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第五章 环境化学物的特殊毒性及其评价【目的要求】掌握外源化学物的致突变作用 熟悉致突变作用评价方法 了解致突变作用的遗传学基础 掌握致癌作用概念及其机制 熟悉致癌化学物分类 熟悉致癌作用评价方法 掌握发育毒性与致畸作用基本概念 掌握发育毒性与致畸作用的特点和作用机制 熟悉发育毒性与致畸作用试验与评价方法【内容】基本概念：突变、遗传毒理学、致突变作用、致突变物 致突变的类型：基因突变、染色体结构异常、染色体数目异常 化学致癌机制、化学致癌物分类、观察致癌作用的基本方法发育毒性与致畸作用基本概念、致畸作用机制、发育毒性和致畸作用常用评价方法：第一节 致突变作用【内容】基本概念：突变、遗传毒理学、致突变作用、致突变物 致突变的类型：基因突变、染色体结构异常、染色体数目异常 致突变作用机制突变的后果：生殖细胞突变，体细胞突变致突变试验一、基本概念突变（mutation)：是指遗传结构本身的 变化及其引起的变异即生物体的遗传物质发生了突然的、根本的、遗传的变化，因为这种变化起源于基因和染色体，因此，是可遗传的变异1901年DeVries 首次提出突变这一术语 1909年摩乐根发现在红眼果蝇中有白眼果蝇 1904年DeVries 发现X射线可以改变生殖细胞的遗传物质1927年Muller 用X射线照射发现可以引起基因突变1943年Averbach&Robson发现芥子气可诱发基因和染色体畸变1951年用X射线可诱发小鼠突变1966年Russed证明化学物也可诱发小鼠突变1969年Guttanach主持成立国际环境诱变剂学会根据突变发生的原因，可以将突变分为：1、自发突变(spontaneous mutation):是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。(特点是发生过程长、频率很低，与物种进化有关)2、诱发突变(induced mutation)：是指人 为地造成突变。(特点是发生过程短、频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害)遗传毒理学(genetic toxicology)：研究化学性和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物可能引起的健康效应的科学。致突变作用（mutagenesis)：是指外来因 素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。致突变物(mutagen)：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。遗传毒物（genotoxic agent)：由于致突变物能损伤遗传物质，因此致突变物又称为遗传毒物。直接致突变物（direct-acting mutagen)：具有很高的化学活性，其原型就可引起生物体突变的物质。间接致突变物（indirect-acting mutagen)：本身不能引起突变，必须在体内经过代谢活化，才具有致突变性的物质。二、遗传损伤类型 突变的基础是遗传物质DNA的改变，根据DNA改变牵涉范围的大小，可将遗传物质的突变或者叫遗传物质的损伤分为三大类：基因突变 染色体结构改变 染色体数目改变从机理角度认为：基因突变和染色体畸变是对DNA为靶的损伤，染色体数目异常是以有丝分裂或减数分裂器为靶的损伤。1、基因突变（genetic mutation)：是指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变。可分为碱基置换、移码突变、整码突变和片断突变等基本类型 碱基置换（base subsititution)：是指DNA序列上的某个碱基被其它碱基所取代。转换(transition)：即嘌呤与嘌呤，嘧啶与 嘧啶之间的置换；颠换（transversion):即嘌呤到嘧啶或嘧啶 到嘌呤的置换。ATCGGCGTGACGATCATATAT转换与置换的后果取决于碱基置换是否在蛋白质转换与置换的后果取决于碱基置换是否在蛋白质合成过程中引起编码氨基酸的错误。合成过程中引起编码氨基酸的错误。同义突变同义突变(missense mutation)missense mutation)：指没有改变基因：指没有改变基因产物氨基酸序列的改变产物氨基酸序列的改变 错义突变错义突变（synonymous mutation)synonymous mutation)：指碱基序列：指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变的改变引起了产物氨基酸序列的改变 无义突变无义突变(nonsense mutation)(nonsense mutation)：指某个碱基的改：指某个碱基的改变使代表某个氨基酸的密码子变为蛋白质合成的变使代表某个氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致多肽链在成熟之前终止合成的终止密码子，导致多肽链在成熟之前终止合成的改变改变终止密码突变 链终止突变：指无义突变使肽链过早终止 延长突变：指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，结果产生过长的肽链的现象错义突变：致死突变：发生在必需基因上，严重影响蛋白质功能的错义突变 渗漏突变：突变的产物仍有部分活性，表现型介于突变型与野生型之间 中性突变：突变不影响或基本不影响蛋白质的功能，性状改变不明显 移码突变（frameshift mutation)：指发生一对或几对不等于3的倍数的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译为不正常的氨基酸。