生物制药工艺学课件

生物制药工艺学喻昕生物制药工艺学第一篇 生物药物发酵工艺微生物代谢产物：次级代谢产物菌种：选育、育种、保藏、培养基、灭菌除菌、生产种子、发酵过程与控制、基因工程菌、生物催化第二篇 生物药物分离纯化工艺生物药物纯化技术：液固分离、膜分离、萃取、离子交换、吸附分离、沉淀分离、色谱、结晶1 绪论一、生物制药的发展历史1929年 Fleming 青霉素 菌株：点青霉1940年 Florey和Chain 结晶青霉素20世纪40-50年代 抗生素工业发展黄金时代20世纪60年代以来，抗肿瘤、抗病毒、抗虫抗生素20世纪80年代以后，基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程第一章 绪论二、生物制药工艺的改进与创新（一）微生物培养技术的发展：表面培养到深层培养、补料发酵、连续发酵、高密度发酵（二）发酵控制技术的发展：发酵控制（三）生物反应器制造技术的发展：高效率低能耗生物大容量反应器，发酵罐技术发展（四）分离纯化技术的发展：各种分离理论及分离技术的开发第一章 绪论三、生物制药产品的类别（一）微生物发酵产物：1.菌体药物，酵母菌体、单细胞蛋白，人工培养真菌如灵芝、茯苓菌、香菇、猴头菇等、苏云金芽孢杆菌；2.微生物酶制剂：各类酶3.酶活调节剂：酶的抑制剂和激活剂4.微生物代谢产物：初级代谢产物、次级代谢产物第一章 绪论三、生物制药产品的类别（二）生物转化产物：利用生物代谢过程中的酶或酶体系将底物转化成含有特殊功能团的产物（三）基因工程产物：1982年，第一个基因工程药物胰岛素上市，此外陆续上市的有人生长因子、白介素、干扰素、促红细胞生成素等。第一章 绪论四、生物制药的工艺过程（一）菌种（二）斜面培养（三）种子制备（四）发酵（五）发酵液预处理（六）提取和精制（七）成品检验（八）成品包装2 微生物代谢产物生物合成与调控2.1 微生物的代谢产物2.1.1 初级代谢产物及其特点2.1.2 次级代谢产物及其特点2.1.3 初级代谢产物与次级代谢产物的关系2.1.1 初级代谢产物及其特点初级代谢产物指的是与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢产物，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸、多糖、脂肪酸、维生素等特点：（1）是菌体生长繁殖所必须的物质（2）是各种微生物共有的产物2.1.2 次级代谢产物及其特点次级代谢产物指的是与生物的生长繁殖无直接关系的代谢产物，是某些生物为了避免初级代谢中间产物的过量积累或由于外界环境的胁迫，而产生的一类有利于其生存的代谢产物。特点：（1）特定菌种产生的代谢产物；（2）菌体特定生长阶段的产物；（3）多组分的混合物2.1.3 初级代谢产物与次级代谢产物的关系一、初级代谢产物是次级代谢产物的前体或起始物二、初级代谢的调控影响次级代谢产物的生物合成2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径次级代谢产物是以初级代谢产物或其中间代谢产物为原料合成的，其构建单位主要有：氨基酸及其衍生物、糖及氨基糖、聚酮体及其衍生物、甲羟戊酸衍生物、莽草酸及其衍生物、环多醇和氨基环多醇、核苷衍生物等。次级代谢产物的生物合成涉及起始物，包括构建单位的合成、构建单位的连接和产物合成后的修饰过程。2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径聚酮体及其衍生物是乙酸、丙酸、丁酸和某些短链脂肪酸缩合反应的产物，该反应均由多酶复合体聚酮合酶（PKS）催化。在缩合过程中小分子有机酸中的羧基被转化为合成产物中的酮基，所以该合成途径被称为聚酮体或多聚乙酰途径（polyketide）。聚酮体途径的代表产物有大环内酯类抗生素、多烯类抗生素、蒽环类抗生素、四环类抗生素等。聚酮体合成的起始单位有：乙酰辅酶A、丙酰辅酶A和丁酰辅酶A；而作为链的延长单位有丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶等，它们分别是二碳、三碳、四碳单位的供体。2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径2.2.1 氨基酸及其衍生物许多次级代谢产物是以氨基酸或氨基酸的衍生物为原料合成的。如多肽类抗生素基本上是由氨基酸及氨基酸的衍生物合成的。氨基酸及其衍生物包括天然氨基酸；非天然氨基酸如D-氨基酸、N-甲基氨基酸、-氨基酸等。天然氨基酸合成的中间产物鸟氨酸和-氨基己酸。代表产物主要是肽类抗生素。