生物制药技术基因构建培训课件

生物制药技术基因构建生物制药技术（含实验）生物制药技术（含实验）课程教学大纲课程教学大纲2教学内容理论课学时 绪论1 基因与工程细胞的构建3 工程细胞的发酵培养与蛋白表达2 重组蛋白的分离纯化2 生物制药的制剂研究1 生物制药的质量研究与分析技术4 生物制药的中试研究2 生物制药的稳定性研究1 生物制药的主要药效学研究1 生物制药的药代动力学研究1教学内容理论课学时小课讨论学时 生物制药的安全性评价3 第一次PBL生物制药立项 2 抗体药物3 基因治疗与基因药物2 肿瘤的细胞免疫治疗3 第二次PBL肿瘤的治疗 2 个体化医学诊疗2 生物制药的知识产权问题1 生物制药的药品注册2 第三次PBL生物制药申报 2生物制药技术基因构建生物制药研发的基本流程3基因基因构建构建发酵发酵培养培养分离分离纯化纯化制剂制剂研究研究质量研究质量研究中中 试试放放 大大稳定性稳定性研研 究究药效学药效学研研 究究安全药理安全药理研研 究究临临床床申申报报药学药学(实验室实验室)药学药学(中试中试)药理学药理学临床试验临床试验生物制药技术基因构建2.2.11基因与工程细胞构建基因与工程细胞构建2.2.22工程细胞的发酵培养与蛋白表达工程细胞的发酵培养与蛋白表达2.2.33重组蛋白的分离纯化重组蛋白的分离纯化2.2.44生物制药的制剂研究生物制药的制剂研究2.2.55生物制药的质量研究与分析技术生物制药的质量研究与分析技术2.2.66生物制药的中试研究生物制药的中试研究2.2.77生物制药的稳定性研究生物制药的稳定性研究第二章重组蛋白药物的药学概论原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞4生物制药技术基因构建2.12.1.1.1基本概念基本概念2.12.1.2.2质粒、载体质粒、载体2.12.1.3.3工程细胞与细胞库工程细胞与细胞库2.12.1.4.4表达方式选择表达方式选择2.12.1.5.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达2.1.62.1.6实例实例2.12.1 基因与基因与工程细胞构建工程细胞构建5第二章重组蛋白药物的药学概论生物制药技术基因构建2.1基因与工程细胞构建l l基因重组基因重组分子水平、提取、连接、转染、复制、表达分子水平、提取、连接、转染、复制、表达uu别称别称基因工程、基因工程、DNADNA重组、遗传工程、基因操作、克隆重组、遗传工程、基因操作、克隆l l工程细胞的三要素工程细胞的三要素uu基因基因uu载体载体uu宿主细胞宿主细胞62.1.12.1.1基本概念基本概念生物制药技术基因构建l l基因基因一段具有蛋白结构编码的核酸序列一段具有蛋白结构编码的核酸序列l l载体载体质粒、噬菌体、病毒质粒、噬菌体、病毒l l限制性内切酶、连接酶限制性内切酶、连接酶l l抗生素抗性基因抗生素抗性基因KanKan、NeoNeo、TetTet、AmpAmp、StrStrl l宿主细胞宿主细胞细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞2.1基因与工程细胞构建72.1.12.1.1基本概念基本概念生物制药技术基因构建组建表达载体条件l强启动子l两侧的调控序列l选择标记l正确的读码框架l合适的核糖体结合位点（SD序列）lSD序列与起始密码子ATG之间合适的距离l被翻译的蛋白性质与稳定性l合适的宿主细胞2.1基因与工程细胞构建SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16S rRNA3端识别，帮助从起始AUG处开始翻译82.1.12.1.1基本概念基本概念生物制药技术基因构建2.1.22.1.2质粒、载体质粒、载体2.1基因与工程细胞构建9生物制药技术基因构建2.1基因与工程细胞构建10生物制药技术基因构建2.1基因与工程细胞构建11生物制药技术基因构建克克 隆隆鉴鉴 定定宿主细胞宿主细胞细胞筛选细胞筛选细胞库细胞库合成、分离、合成、分离、RT-PCRRT-PCR优化、测序优化、测序抗性基因、限制性内切酶位点抗性基因、限制性内切酶位点宿主与产品的相关性宿主与产品的相关性表达水平、产品鉴定表达水平、产品鉴定三级细胞库、遗传稳定性三级细胞库、遗传稳定性载载 体体2.1基因与工程细胞构建122.1.32.1.3工程细胞与细胞库工程细胞与细胞库生物制药技术基因构建原始种子库原始种子库主种子库主种子库工作种子库工作种子库2.1基因与工程细胞构建13生物制药技术基因构建调控调控生物遗传中心法则DNARNAProtein2.1基因与工程细胞构建14生物制药技术基因构建蛋白质结构蛋白质结构Primary Structure The sequence of amino acids on the polypeptide chainSecondary Structure Conformation of the polypeptide chain(3D structure)Tertiary Structure Three Dimensional Structure(Folding)of the proteinQuaternary Structure Complexation with other proteins(Similar or dissimilar structures)2.1基因与工程细胞构建152.1.42.1.4表达方式选择表达方式选择生物制药技术基因构建依赖于制备过程的蛋白质结构依赖于制备过程的蛋白质结构Prokaryotic