由于碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间并无标点符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变 整码突变(Codon mutation)又称为密码子的插入或缺失,指在DNA链中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子,此时基因产物多肽链中会增加或减少一个或多个氨基酸,而此部位之后的氨基酸序列无改变.片断突变:指基因中某些小片段核苷酸序列发生改变,这种改变有时可跨越两个或多个基因,主要包括核苷酸片段的缺失、重复、重组及重排等.2、染色体突变（structural chromosome aberration)：是指由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失或引起各种重排，从而出现染色体结构异常。断裂剂：凡能引起染色体断裂的物质 断裂作用：染色体断裂的发生或过程染色体突变又可分为 染色体突变（chromosome-type aberrations)：指染色体中两条染色单体同一位点受损后所产生的结构异常 染色单体突变（chromatid-type aberrations)：指畸变涉及复制染色体中两条染色单体中的一条染色体突变类型：染色体突变类型：(1)(1)裂隙和断裂：都是指染色体上狭窄的非染色裂隙和断裂：都是指染色体上狭窄的非染色带，带，过去以带宽超过染色单体宽度为断裂，不超过去以带宽超过染色单体宽度为断裂，不超过者为裂隙；过者为裂隙；(2)(2)无着丝粒断片和缺失无着丝粒断片和缺失 ：一个染色体发生一次：一个染色体发生一次或多次断裂而不重或多次断裂而不重 接，并且这些已断裂的节段远接，并且这些已断裂的节段远远分开，远分开，就会出现一个或多个无着丝粒断片和就会出现一个或多个无着丝粒断片和 一一个缺失了部分染色质并带有着丝粒的异常染色体，个缺失了部分染色质并带有着丝粒的异常染色体，后者称为带着丝粒断片后者称为带着丝粒断片常将无着丝粒断片简称为断片，在下一次细胞分裂时断片因无着丝粒，故不能进入分裂的核中而滞留在细胞质中，称为微核。如断片很小，小于染色单体宽度，则称为微小体(3)环状染色体：染色体两臂各发生一次断 裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体(4)倒位：当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180度再重接，称为倒位(5)插入和重复：当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入(6)易位：从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位3、基因组突变(genomic mutation)指基因组中染色体数目异常。每一种属机体细胞中染色体数目是一致的，而且正常体细胞染色体数目都是成双成对的，一对是单倍体，两对是二倍体，多对是多倍体染色体数目异常可能表现为整倍性畸变和非整倍性畸变 整倍性畸变可能出现单倍体、三倍体或四倍体。超过二倍体的整倍性畸变也统称为多倍体。非整倍性畸变系指比二倍体多或少一条或多条染色体 缺体是指缺少一对同源染色体，单体或三体系指某一对同源染色体相应地少或多一个，四体则指其比同源染色体多一对；于是在染色体数目上相应 为2n-2、2n-1，2n+1和2n+2三、致突变作用机理外源化合物引起基因突变和染色体突变的靶主要是DNA，而导致非整倍体及整倍体的靶主要是有丝分裂或减数分裂器1、DNA损伤与突变：(1)碱基损伤 碱基错配 烷化剂(alkylating agent):是指对DNA、蛋白质具有强烈烷化作用的物质.一般情况下甲基化乙基化高碳烷基化 烷化剂烷化剂又称又称“烃化剂烃化剂”，一类化学性质很活泼的化合物。，一类化学性质很活泼的化合物。分子中具有活泼的烷化基团，能与细胞中分子中具有活泼的烷化基团，能与细胞中 DNADNA或或蛋白质分子的氨基、巯基、羟基、羧基和磷酸基蛋白质分子的氨基、巯基、羟基、羧基和磷酸基等起作用，以其本身的烷基取代这些基团的氢原等起作用，以其本身的烷基取代这些基团的氢原子而起烷化反应。子而起烷化反应。双功能的氯乙胺基，在体内能将氯解离出来，形双功能的氯乙胺基，在体内能将氯解离出来，形成游离基或羟基环化形成具有高度活性的乙撑亚成游离基或羟基环化形成具有高度活性的乙撑亚胺离子，并与胺离子，并与 DNADNA两条互补链上的每个鸟嘌呤的两条互补链上的每个鸟嘌呤的7 7位氮相结合；或使复制的核碱配对错码；或引起位氮相结合；或使复制的核碱配对错码；或引起脱嘌呤作用；或形成交叉联结；或使脱嘌呤作用；或形成交叉联结；或使DNADNA断裂，断裂，造成造成DNADNA结构和功能损害，重者可致细胞死亡。结构和功能损害，重者可致细胞死亡。