荧光寿命测定的现代方法与应用课件

七彩的荧光七彩的荧光七彩的荧光1荧光及荧光分光光度计的发展荧光寿命的基本原理荧光寿命测定的现代方法及数据处理测定荧光寿命的一些应用测定荧光寿命的仪器主要内容主要内容荧光及荧光分光光度计的发展主要内容2 The emission of light from any substance is called luminescence.Some of the first scientific reports of luminescence appeared in the middle of the 18th century.In 1845,Herschel observed that an otherwise colourless solution of quinine(quinine absorbs in the UV region)in water emitted a blue colour under certain circumstances.In 1852 Sir G.G.Stokes studied the same compound and found that the emitted light has a longer wavelength than the light absorbed,the so-called Stokes shift.(first described fluorescence)In the 1920s and 1930s Jaboski investigated polarized light and fluorescence and was able to show that the transition moments in absorption and emission are two different things.The Development of Fluorescence The emission of light from 3 The first fluorescence microscopes were developed between 1911 and 1913 by German physicists Otto Heimstt and Heinrich Lehmann as a spin-off from the ultraviolet instrument.It wasnt until the early 1940s that Albert Coons developed a technique for labeling antibodies with fluorescent dyes,thus giving birth to the field of immunofluorescence.By the turn of the twenty-first century,the field of fluorescence microscopy was responsible for a revolution in cell biology,coupling the power of live cell imaging to highly specific multiple labeling of individual organelles and macromolecular complexes with synthetic and genetically encoded fluorescent probes.The Development of Fluorescence Microscopes The first fluorescence mic4 Basic theory of fluorescence Lifetime The photophysical processes that occur from absorption to emission are often shown in a so-called Jaboski diagram.Basic theory of fluorescence 5荧光寿命测定的现代方法与应用课件6 荧光荧光是分子吸收能量后其基态电子S0被激发到单线激发态S1或S2后由第一单线激发态S1回到基态S0时所发生的。荧光寿命荧光寿命是指分子在单线激发态 S1所平均停留的时间，或者说处于激发态S1的分子数目衰减到原来的1/e所经历的时间。由于荧光现象多发生在纳秒级,这正好是分子运动所发生的时间尺度,因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程,例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。荧光寿命的概念荧光寿命的概念 荧光是分子吸收能量后其基态电子S0被激发到单线激发态7荧光寿命测定的现代方法荧光寿命测定的现代方法 荧光寿命测定的现代方法主要有以下几种，即时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon Counting，TCSPC)、频闪技术(Strobe Techniques)、相调制法(Phase Modulation Methods)、条纹相机法(Streak Cameras)和上转换法(Upcon-version Methods)。荧光寿命测定的现代方法 荧光寿命测定的现代方法主要8时间相关单光子记数法时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-PhotonCounting,TCSPC)TCSPC 是目前主要应用的荧光寿命测定技术，1975 年由PTI(Photon Technology International)公司首先商品化。此外,Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。时间相关单光子记数法(Time-Correlated Sin9时间相关单光子记数法时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-PhotonCounting,TCSPC)TCSPC 的工作原理如图所示电信号电信号累积电压信号停止工作荧光时间相关单光子记数法(Time-Correlated Sin10 以光子数对时间作图可得到如图所示的直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。