cellsProkaryotic cellsl l Easier to make Easier to make l l Cheaper to produce Cheaper to produce n n Improper folding of protein Improper folding of protein n n No glycosylation No glycosylationn n No Secretion No Secretion Eukaryotic cellsEukaryotic cellsuu Can properly fold the proteinCan properly fold the proteinuu Glycosylate-(maybe differently)Glycosylate-(maybe differently)n n Harder to clone Harder to clone n n Harder to maintain in cell culture Harder to maintain in cell culture n n May harbor viruses May harbor viruses n n Lower yieldsLower yieldsn n Higher expense Higher expense2.1基因与工程细胞构建162.1.42.1.4表达方式选择表达方式选择生物制药技术基因构建2.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达2.1基因与工程细胞构建17生物制药技术基因构建2.1基因与工程细胞构建182.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建Soluble Inclusion BodySecreting2.1 基因与工程细胞构建原核细胞表达系统原核细胞表达系统192.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建优点突出优点突出l l正确指导蛋白质正确折叠正确指导蛋白质正确折叠l l提供糖基化等多种翻译后加工提供糖基化等多种翻译后加工l l在新基因发现、蛋白质结构功能研究中起极为重要的作用在新基因发现、蛋白质结构功能研究中起极为重要的作用l l生产阶段系统表达水平达到生产阶段系统表达水平达到7g/L7g/Ll l生物医药产业发达国家新药研发中均选择哺乳动物细胞表达系统生物医药产业发达国家新药研发中均选择哺乳动物细胞表达系统2.1基因与工程细胞构建哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统202.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统受体细胞条件受体细胞条件l l细胞系特征细胞系特征丧失细胞接触抑制和锚地依赖性丧失细胞接触抑制和锚地依赖性l l遗传稳定性遗传稳定性外源基因多次传代不丢失外源基因多次传代不丢失l l合适的标记合适的标记便于筛选与维持便于筛选与维持l l生长快且齐生长快且齐分裂周期短，生长均一分裂周期短，生长均一l l安全性安全性不合成、分泌致病物质，不致癌不合成、分泌致病物质，不致癌l l以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞必须条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞必须条件2.1基因与工程细胞构建222.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建遗传标记遗传标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨甲喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞构建232.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建常用宿主细胞常用宿主细胞 商业化商业化l lCHOCHO中国仓鼠卵巢细胞系中国仓鼠卵巢细胞系l lBHKBHK小仓鼠肾细胞系小仓鼠肾细胞系l lCOSCOS非洲绿猴肾成纤维细胞系非洲绿猴肾成纤维细胞系l lNSONSO小鼠骨髓瘤细胞系小鼠骨髓瘤细胞系l lSP2/0SP2/0小鼠骨髓瘤细胞系小鼠骨髓瘤细胞系l lHEK293HEK293人胚肾细胞系人胚肾细胞系l lNIH313NIH313鼠成纤维细胞系鼠成纤维细胞系l l因稳定性与糖基化不同，根据表达目的蛋白选择适当细胞系因稳定性与糖基化不同，根据表达目的蛋白选择适当细胞系哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞构建242.