目前认为最常受到烷化的是 鸟嘌呤的N7位，其次是O6位 腺嘌呤的N1、N3和N7也易烷化 AP位点（apurinic or apyrimidinic site)：是指丢失碱基的DNA留下了一个无嘌呤或无嘧啶的位点(2)平面大分子嵌入DNA链:嵌入剂（intercalating agent)：指能以静电 吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA 双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间的物质。如丫啶类染料分子多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为6.8102 nm，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍 通常引起移码突变(3)碱基类似物取代:有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物 它们能在S期中可与天然碱基竞争，并取代其位置 例如5溴脱氧尿嘧啶核苷能取代胸腺嘧 啶；2氨基嘌呤(2-AP）能取代鸟嘌呤(4)碱基的化学结构的改变或破坏:化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏或改变碱基的结构，基于引起链断裂 有些化学物质可在体内形成有机过氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡碱等，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂2、非整倍体及整倍体的诱发 一些化学物能作用于纺锤体，中心粒或其他核内细胞器，从而干扰有丝分裂过程，造成细胞分裂异常，染色体数目增加或减少，诱发非整倍体或整倍体 诱发这种作用的物质称为分裂毒物，又称干扰剂3、DNA损伤的修复与突变并不是所有的DNA损伤都表现为突变，在生命进化过程中，生物体具有了应对各种DNA损伤的修复及耐受机制。DNA受损后，机体利用自身的修复系统进行修复，不能被修复的损伤可能被固定下来并传递给后代，才会引起突变。这个过程中需要有一系列的修复酶参加。(1)光复活（photoreactivation)：修复紫外 线损伤产生的胸腺嘧啶二取聚体，广泛存在原核和真核生物体内(2)“适应性”反应：主要是O 6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT)修复鸟嘌呤 O 6 位的烷基化损伤(3)切除修复识别：糖基化酶识别异常的碱基，随后使异常嘌呤的N-9位或异常嘧啶的 N-3位与脱氧核糖之间的键发生水解，形成无嘌呤或嘧啶的位点（apurinic-apyrimidinic site,AP位点）插入酶将正确碱基插入AP位点 DNA聚合酶合成DNA片段，填补空缺 DNA连接酶将新合成的片段接上(4)呼救性修复（SOS修复）:诱导性修复 修复过程有明显的错误 SOS系统为多基因控制易错修复（error-prone repair)：是指突变作为修复的结果或作为损伤旁路发生的DNA修复 光复活、适应性修复和切除修复倾向于无误修复 SOS修复就是易错修复DNADNA损伤修复的一般特点损伤修复的一般特点:DNADNA损伤不仅可因外源性因素所致，损伤不仅可因外源性因素所致，也可因内源也可因内源性因素所致性因素所致 不同类型不同类型DNADNA损伤通过不同的损伤通过不同的DNADNA修复途径修复修复途径修复 不同类型不同类型DNADNA损伤修复速度是不同的损伤修复速度是不同的DNADNA损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导的的DNADNA损伤修复功能存在物种和个体差异损伤修复功能存在物种和个体差异四、突变的后果突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞 体细胞：其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到下一代 生殖细胞：其影响有可能遗传到下一代五、致突变作用的评价致突变试验的目的:（1）检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性（2）检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人类的遗传危险性 1、观察项目的选择(1)观察效应终点的类型：DNA碱基序列改变（基因突变）染色体完整性改变（染色体畸变）染色体分离改变（非整倍体和多倍体）DNA完整性改变、重排或交换（DNA损伤试验）(2)试验组合的原则:试验组应包括每一类型的遗传学终点，如细胞回复突变试验、微核试验、细菌 DNA修复试验和体外姐妹染色单体交换试验（SCE)，这一组试验包括主要类型遗传学终点试验组中的指示生物应包括几个进化阶 段，至少要包括原核细胞与真核细胞两个系统试验组应包括体内试验与体外试验，体外试验（+S9和-S9)预测遗传危害时，应包括体细胞和性细胞试验2、常见致突变实验(1)鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力 组氨酸突变菌(his-)：在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长 回复突变成野生型(his+)：可在不含组氨酸的最低营养平皿上生长标准试验菌株有四种：TA97 和TA98 检测移码突变、TA100 检测碱基置换突变、TA102 对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感 