蛋白质工程概述课件

生物技术制药生物技术制药第三章第三章蛋白质工程概述蛋白质工程概述生物技术制药第三章生物技术制药第三章蛋白质工程概述蛋白质工程概述1蛋白质工程蛋白质工程n蛋白质工程的目的是以蛋白质的结构蛋白质工程的目的是以蛋白质的结构-功能研功能研究为基础，运用基因工程技术定向改造天然究为基础，运用基因工程技术定向改造天然蛋白质，或设计创造全新蛋白质；蛋白质，或设计创造全新蛋白质；n蛋白质工程常被称为第二代基因工程；蛋白质工程常被称为第二代基因工程；n1982年：通过定点突变获得改性酪氨酸年：通过定点突变获得改性酪氨酸tRNA合成酶；合成酶；n1983年：年：Science发表以发表以“Protein engineering”为题的专论。为题的专论。生物技术制药生物技术制药蛋白质工程蛋白质工程的目的是以蛋白质的结构蛋白质工程蛋白质工程的目的是以蛋白质的结构-功能研究为基础，功能研究为基础，2基因工程与蛋白质工程的区别：基因工程与蛋白质工程的区别：n基因工程通过分离目的基因重组基因工程通过分离目的基因重组DNADNA分子，使目的分子，使目的基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型，基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型，但这只能合成自然界固有的蛋白质。但这只能合成自然界固有的蛋白质。n蛋白质工程则是运用基因工程的蛋白质工程则是运用基因工程的DNADNA重组技术，将重组技术，将克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特定性能的有特定性能的“突变型突变型”蛋白质分子，甚至全新蛋白质分子，甚至全新的蛋白质分子。的蛋白质分子。基因工程与蛋白质工程的区别：基因工程与蛋白质工程的区别：3蛋白质工程药物发展三个阶段：蛋白质工程药物发展三个阶段：n第一阶段：未经修饰的天然蛋白质被开发第一阶段：未经修饰的天然蛋白质被开发的药物（胰岛素、促红细胞生成素、干扰的药物（胰岛素、促红细胞生成素、干扰素）素）n第二阶段：在第一代基础上加以简单工程第二阶段：在第一代基础上加以简单工程技术修饰（促红细胞生成素、干扰素）技术修饰（促红细胞生成素、干扰素）n第三阶段：优化药物的生物学活性和理化第三阶段：优化药物的生物学活性和理化性质（一级结构的处理、化学修饰、蛋白性质（一级结构的处理、化学修饰、蛋白质翻译后的修饰及融合蛋白的应用）质翻译后的修饰及融合蛋白的应用）蛋白质工程药物发展三个阶段：第一阶段：未经修饰的天然蛋白质被蛋白质工程药物发展三个阶段：第一阶段：未经修饰的天然蛋白质被4蛋白质工程的重要意义蛋白质工程的重要意义生物技术制药生物技术制药n为蛋白质结构为蛋白质结构-功能关系研究提供强有力的而且是功能关系研究提供强有力的而且是不可替代的手段。不可替代的手段。n研制活性高、稳定性好和毒副作用小的新型蛋白研制活性高、稳定性好和毒副作用小的新型蛋白类药物，以及新型的抗生素、定向免疫毒素和工类药物，以及新型的抗生素、定向免疫毒素和工程抗体。程抗体。n构建具有独特的催化和分子识别功能的酶制剂和构建具有独特的催化和分子识别功能的酶制剂和生物传感器。生物传感器。n改变或改良农作物的品质，设计生产新型生物杀改变或改良农作物的品质，设计生产新型生物杀虫剂。虫剂。蛋白质工程的重要意义生物技术制药为蛋白质结构蛋白质工程的重要意义生物技术制药为蛋白质结构-功能关系研究提功能关系研究提5二、蛋白质工程的研究内容蛋白质工程蛋白质工程4 4大类研究：大类研究：1 1、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。2 2、定量确定蛋白质结构、定量确定蛋白质结构-功能关系。包括蛋白质三维结构功能关系。包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化性质、蛋白质折叠和稳定性研究、蛋模型的建立，酶催化性质、蛋白质折叠和稳定性研究、蛋白质变异的探讨等。