时间相关单光子记数法时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-PhotonCounting,TCSPC)以光子数对时间作图可得到如图所示的直方图,此图经过平11时间相关单光子记数法时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-PhotonCounting,TCSPC)实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积”效应(Pileup Effect)。“堆积”效应是指荧光衰减曲线向短寿命一方偏移的现象。为了避免堆积效应,实际测定时,多道分析仪存储的光子数大致只有光源脉冲数的1%。也就是说,光源100 次脉冲,大约只有1 次所引发的荧光被检测。时间相关单光子记数法(Time-Correlated Sin12 TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差小,是目前最流行的荧光寿命测定方法。但是这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。时间相关单光子记数法时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-PhotonCounting,TCSPC)TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高、测定结果13频闪技术(Strobe Techniques)频闪技术也叫脉冲取样技术(Pulse Sam-pling Techniques)，1987 年PTI 公司将纳秒级频率荧光寿命测定仪商品化。最近PTI 公司推出了新一代频闪分时光谱仪。脉冲取样法测定荧光寿脉冲取样法测定荧光寿命工作原理如下图所示。命工作原理如下图所示。(a)工作原理图(b)检测时间门与荧光衰减关系示意图频闪技术(Strobe Techniques)频14频闪技术(Strobe Techniques)的优缺点：新一代频闪分时光谱仪有着TCSPC 的准确性，比相调制测定速度更快，操作也很方便，仪器价格也大大降低。不过脉冲法得到的荧光衰减曲线包含噪音的水平尚无法知道，在数据分析时应当有所估计。频闪技术频闪技术(Strobe Techniques)频闪技术(Strobe Techniques)的优缺点：频闪15荧光寿命测定中的数据处理荧光寿命测定中的数据处理 1、荧光寿命及其含义、荧光寿命及其含义 假定一个无限窄的脉冲光(函数)激发n0 个荧光分子到其激发态,处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态，两种衰减跃迁速率分别为和knr，可得到激发态物种的单指数衰减方程。n(t)=n0 exp(-t/)(1)式中为荧光寿命。由于荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改写为:I(t)=I0 exp(-t/)(2)其中I0 是时间为零时的荧光强度。于是,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数:=(+knr)-1(3)也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光强度的对数对时间作图,直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以理解为荧光物种在激发态S1的统计平均停留时间。荧光寿命测定中的数据处理1、荧光寿命及其含义163、卷积积分、卷积积分 实际测定得到的荧光衰减曲线N(tk)是仪器响应函数L(tk)和真实荧光衰减函数I(t)的卷积。即 N(tk)=L(tk)I(t)第三条曲线是实测荧光强度衰减曲线的拟合函数Nc(tk)。荧光寿命测定中的数据处理荧光寿命测定中的数据处理时间/ns光子数上图 给出用TCSPC 法测得的闪烁体(Scintil-lator)2,5-二苯基-1,3,4-二唑(2,5-diphenyl-1,3,4-oxadiazole,PPD)的荧光强度衰减曲线及其拟合。3、卷积积分荧光寿命测定中的数据处理时间/ns光子数上图 174、数据分析、数据分析 数据分析的目的在于,通过拟合实验所得荧光衰减曲线,建立一种最能揭示荧光衰减本质、描述衰减过程的理论模型,从而对所研究体系作出深刻的理解。随着时间分辨荧光技术日益发展,人们相继提出了多种荧光衰减数据分析方法。例如:非线性最小二乘法、矩法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等。荧光寿命测定中的数据处理荧光寿命测定中的数据处理 利用解卷积的办法可得到脉冲响应函数I(t),进而求得描述样品荧光衰减本质的荧光寿命()等有关参量。4、数据分析荧光寿命测定中的数据处理 利用解卷积的18荧光寿命测定的应用荧光寿命测定的应用 荧光技术荧光技术分为静态荧光技术静态荧光技术和时间分辨荧光技术时间分辨荧光技术。静态荧光技术固然重要,但是静态技术给出的只是平均化结果,平均化过程丢掉了有关分子运动的动态信息。所以时间分辨荧光技术较为常用.时间分辨荧光技术的应用时间分辨荧光技术的应用:1、可以揭示荧光猝灭是自由扩散控制还是特异性结合控制。2、研究供体和受体间的能量转移时,不仅可以得到能量转移效率,而且可以揭示受体在供体周围的分布形式。3、揭示荧光猝灭是自由扩散控制还是特异性结合控制。4、研究许多分子间或分子内的弱相互作用信息,特别是动态信息。5、对于表面活性剂类两性分子在溶液或界面上的组装、纳米材料在储存过程中的相互聚集、蛋白质或其它大分子在固液界面吸附过程中的构象调整、大分子与大分子,大分子与小分子,大分子与金属离子等相互作用所引起的大分子构象变化以及这种变化发生的程度和部位位等重要问题可能通过时间分辨荧光技术进行深入研究。荧光寿命测定的应用 荧光技术分为静态荧光技术和时间分19分子荧光光度计用于测定荧光寿命的仪器用于测定荧光寿命的仪器分子荧光光度计用于测定荧光寿命的仪器20合式荧光寿命与稳态荧光光谱仪合式荧光寿命与稳态荧光光谱仪21SK-830型原子荧光光谱仪型原子荧光光谱仪用于测定荧光寿命的仪器用于测定荧光寿命的仪器SK-830型原子荧光光谱仪用于测定荧光寿命的仪器22荧光寿命测定仪荧光寿命测定仪用于测定荧光寿命的仪器用于测定荧光寿命的仪器荧光寿命测定仪用于测定荧光寿命的仪器23C-700型荧光寿命分析仪_大连理工大学用于测定荧光寿命的仪器用于测定荧光寿命的仪器C-700型荧光寿命分析仪_大连理工大学用于测定荧光24Thank You25