这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性结果判断 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认 为受试物是致突变物 仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物 不加S 9 混合液得到阳性结果，说明受试 物是直接致突变物 加S 9 混合液才得到阳性结果，说明该受 试物是间接致突变物(2)微核试验（micronucleus test，MNT)微核（micronucleus):是指染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为一个或几个规则的次核 常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)做微核试验 PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，故为骨髓微核试验的首选细胞群(3)单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis，SCGE)在单细胞水平上定量检测DNA损伤 原理：在电泳槽中，DNA断片在电场的作用下，由细胞核中移出，并向阳极泳动，经荧光染色后见到细胞核和移出的DNA断片，形成有如彗星一样的彗星头和彗星尾，故又称彗星试验（comet test)（4）哺乳动物细胞基因突变试验（5）染色体畸变试验（6）显性致死试验（7）小鼠精子畸形试验（8）程序外DNA合成试验（UDS）（9）转基因动物突变试验3、致突变试验中的一些问题（1）阴性、阳性对照的设立：阴性对照：即未处理对照或溶剂对照 阳性对照：用某种已知能产生阳性反应的物质作对照（2）体外试验活化系统的采用 S9：是指经酶诱导剂处理大鼠后制备的 肝匀浆，再经9,000 g离心分离所得上清液，其中含有微粒体和胞溶质 S9混合液（S9 mix):在S9中再加入一些 辅助因子（如NADP、葡萄糖-6-磷酸等）肝S9的主要成分是混合功能氧化酶（3）致突变试验的质量控制措施阴性对照和阳性对照的设立 资料的统计学分析 试验结果的重现性（4）阴性结果的判定条件 最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量 各剂量的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些外源化学物 阳性结果应当具有剂量-反应关系，即剂量越高，致突变效果越大，并在一组或多组的观察值与阴性对照之间有显著差异环境基因组计划（EGP）EGP与HGP的关系HGP是探索历史的伟大壮举之一，是对人类自身内部的探索，而不是探索行星和宇宙等外部世界 HGP已于2003年4月完成。现在我们可以阅读构筑人类自身的自然的完全的遗传学蓝图(complete genetic blueprint)EGP计划的目标和内容不同于HGP HGP重于疾病基因的研究 EGP是对环境危险因素遗传易感性的探讨，更加精确地识别导致疾病的环境病因与暴露的真实危险性,即其侧重于疾病的预防但EGP很大程度上要依赖HGP发展起来的技术以进行基因序列的分析，同时二者的研究成果可相互补充；而且EGP将对后基因组计划基因功能的研究提供有益的信息。EGP拟研究的环境相关疾病（七 类）癌症（肺癌、膀胱癌、乳腺癌及前列腺癌）癌症（肺癌、膀胱癌、乳腺癌及前列腺癌）呼吸系统疾病（哮喘、纤维囊性肿）呼吸系统疾病（哮喘、纤维囊性肿）退行性神经系统疾病（早老性痴呆、帕金退行性神经系统疾病（早老性痴呆、帕金 森综森综合征、肌萎缩内侧硬化症）合征、肌萎缩内侧硬化症）发育障碍（智力低下、多动症）发育障碍（智力低下、多动症）先天缺陷（口面裂）先天缺陷（口面裂）生殖功能缺陷（不育、子宫肌瘤、子宫生殖功能缺陷（不育、子宫肌瘤、子宫 内膜异内膜异位、青春期早熟）位、青春期早熟）自身免疫疾病（全身性红斑狼疮、多发自身免疫疾病（全身性红斑狼疮、多发 性硬化性硬化症）症）第二节 致癌作用内容：化学致癌机制：与致癌作用有关的代谢；化学致癌作用的分子机制；化学致癌过程；非遗传毒性机制 化学致癌物分类：IARC按证据分类；根据机制分类；其他分类 观察致癌作用的基本方法：短期试验、长期试验、人群流行病学调查 肿瘤是一类严重影响人类健康和生命的疾病恶性肿瘤已成为人类死亡的第一位或第二位原因，每年全世界约有700万人死于癌症 我国恶性肿瘤在各种死因中排列第二 位，城市已排列首位 肿瘤是可以预防的肿瘤发生过程是宿主与环境之间发生复杂的、动态的肿瘤发生过程是宿主与环境之间发生复杂的、动态的相互作用过程相互作用过程 重要的宿主因素重要的宿主因素-遗传构成和健康状况遗传构成和健康状况主要的环境因素主要的环境因素-食物、环境污染、职业和生活方食物、环境污染、职业和生活方式（如饮食习惯、吸烟等）式（如饮食习惯、吸烟等）一般估计，一般估计，80%80%90%90%的人类肿瘤与环境有关，其中的人类肿瘤与环境有关，其中主要是化学因素主要是化学因素 要降低肿瘤的发生率，首先必须识别、鉴定化学致癌要降低肿瘤的发生率，首先必须识别、鉴定化学致癌因素和有害的生活方式，阐明其作用机理，然后采取因素和有害的生活方式，阐明其作用机理，然后采取措施加以防治研究化学致癌作用具有重要的作用措施加以防治研究化学致癌作用具有重要的作用研究化学致癌作用具有重要的作用要降低肿瘤的发生率，首先必须识别、鉴定化学致癌因素和有害的生活方式，阐明其作用机理，然后采取措施加以防治化学致癌作用：化学物质引起正常细胞发生恶化转化并发展成为肿瘤的作用。