（见书中P16图2-9）2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径2.2.2 糖及氨基糖次级代谢产物中有些糖的结构是非常特殊的，他们在初级代谢产物中根本不存在，如构成氨基糖苷类抗生素的碳霉糖、竹桃糖、链霉糖等，它们以O-、N-、S-、C-糖苷等与次级代谢产物分子中的糖苷配基连接。葡萄糖和戊糖是这些糖类和氨基糖的前体。葡糖糖的碳架一般经过异构化、氨基化、脱氧、碳原子重排、氧化还原或脱羧等反应后形成各种糖类构建单位。氨基糖的合成是先将葡萄糖活化成己酮糖，然后经过转氨作用将谷氨酰胺或谷氨酸的氨基转移到己酮糖的分子上。见书P16和P17的图2-10和图2-11.2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径2.2.3 聚酮体及其衍生物聚酮体及其衍生物是乙酸、丙酸、丁酸和某些短链脂肪酸缩合反应的产物。该反应均由多酶复合体-聚酮合酶（polyketide synthase,PKS）催化。在缩合过程中，小分子有机酸中的羧基被转化为合成产物中的酮基，随着小分子有机酸的不断被缩合，合成产物的碳链不断延长，合成产物中的酮基也逐渐增多聚酮体或多聚乙酰途径。聚酮体途径的代表产物有大环内酯类抗生素、多烯类抗生素、蒽环类抗生素、四环类抗生素等。聚酮体合成的基本步骤见书P18图2-13，图2-15为聚酮体产物与脂肪酸的生物合成过程，图2-16为聚酮体与脂肪酸生物合成示意图。2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径2.2.4 甲羟戊酸及其衍生物甲羟戊酸（mevalonic acid,MVA）,即3-甲基-3,5-二羟基戊酸，是由乙酸缩合而成，P19图2-17为甲羟戊酸的生物合成路径。甲羟戊酸经磷酸化、脱水和脱羧后形成具有生物活性的异戊二烯焦磷酸（C5单位）。异戊二烯焦磷酸几乎可以任何数量的单元相结合，形成各种代谢产物（见P20图2-18 类胡萝卜素和甾醇的生物合成途径）2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径2.2.5 环多醇和氨基环多醇环多醇是一些带有羟基的环碳化合物。氨基环多醇是环多醇分子中的一个或多个羟基被氨基取代的衍生物（见书P21图2-20）。在氨基环多醇类抗生素（如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等）中最常见的环多醇部分是由葡萄糖衍生出来的，如-脱氧核糖、链霉胍都是由葡萄糖经过磷酸化、环化等反应形成环多醇，再经过氨基化等反应形成的（见书中P21图2-21 氨基环多醇的生物合成）。2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径2.2.6 碱基及其衍生物正常核酸嘌呤碱基和嘧啶碱基，或由合成核酸的嘌呤和嘧啶碱基经过化学修饰而形成的非核酸嘌呤碱基和嘧啶碱基，均可作为核酸与核苷类药物的构建单位。如肌苷（inosine）是由次黄嘌呤与核糖结合而成的，又称次黄嘌呤核苷。肌苷和肌苷酸的化学结构见书中P21图2-22。嘌呤霉素和阿糖腺苷的转化也都是通过生物转化实现的。其中腺嘌呤核苷酸直接被产生菌作为前体并入到嘌呤霉素的分子中，阿糖腺苷是通过2-羟基腺苷的差向异构化合成的。2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径2.2.7 莽草酸及其衍生物莽草酸是许多芳香族化合物（包括芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚类化合物）的前体，源自葡萄糖。芳香族氨基酸合成时有一段相同的途径叫莽草酸途径。代表产物有利福霉素、绿脓菌素和新生霉素等（见P22图2-24 由芳香中间体合成的抗生素和其他代谢产物）利福霉素的芳香成分来自莽草酸；绿脓菌素的吩嗪骨架来自邻氨基苯甲酸；新生霉素和黄青霉素的芳香部分来自酪氨酸；放线菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香环来自色氨酸。2.2 次级代谢产物的构建单位与合成途径2.2.8 吩噁嗪酮吩噁嗪酮是构成某些次级代谢产物的基本结构，如放线菌素的发色团中就居于一个吩噁嗪酮的结构。代表产物有放线菌素（书中P23 图2-25放线菌素）色氨酸和其他一些代谢物是吩噁嗪酮生物合成的前体，它们先形成4-甲基-3-羟基-邻氨基苯甲酸（书中P23图2-26），然后两分子的4-甲基-3-羟基-邻氨基苯甲酸在吩噁嗪酮合成酶的催化下被氧化脱水形成吩噁嗪酮（见书P23图2-27 吩噁嗪酮的生物合成）2.3.1 构建单位的合成次级代谢产物的合成首先是要合成各个构建单位，构建单位就好比盖高楼大厦的砖、瓦、门、窗，有了这些基本材料才能盖出各式各样的大厦。同样，有了生物合成的各种构建单位，才能合成种类繁多的次级代谢产物。