等电点沉淀）等电点沉淀蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液量有关，随溶液pHpH变化而变化。在溶液变化而变化。在溶液pHpH值等值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液溶液pHpH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。44ppt课件纯度鉴定纯度鉴定生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-SDS-聚聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。降分析法等。v纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。在离心场中，应以单一的沉降速度移动。v选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用纯度，必须同时采用2-32-3种不同的方法才能确定。种不同的方法才能确定。45ppt课件书山有玉研为道书山有玉研为道学海无涯用作灯学海无涯用作灯46ppt课件