化学致癌物：具有化学致癌作用的化学物质。毒理学中“癌”的概念是广义的，包括上皮细胞的恶性病变（癌）、间质细胞的恶性病变（肉瘤）和良性肿瘤。一、化学致癌机制1 1、化学致癌的遗传机制学说、化学致癌的遗传机制学说化学致癌物进入细胞后作用于遗传物质，通过造成化学致癌物进入细胞后作用于遗传物质，通过造成DNADNA损伤而引发肿瘤的遗传毒性机制损伤而引发肿瘤的遗传毒性机制致癌作用是复杂的、多阶段、多基因参与、长期累致癌作用是复杂的、多阶段、多基因参与、长期累积的过程，涉及基因表达、细胞生理和生化等多种积的过程，涉及基因表达、细胞生理和生化等多种变化变化 从本质上说，肿瘤是一种遗传物质改变导致的疾病，从本质上说，肿瘤是一种遗传物质改变导致的疾病，即遗传病即遗传病大多数环境因素的致癌作用都是通过影响遗传基因大多数环境因素的致癌作用都是通过影响遗传基因起作用的，肿瘤是细胞中多种基因突变累积的结果起作用的，肿瘤是细胞中多种基因突变累积的结果(1)多阶段学说：癌变过程可能是多阶段的，引发阶段（initiation)促长阶段(promotion)进展阶段(progression)引发阶段的主要特征引发阶段的主要特征 ：不可逆不可逆 需要通过细胞分裂加以固定需要通过细胞分裂加以固定 剂量剂量-反应显示没有可测定的阈值，无可测定的最反应显示没有可测定的阈值，无可测定的最大反应大反应 存在自发的引发作用存在自发的引发作用 对外源性化学物质和其他化学因素敏感对外源性化学物质和其他化学因素敏感 引发作用必须发生在促长作用之前，引发作用必须发生在促长作用之前，“纯纯”引发引发作用在无促长时不导致肿瘤作用在无促长时不导致肿瘤促长阶段的主要特征：促长阶段的主要特征：可逆可逆 促长剂通常是非致突变物，需要持续和反复暴露促长剂通常是非致突变物，需要持续和反复暴露 促长剂的有效性仅出现在引发作用之后促长剂的有效性仅出现在引发作用之后 促长细胞群（促长细胞群（promoted cell population)promoted cell population)的存在取的存在取决于促长剂的持续存在决于促长剂的持续存在剂量剂量-反应显示有可测定的阈值，有可测定的最大反应显示有可测定的阈值，有可测定的最大效应效应 对饮食和激素等因素敏感对饮食和激素等因素敏感 促长作用的相对效力取决于达到最大效应的时间促长作用的相对效力取决于达到最大效应的时间和剂量速率和剂量速率进展阶段的主要特征：进展阶段的主要特征：不可逆不可逆伴随生长率和侵袭性的增加出现核型异常伴随生长率和侵袭性的增加出现核型异常有可测定的和有可测定的和/或形态学可描述的细胞基因组的改变或形态学可描述的细胞基因组的改变进展的早期阶段对环境因素敏感进展的早期阶段对环境因素敏感可见良性和可见良性和/或恶性肿瘤或恶性肿瘤促进展剂可促进细胞进入该阶段，但可能不是引发剂促进展剂可促进细胞进入该阶段，但可能不是引发剂 可以发生自发的进展作用可以发生自发的进展作用(2)癌基因学说：如果调控细胞繁殖和分化的基因发生异常便可导致细胞行为紊乱，形成肿瘤，与形成细胞恶性转化有关的基因主要由癌基因和肿瘤抑制基因。癌基因（oncogene)：指一类在自然或实验条件下具有诱发恶性转化的潜在基因。癌基因是化学致癌物作用的靶分子 在细胞癌变过程中发挥关健作用 指导合成的蛋白质能促成细胞恶性表型的形成 原癌基因（proto-oncogene)：指机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传信息，即癌基因的原型 在正常情况下，原癌基因呈静止状态，对细胞无害且具有重要生物学功能，如生长因子、受体、信号分子、转录因子和细胞周期调节等。抑癌基因（anti-oncogene)：又称为肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene)指对细胞生长、增殖和分化起负性调节基因 抑癌基因的功能是使正常细胞以及肿瘤细胞分化避免增殖过多，通过减少增殖或增加凋亡。抑癌基因失活 肿瘤细胞增殖失控 正常情况抑癌基因具有多种多样的细胞功能，如P53 遗传毒性致癌物主要通过原癌基因突变从 而激活为癌基因或/和抑癌基因突变从而失 活引起致癌作用。癌基因激活，导致肿瘤的阳性增殖，原癌基因突变为癌基因后通常过度表达 癌基因的两个等位基因中的单个基因突变可以影响细胞表型抑癌基因的产物能阻断肿瘤的细胞生长，抑癌基因突变后丧失其功能 抑癌基因的两个等位基因都必须失活才能改变细胞的表型2、化学致癌的非遗传机制学说：对DNA以外靶分子作用的非遗传毒性机制，这些非遗传性致癌物包括免疫抑制剂、石棉、激素、苯巴比妥等通过非遗传的途径发挥作用，影响细胞的正常分裂繁殖和消亡。二、环境化学致癌物的分类1.根据致癌物在体内发挥作用的方式分类 直接致癌物（direct carcinogen)间接致癌物（indirect carcinogen)前致癌物（precarcinogens):近致癌物(proximate csrcinogens)终致癌物(ultimate carcinogens)2.按致癌物的作用机理分类遗传毒性致癌物：烷化剂、镍、镉、多环芳烃、亚硝胺、芳基胺 非遗传毒性致癌物：促长剂、激素、免疫抑制剂、塑料、石棉 其它物质：乙醇、二恶烷3.根据对人和动物的致癌性分类国际癌症研究中心（IARC）根据对人类研究资料、动物资料和遗传毒理学资料，将致癌因素分为：对人类是致癌物（I类）88种 对人类很可能是致癌物（IIA类）64种 对人类可能是致癌物（IIB类）236种 现有证据不能对人类致癌性进行分类（III类）496种 对人类可能是非致癌物（IV类）1种（己内酰胺）4.4.