白质变异的探讨等。3 3、从混杂变异体库中筛选出具有特定结构、从混杂变异体库中筛选出具有特定结构-功能关系的蛋功能关系的蛋白质。白质。4 4、根据已知结构、根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体，完全人为控制蛋白质的性质。及其变异体，完全人为控制蛋白质的性质。二、蛋白质工程的研究内容蛋白质工程二、蛋白质工程的研究内容蛋白质工程4大类研究：大类研究：6蛋白质工程技术在新药研究中应用：n提高药效活性（提高药效活性（TNF杀伤肿瘤细胞）杀伤肿瘤细胞）n提高靶向性（作用于特定组织或细胞）提高靶向性（作用于特定组织或细胞）n降低蛋白质类药物引起的免疫反应（人源化重组降低蛋白质类药物引起的免疫反应（人源化重组蛋白）蛋白）n获得具有新功能的蛋白质分子（不同功能的部分获得具有新功能的蛋白质分子（不同功能的部分重组）重组）n其他（提高药物稳定性、改善药代动力学特性、其他（提高药物稳定性、改善药代动力学特性、使之易于生产纯化，减低成本）使之易于生产纯化，减低成本）蛋白质工程技术在新药研究中应用：提高药效活性（蛋白质工程技术在新药研究中应用：提高药效活性（TNF杀伤肿瘤杀伤肿瘤7基因基因DNA氨基酸序列氨基酸序列多肽链多肽链蛋白质蛋白质三维结构三维结构预期功能预期功能生物功能生物功能mRNA转录转录翻译翻译折叠折叠DNA合成合成分子设计分子设计基因氨基酸序列蛋白质预期功能生物功能基因氨基酸序列蛋白质预期功能生物功能mRNA转录翻译折叠转录翻译折叠DN8三、蛋白质工程的基本步骤n分离提纯目标蛋白分离提纯目标蛋白n对目的蛋白进行氨基酸测序对目的蛋白进行氨基酸测序n借助核磁共振、生物质谱获得蛋白质的二级和三借助核磁共振、生物质谱获得蛋白质的二级和三级结构级结构n设计编码蛋白质的基因改造方案设计编码蛋白质的基因改造方案n对基因序列进行改造，并将经过改造的基因片段对基因序列进行改造，并将经过改造的基因片段采用基因重组技术获取该目的基因，表达新蛋白采用基因重组技术获取该目的基因，表达新蛋白产物产物n分离提纯新蛋白并对功能监测后投入应用分离提纯新蛋白并对功能监测后投入应用三、蛋白质工程的基本步骤分离提纯目标蛋白三、蛋白质工程的基本步骤分离提纯目标蛋白9蛋白质改造常用方法蛋白质改造常用方法生物技术制药生物技术制药n理性方法n非理性方法n随机广泛突变n分子重排n定位突变n区域性定向突变n从头设计蛋白质改造常用方法生物技术制药理性方法随机广泛突变定位突变蛋白质改造常用方法生物技术制药理性方法随机广泛突变定位突变10（一）定点突变改进蛋白质（一）定点突变改进蛋白质生物技术制药生物技术制药n基因人工定点突变是通过取代、插入或缺失基因DNA序列中任一特定的核苷酸序列来改造蛋白质的方法。n前提：已知蛋白质分子的结构和功能n分为三类：核苷酸引物诱变 盒式诱变 PCR诱变 （一）定点突变改进蛋白质生物技术制药基因人工定点突变是通过取（一）定点突变改进蛋白质生物技术制药基因人工定点突变是通过取11核苷酸引物诱变 以化学合成的含有突变核苷酸的核苷酸短以化学合成的含有突变核苷酸的核苷酸短片段为引物，对单链片段为引物，对单链DNA分子进行复制，分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子链的一个组成部分，新链便具有已子链的一个组成部分，新链便具有已发生突变的核苷酸序列。发生突变的核苷酸序列。核苷酸引物诱变核苷酸引物诱变 以化学合成的含有突变核苷酸的核苷酸短片段以化学合成的含有突变核苷酸的核苷酸短片段12盒式诱变n1985年年Wells提出的一种基因修饰技术，一提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行酸进行“饱和性饱和性”分析。分析。n利用目的基因序列中的适当限制性内切性利用目的基因序列中的适当限制性内切性酶酶切位点，插入各种合适的突变酶酶切位点，插入各种合适的突变DNA片片段，用以取代目标基因中特定的段，用以取代目标基因中特定的DNA片段。