2.3 次级代谢产物的生物合成过程2.3.2 构建单位的连接构建单位合成后，在合成酶、连接酶、脱水酶、氨基转移酶等酶的作用下相互连接，形成次级代谢产物的基本框架。书中P24对青霉素、阿维菌素和链霉素的合成途径进行了简单介绍。2.3 次级代谢产物的生物合成过程2.3.3 母核合成后的修饰次级代谢产物是以初级代谢产物或其中间代谢产物为原料合成的，不同的构建单位合成后的母核结构类型和生物活性也不同。一般次级代谢产物的母核结构合成后，往往还不具有生物活性，还要经过后修饰过程才能产生具有生物活性的代谢产物，这些后修饰的过程包括：氨基化、甲基化、酰基化、羟基化等。书中P24图2-28 由6-脱氧红霉内酯经过后修饰合成红霉素A的过程。2.3 次级代谢产物的生物合成过程微生物的生命活动是通过各种代谢途径组成的网络相互协调来维持的，每一条代谢途径都是由一系列连续的酶促反应构成。微生物能严格控制代谢活动，使之有序地运行，并能快速适应环境，最经济地利用环境中的营养物。微生物对次级代谢活动的调控主要有两种代谢调节方式：一种是酶合成的调节，即调节酶的合成量，这是一种“粗调”；另一种是酶活力调节，即调节已有酶的活力，这是一种“细调”2.4 次级代谢产物生物合成的调控2.4.1 酶合成的诱导调节在底物或底物的结构类似物的诱导下产生2.4.2 反馈调节（一）自身代谢产物的反馈调节（二）前体物的反馈调节（三）支路产物的反馈调节2.4.3 磷酸盐调节在抗生素等多种次级代谢产物合成中，高浓度磷酸盐表现出较强的抑制作用，称为磷酸盐调节2.4 次级代谢产物生物合成的调控2.4.3 磷酸盐调节在抗生素等多种次级代谢产物合成中，高浓度磷酸盐表现出较强的抑制作用，称为磷酸盐调节。调节机制一般可能有以下几个方面：（1）磷酸盐促进初级代谢，抑制菌体的次级代谢；(2)磷酸盐抑制次级代谢产物前体的生物合成；（3）磷酸盐抑制磷酸酯酶的活性；（4）ATP的调节作用；（5）磷酸盐对次级代谢产物合成酶的调节；（6）磷酸盐调控的分子机制一般认为作用在基因的转录水平上2.4 次级代谢产物生物合成的调控2.4.4 碳分解产物调节（一）碳源对次级代谢产物生物合成的调节碳分解产物的调节作用是指易被菌体迅速利用的碳源及其降解产物对其他代谢途径酶的调节；（二）碳分解产物调节的分子机制书中P31图2-31吩噁嗪酮合成酶参与的放线菌素生物合成 图2-32 吩噁嗪酮合成酶mRNA水平的Northern-blotting分析2.4 次级代谢产物生物合成的调控2.4.5 氮分解产物调节在抗生素的生物合成中，当发酵培养基中存在多种氮源时，微生物总是先利用简单的氮源，然后再分解利用复杂的氮源；并且当这些简单的氮源（如NH4+，氨基酸）浓度高时，几乎不合成抗生素，只有在较低的浓度时，抗生素才开始合成。铵离子阻遏作用或氮阻遏能够被快速利用的氮源（如铵盐、硝酸盐、某些氨基酸）对许多种次级代谢产物的生物合成有强烈的调节作用氮分解产物调节作用2.4 次级代谢产物生物合成的调控2.4.5 氮分解产物调节（一）阻遏次级代谢产物生物合成酶的合成（二）调节初级代谢进而影响次级代谢产物的合成2.4 次级代谢产物生物合成的调控2.4.6 菌体生长速率的调节菌体的生长速率是控制次级代谢 的重要因素。次级代谢产物受菌体生长速率调节，在生长期次级代谢产物合成酶收到阻抑作用，次级代谢产物不被合成。较低的菌体生长速率和缺乏某一特定营养时，有利于次级代谢产物的合成。书中P33表2-9 菌体生长期中受阻抑的抗生素合成酶2.4 次级代谢产物生物合成的调控2.4.7 化学调节因子的调节化学调节因子是微生物自身产生的小分子调节物如A因子，B因子等。化学调节因子对次级代谢产物的生物合成起着重要的调节作用，书中P33图2-34 A因子的化学结构及其产生的遗传基础。2.4 次级代谢产物生物合成的调控2.4.8 控制次级代谢产物生物合成的因素控制次级代谢产物生物合成即控制影响次级代谢产物生物合成的因素。为了提高次级代谢产物 合成量，要加强诱导，并解除自身代谢产物的反馈调节，解除前体自身的反馈调节，解除支路产物的反馈调节，解除磷酸盐调节，解除碳（氮）分解产物调节，控制菌体生长速率等控制的方法可以从遗传和环境两方面考虑。2.4 次级代谢产物生物合成的调控p经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量pStudyConstantly,AndYouWillKnowEverything.TheMoreYouKnow,TheMorePowerfulYouWillBe写在最后谢谢你的到来学习并没有结束，希望大家继续努力Learning Is Not Over.I Hope You Will Continue To Work Hard演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日