根据对人和动物致癌性的其他分类：根据对人和动物致癌性的其他分类：确定致癌物确定致癌物（proved carcinogenproved carcinogen）指人和动物都）指人和动物都有充分、明确的证据，表明对人有致癌性有充分、明确的证据，表明对人有致癌性 可疑致癌物可疑致癌物（suspected carcinogensuspected carcinogen）指仅有个）指仅有个别临床报告，但在人群流行病学调查中未得到确切别临床报告，但在人群流行病学调查中未得到确切肯定的因果关系；或仅在多种动物、特别是与人类肯定的因果关系；或仅在多种动物、特别是与人类血缘相似的灵长目动物致癌试验阳性的化学物血缘相似的灵长目动物致癌试验阳性的化学物 潜在致癌物潜在致癌物（potential carcinogenpotential carcinogen）指在人群中）指在人群中尚无充分资料说明人有致癌性，但有充分的动物致尚无充分资料说明人有致癌性，但有充分的动物致突变资料的化学物质突变资料的化学物质5.根据化学物的结构或类型分类：烷化剂、多环芳烃类、芳香胺类、氨基偶氮染料、亚硝胺类化合物、植物毒素、金属致癌物三、化学致癌作用的评价1、化学致癌物判断的证据：(1)人群流行病学调查：必须具备两项以上 由不同研究者在不同地点、不同对象中以不同调查方法获得的结论相符的证据(2)动物实验证据：至少有两项按现行常规 设计进行，符合国家标准实验室GLP规范，在不同物种动物所得结果一致的动物致癌物鉴定资料2、常用的致癌物判断方法：A.短期试验 B.动物长期致癌试验 C.人类流行病学调查D.转基因动模致癌检测模型A.短期试验 致突变试验 化学物致突变性与致癌性关系 对致癌物筛查 无法检测非遗传毒性的致癌物（假阴性）和具有遗传毒性的非致癌物（假阳性）一组试验检测体外短期筛选试验Ames试验 大肠杆菌回复突变试验 大肠杆菌DNA修复试验 果蝇伴性隐性致死试验 哺乳类细胞体外染色体分析哺乳类细胞体外SCE试验 V79细胞体外HTRP突变试验 啮齿动物骨髓细胞染色体分析（或微核试验）啮齿动物显性致死试验细胞转化试验 细胞转化试验：指受试物与正常细胞在体外接触，如有致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生变化，发生与癌细胞相似的过程。优点：可以弥补致突变试验的不足，可检测遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物。哺乳动物体内短期致癌试验：l 啮齿动物肝脏转变灶诱发试验l 小鼠肺肿瘤诱发试验l 小鼠皮肤肿瘤诱发试验l 雌性大鼠乳腺癌诱发试验B.动物长期致癌试验动物选择 选择敏感动物：诱发肿瘤的易感性 年龄：断乳或断乳不久动物 性别：雌雄各半 动物数：一般每组动物数为雌雄各50只剂量设计 3个染毒组 无作用剂量组 阈剂量组 发生肿瘤剂量组 1个对照组（溶剂组）期限：长期或终生 大鼠,2年；小鼠,1.5 年 结果观察，分析和评定 致癌试验常用的指标：肿瘤发生率：最重要指标 多发性：是指一个动物出现多个肿瘤或 一个器官出现多个肿瘤 潜伏期：通常用各组第一个肿瘤出现的 时间为该组潜伏期 长期致癌试验设计最低要求：两种动物 两种性别 三个剂量组，其中一个接近最大耐受量 每组动物数至少50只C.人群流行病学调查 是确定人类致癌物的唯一方法 利用肿瘤生物标记进行调查 观察指标多为化学致癌作用的结果D.转基因动模致癌检测模型 转基因动物突变测试系统 过量表达癌基因的转基因动物 缺乏肿瘤抑制基因的转基因动物n 动物致癌物的确定 两种或两种以上种系动物阳性两种或两种以上种系动物阳性 一种种属但经两次或多次独立试验为阳性一种种属但经两次或多次独立试验为阳性 一种种属一次试验，但发生率高、多个部位发生、一种种属一次试验，但发生率高、多个部位发生、出现罕见类型肿瘤、诱发肿瘤的时间短出现罕见类型肿瘤、诱发肿瘤的时间短n 人类致癌物的确定 能够重复的肿瘤流行病学调查结果能够重复的肿瘤流行病学调查结果 有剂量有剂量-反应关系反应关系 动物致癌试验阳性动物致癌试验阳性已鉴定的人类主要环境致癌因素 化学致癌物：如香烟烟雾中的化学致癌物 饮食中的污染物：如黄曲霉毒素B1 物理因素：如紫外线、石棉、氡 致病菌和病毒：如幽门螺旋菌、人乳头状 瘤病毒、人乙肝和丙肝病毒 某些生活方式：如吸烟、过度暴露于阳光、过度脂肪摄入等第三节 生殖发育毒性及其评价【目的要求】掌握发育毒性与致畸作用基本概念 掌握发育毒性与致畸作用的特点和作用机制 熟悉发育毒性与致畸作用试验与评价方法 发育毒理学（developmental toxicology）研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直至性成熟的发育过程中，由于出生前接触导致异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制和结果 是毒理学的重要分支学科神话人物如独眼巨人、海妖等的原型可能来自严重畸形的婴儿 Hybrid theory(杂交理论)认为畸形是人和动物杂交的结果,并且这种杂交动物广泛存在于神话传说中，如人头马身 怪物、人身牛头等“teratology（畸形学）”来自于希腊 语“monster（怪胎）”，即“teras（畸胎）”1651年，William Harvey提出发育障碍学说：畸形起因于器官或结构的不完全发育对人类具有致畸作用的因素 