片段。盒式诱变盒式诱变1985年年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以提出的一种基因修饰技术，一次可以13酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒同时获得多个突变体同时获得多个突变体酶切割蛋白基因核苷酸片段新突变质粒同时获得多个突变体酶切割蛋白基因核苷酸片段新突变质粒同时获得多个突变体14PCR诱变n双链DNA变性 94 oC，1 minn 退火，引物结合 54 oC，45 sn 链延伸 72 oC，2 minPCR诱变双链诱变双链DNA变性变性15生物技术制药生物技术制药依赖高保真依赖高保真DNADNA高温聚高温聚合酶的合酶的PCRPCR直接点突变直接点突变生物技术制药依赖高保真生物技术制药依赖高保真DNA高温聚合酶的高温聚合酶的PCR直接点突变直接点突变16（二）采用融合蛋白技术改进蛋白质 概念：概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起所形成的蛋白质，其氨基端是结合在一起所形成的蛋白质，其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。原核序列，羧基端是真核序列。原则：将一个蛋白质基因序列的终止密码原则：将一个蛋白质基因序列的终止密码子删除，在接上带有密码子的第二个蛋白子删除，在接上带有密码子的第二个蛋白质基因，可实现质基因，可实现2个基因的融合表达。个基因的融合表达。（二）采用融合蛋白技术改进蛋白质（二）采用融合蛋白技术改进蛋白质 概念：是由一条短的原核概念：是由一条短的原核17调节基因启动基因结构基因连接酶连接酶完整基因调节基因启动基因结构基因连接酶完整基因调节基因启动基因结构基因连接酶完整基因18融合蛋白技术的内容n（1）进行目的基因的克隆，根据基因测序列互补原则，设计合理的引物序列，以cDNA为模版，利用PCR技术扩增不同的目的基因的DNA片段；n（2）在载体中进行重组，通过限制性内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，通过连接酶将两个具有相同末端酶切点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。n(3)将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选和测序。（4）融合基因的诱导表达及蛋白质的纯化。融合蛋白技术的内容（融合蛋白技术的内容（1）进行目的基因的克隆，根据基因测序列互）进行目的基因的克隆，根据基因测序列互19融合蛋白的应用：n靶向药物：（药物和可以与病灶特异结合的配基）将这两者融合，构成融合蛋白，它可以特异性地与靶细胞或治病因子结合，并把药物引导至病灶，提高药效。n构建多功能新细胞因子：利用基因融合技术创造出自然界原本不存在的活性更佳的细胞因子n改善药物半衰期（采用融合蛋白技术可直接操作分子大小的方法是蛋白质自身共价结合）：抗血栓的水蛭素（40倍）融合蛋白的应用：靶向药物：（药物和可以与病灶特异结合的配基）融合蛋白的应用：靶向药物：（药物和可以与病灶特异结合的配基）20其他2 2、水蛭素改造、水蛭素改造3 3、生长激素改造、生长激素改造4 4、胰岛素改造、胰岛素改造5 5、致癌酶的改造、致癌酶的改造6 6、金属硫蛋白的改造、金属硫蛋白的改造7 7、人白细胞介素、人白细胞介素-2-2的改造的改造8 8、组织纤溶酶原激活因子的改造、组织纤溶酶原激活因子的改造9 9、枯草杆菌蛋白酶的改造、枯草杆菌蛋白酶的改造其他其他2、水蛭素改造、水蛭素改造21第三课第三课基基 因因 工工 程程 制制 药药生生 物物 技技 术术 制制 药药Biotechnological Pharmaceutics第三课第三课The End生生 物物 技技 术术 制制 药药Biotechn22