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建真核表达载体必要原件真核表达载体必要原件 高活性启动子、转录终止序列、有效高活性启动子、转录终止序列、有效mRNAmRNA翻译信号翻译信号 复制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位点复制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位点 标志基因标志基因 内含子内含子 内部核糖体进入位点（内部核糖体进入位点（IRESIRES）哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞构建 一般真核mRNA的翻译都需要5帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5端具有一段较短的RNA序列（约150-250bp），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site,IRES）252.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建l l诱导的方式诱导的方式l lIPTG/IPTG/乳糖乳糖l l低温低温l lpHpHl l低磷低磷l l表达检测方式表达检测方式l l表达标志物表达标志物l l电泳电泳l lGFPGFPl l遗传稳定性遗传稳定性l l基因稳定性基因稳定性琼脂糖电泳、指纹图谱、琼脂糖电泳、指纹图谱、PCRPCR、测序、测序l l表达稳定性表达稳定性表达标志物、活性表达标志物、活性l l四环素四环素l l蜕皮激素蜕皮激素l l他可莫斯他可莫斯/雷帕霉素雷帕霉素l lRU486RU4862.1 基因与工程细胞构建262.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建高效表达外源蛋白的基本原理高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因通过强化基因扩增高效表达外源基因DHFR-MTXDHFR-MTX高效表达系统高效表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞构建272.1.52.1.5基因构建与诱导表达基因构建与诱导表达生物制药技术基因构建组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂l l第一个重组哺乳动物细胞规第一个重组哺乳动物细胞规模化生产的溶栓药物模化生产的溶栓药物人人组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂(tPA)(tPA)l l目前市场上销售的阿替普酶目前市场上销售的阿替普酶(tPA)(tPA)采用采用DHFR-MTXDHFR-MTX系统表达，系统表达，受体细胞为受体细胞为CHOCHO系统系统l l人人tPAtPA也可由大肠杆菌生产，但也可由大肠杆菌生产，但蛋白折叠效率低蛋白折叠效率低2.1 基因与工程细胞构建282.1.62.1.6实例实例生物制药技术基因构建组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂2.1基因与工程细胞构建292.1.62.1.6实例实例生物制药技术基因构建代表药物代表药物优点优点缺点缺点第一代第一代链激酶（链激酶（SKSK）尿激酶（尿激酶（UKUK）溶栓能力强溶栓能力强缺乏特异性缺乏特异性导致出血导致出血过敏反应过敏反应第二代第二代组织型纤溶酶原激组织型纤溶酶原激活剂（活剂（tPAtPA）具有溶栓特异性具有溶栓特异性副作用较少副作用较少半衰期短半衰期短需大量注射需大量注射第三代第三代瑞替普酶（瑞替普酶（rPArPA）兰替普酶（兰替普酶（NPANPA）溶栓快速溶栓快速治疗效率高治疗效率高半衰期长半衰期长生产工艺复杂生产工艺复杂第四代第四代PAI-1PAI-1抑制剂抑制剂可以口服给药可以口服给药半衰期长半衰期长价格低廉价格低廉仍处于试验阶段仍处于试验阶段未开发用于临床未开发用于临床组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂2.1基因与工程细胞构建302.1.62.1.6实例实例生物制药技术基因构建tPAtPArPArPA 527527个氨基酸个氨基酸 分子量分子量65kD65kD缺失突变缺失突变 355355个氨基酸个氨基酸 分子量分子量39kD39kDKringleKringle、丝氨酸蛋白酶区丝氨酸蛋白酶区FingerFinger区、区、KringleKringle、KringleKringle、EGFEGF区、区、丝氨酸蛋白酶区丝氨酸蛋白酶区2.1 基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂31312.1.62.1.6实例实例生物制药技术基因构建2.1基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂322.1.62.1.6实例实例生物制药技术基因构建载体：pET-44a宿主菌：BL21酶切位点：PshA/Hind 2.1 基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂332.1.62.1.6实例实例生物制药技术基因构建思考题l l基因重组的三要素是什么？每个要素的关键是什么？基因重组的三要素是什么？每个要素的关键是什么？l l宿主细胞主要有哪几类？其特点是什么？宿主细胞主要有哪几类？其特点是什么？l l原核细胞表达方式有几种，选择方式的主要依据有哪些？原核细胞表达方式有几种，选择方式的主要依据有哪些？l l细胞系的形成及其意义是什么？细胞系的形成及其意义是什么？34生物制药技术基因构建35知之者不如好之者好之者不如乐之者生物制药技术基因构建