动物实验表明，具有致畸作用的化学物有2500多种(1995年Shepard)肯定的人类致畸因素仅数十种，其中化学物或药物30多种 电离辐射(放射治疗、放射性碘等)化学物和药物：镇静安眠药，抗惊厥药，抗抑郁药，致幻药和毒品，抗癌药，维生素A类似物等 吸烟 病毒感染等 母体代谢失调(克汀病、糖尿病、高烧、苯丙酮尿症、酒精中毒等)反应停(thalidomide)事件1953年，联邦德国一家名为ChemieGruenenthal的制药公司研究人员发现,反应停具有一定的镇静安眠作用，而且对孕妇怀孕早期的妊娠呕吐疗效极佳 1957年10月1日该公司将反应停正式推向市场 反应停便成了“孕妇的理想选择”（当时的广告用语），在欧洲、亚洲、非洲、澳洲和南美洲被医生大量处方给孕妇以治疗妊娠呕吐 令人恐怖的副作用到了到了19601960年，欧洲的年，欧洲的医生们开始发现，本医生们开始发现，本地区畸形婴儿的出生地区畸形婴儿的出生率明显上升。率明显上升。这些婴这些婴儿有的是四肢畸形儿有的是四肢畸形(主主要是双上肢的短肢畸要是双上肢的短肢畸形形)，有的是腭裂，有，有的是腭裂，有 的是盲儿或聋儿，还的是盲儿或聋儿，还有的是内脏畸形有的是内脏畸形 支付巨额赔偿金 1970年4月10日，案件的控辩双方于法庭 外达成了和解，ChemieGruenenthal 公司同意向控方支付总额1.1亿德国马克的赔偿金一、基本概念畸形(malformation)：指出生前因素引起发育生物体的严重的解剖学上形态结构的缺陷(异常)对发育、生长、生理功能、生育力和（或）寿命可产生有害影响 可以存活也可能不能存活致畸性（teratogenicity）和致畸作用(teratogenic effect)：均指在妊娠期（出生前）接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或作用致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现 致畸物(teratogen)：凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化学物称为致畸物或致畸原。畸胎：具有畸形的胚胎或胎仔 变异(variation)：指同一种属的子代与亲代之间或者子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，是小的或次要的结构改变 例如肋骨或椎骨数目多于或少于正常，甚至某些内脏易位也属於变异 一般认为变异不影响正常生理功能，更不危及生命 但是在动物致畸试验中，如果某种变异出现较多，并呈现一定剂量-效 应关系，应该引起注意胚胎-胎儿毒性 胚胎毒性(embryotoxicity)：通常是指外源性理化因素造成的孕体着床前后直到器官形成期结束的所有的毒性 表现为：胚胎期染毒而出现畸胎、生长迟缓、着床数减少和吸收胎，也偶有晚死胎 胎儿毒性(fetotoxicity)：指器官形成期结束后的因素引发的任何毒性表现 包括死亡、体重降低、骨化迟缓、功能 缺陷以及结构异常，甚至肿瘤 在实验动物发育毒性试验中，通常不去 区分胎儿与胚胎，所以使用胚胎-胎儿毒性更恰当 发育毒性(developmental toxicity)：指出生前经父体和/或母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有害作用。包括:结构畸形 生长迟缓 功能障碍 死亡发育毒物（developmental toxicant）:能造成发育毒性的物质 发育毒物应是在未诱发母体毒性的剂量下 产生发育毒性的物质 出生缺陷（birth defect）：是指婴儿出 生前即已形成的发育障碍 包括：形态结构异常(畸形),功能缺陷(如智力低下，代谢和行为的异常)其他与发育毒理学有关的术语 行为畸胎学（behavioral teratology）功能发育毒理学(functional developmental toxicity)精神畸胎学(psychoterotology)发育神经毒理学(developmental neurotoxicology)功能畸胎学(function tertology)二、发育各阶段发育毒性作用的特点 卵子受精后一直至出生为止，都称为孕体(conceptus):（一）着床前期（二）器官形成期（三）胎儿期（四）围生期和出生后的发育期着床前期发育毒性从受精算起，到完成着床之前（人类为11-12天，啮齿类动物为前6天）通常是未分化细胞受化学毒物损伤而致胚泡死亡，即着床前丢失 也有着床前接触毒物导致畸形的例子，如环氧己烷、甲基亚硝脲等器官形成期（胚胎发育期）在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官发生期，一般称为危险期(critical period)或关键期 自受精日计算：人是3-8周；大鼠约为9 17天；小鼠约为7.516天；家兔为11 20天 在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态结构异常；也有可能发生胚胎死亡、生长迟缓 发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间，即“靶 窗”(target window)大鼠器官发生期为受精后917天，但眼 的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为910天 同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形 如将大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；如在第12 天给予，则诱发腭裂胎儿期 器官形成结束后（以硬颚闭合为标志）即进入胎儿期(人类从56-58天起)，直到分娩 特点：以组织分化、生长和生理学的成熟为主 最容易表现的发育毒性是生长迟缓、特异的功能障碍（如神经、内分泌以 及免疫系统机能的改变）、经胎盘致 癌和偶见死胎 胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚胎为低，但仍有一定数目的死产胎发生围生期和出生后的发育期主要表现：发育免疫毒性、神经行为发育异常和儿童期肿瘤发育免疫毒性发育免疫毒性:妊娠期或围生期接触某些外源性化学物，会严重影响出生后T细胞、B细胞和吞噬细胞的发育、迁移、归巢和功能 发育神经毒性 表现为对感觉、运动、自主和认知的影响 妊娠期饮酒造成乙醇综合症胎儿 妊娠期安定暴露对F1 代大鼠有一定的发育 及神经行为毒性，表现为早期生理发育和 神经行为发育滞后等表现儿童期肿瘤 围生期是一生中对致癌物最敏感的时期，许多儿童期高发的肿瘤（急性淋巴细胞性白血病、神经母细胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺瘤等）都可能与出生前因素有关 因为这一时期细胞增殖快，药物代谢酶的个体发生不全，免疫监视功能低三、母体毒性与发育毒性母体毒性(maternal toxicity)：是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用 具体表现：体重减轻、出现某些临床症伏、死亡 母体毒性作用可分为:轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降，正常增长受到抑制。抑制程度，不超过不 接触受试物对照组动物的10%严重母体中毒可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸 困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡 母体因素对发育毒性的影响 1.遗传学：如唇腭裂CL(P)的发病率依赖于母体的而非胚胎的基因型，白人中的发病率比黑人更高 2.疾病：母体未控制的糖尿病，某些感染，经过间接的疾病相关的母体变化或直接经胎盘的感染对孕体有不利影响 3.营养：蛋白质、热量、维生素、微量元 素及辅酶因子的缺乏对妊娠产生不利 的影响 4.应激：如大鼠、小鼠妊娠期噪声暴露可 产生发育毒性。5.对胎盘的毒性母体毒性与胚胎毒性的关系 1.具有致畸作用，但无母体毒性出现，称为 非共效应致畸物(non-coeffective teratogen)此种外源化学物的致畸作用具有特定的 作用机理，与母体毒性无关，如反应停 此种受试物致畸作用往往较强，应特别 注意 2.出现致畸作用的同时也表现母体毒性，称为共效应致畸物(coeffective teratogen)此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸 机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系 3.仅具有母体毒性，但不具有致畸作用 4.在一定剂量下，既无母体毒性，也不表 现胚胎毒性 应在动物可能耐受条件下，最大限度地 增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才可做出结论 母体毒性与致畸作用的剂量关系之间，并 无固定比值；一般情况下，致畸作用剂量较 母体毒性作用剂量低内分泌干扰作用 环境内分泌干扰物（Environmental Endocrine Disruptors，简称EEDs），又称:Environmental Estrogens（环境雌激素）Endocrine Modulators（内分泌调节剂）Xenoestrogens（外源性雌激素）Environmental Endocrine Disrupting Chemicals（简称EDCs，环境内分泌干扰化学物质或环境内分泌干扰化学剂）等环境雌激素不仅使许多野生动物的繁殖能 力显著下降，而且对人类的生殖健康也产 生了潜在的威胁 这些雌激素一方面可能保护人类免患激素 依赖性疾病，如乳腺癌、前列腺癌和骨质 疏松症；另一方面对生殖系统产生危害，如大豆异黄酮可引起妇女月经紊乱四、发育毒性和致畸作用的试验与评价（一）动物发育毒性试验 三阶段试验 I阶段：雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性着床期间染毒，研究对成年雌雄性生殖功能、配子的发生及成熟、交配行为、受精、着床前的发育和着床的影响 II阶段：从着床到硬颚闭合期间染毒，研究对成成年雌性生殖功能、胚胎发育、器官形成期的发育毒性。III阶段：从着床到幼仔断乳期间对孕母(及乳母)染毒，研究包括从着床到子代性成熟的母体生殖毒性和子代的发育毒性（二）流行病学研究和人类证据 人类证据的获得病例报告、出生缺陷登记 发育毒性资料的使用（三）发育毒性的替代试验(体外预筛试验)由于删除了母体毒物动力学、生物转化，以及胎盘屏障的影响，因此其可靠性收到一定的怀疑 常见体外预筛试验有常见体外预筛试验有3 3种：全胚胎培养种：全胚胎培养,器官器官培养培养,细胞培养细胞培养
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