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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【目的要求】学习并了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。了解革兰氏染色法的原理，并掌握其操作方法。了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。巩固显微镜(油镜)的使用方法。【目的要求】学习并了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。1资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【基本原理】一、细菌的涂片及简单染色法基本原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。【基本原理】一、细菌的涂片及简单染色法基本原理2资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【基本原理】用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。【基本原理】用于生物染色的染料主要有碱性染料3资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【基本原理】二、革兰氏染色法（经典法）基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。【基本原理】二、革兰氏染色法（经典法）基本原理4资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验用品】1、菌种 金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌（注：大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球状细菌，经过革兰氏染色，两者着上不同颜色，在显微镜下便于区别。同时，由于两者具有不同的个体形态，在对它们的混合涂片进行革兰氏染色后，根据菌体颜色和形态差异，可以判断染色是否成功。）2、仪器 显微镜(25台)；3、材料 载玻片（每组4个），酒精灯（每组1个），接种环（每组1个），擦镜纸，二甲苯、香柏油，吸水纸，染色缸等；【实验用品】1、菌种 金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌（注：大5资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验用品】4、染料 草酸铵结晶紫（Crystal Violet,CV）、沙黄、吕氏碱性美蓝染液。1）草酸铵结晶紫染液的配制：A液：结晶紫2g 95乙醇 20mlB液：草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml需在用前48h将A液、B液混合，装入棕色试剂瓶内备用。【实验用品】4、染料 草酸铵结晶紫（Crystal Vio6资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验用品】2）沙黄染液的配制：A.贮存液：沙黄2.5g 95乙醇100ml B.应用液：A液10ml蒸馏水90m【实验用品】2）沙黄染液的配制：7资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验用品】3）吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 A液：美蓝(methylene blue)0.6g 95%酒精 30mlB液：KOH 0.01g 蒸馏水 100ml分别配制A液和B液，配好后混合即可。【实验用品】3）吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 8资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【方法步骤】一、细菌的涂片及简单染色法涂片涂片固定固定染色染色水洗水洗干燥干燥镜检镜检 清理清理干燥干燥【方法步骤】一、细菌的涂片及简单染色法涂片固定染色水洗干燥9资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【方法步骤】图1 涂片、干燥和热固定【方法步骤】图1 涂片、干燥和热固定10资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【方法步骤】二、革兰氏染色法（经典法）1、涂片 在洁净无油腻的玻片滴两小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，两种细菌要混合的地方。2、固定 将制成的涂片自然干燥，冷却后固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。【方法步骤】二、革兰氏染色法（经典法）11资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【方法步骤】3、染色初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。脱色 滴加95%乙醇2-3次，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。（此步至关重要）。复染 滴加0.5%沙黄，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。【方法步骤】3、染色12资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【方法步骤】4、镜检 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。右图为革兰氏染色法显示的炭疽和金黄色葡萄球菌【方法步骤】4、镜检 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为13资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【方法步骤】【方法步骤】14资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【注意事项】难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。选用对数生长期的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。【注意事项】难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革15资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验报告】1结果1）绘出油镜下观察的菌体图像 革兰氏染色效果 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 混合菌【实验报告】1结果16资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【注意事项】玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。制片要完全干燥后才能用油镜观察。革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，【注意事项】玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。17资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2）填表 表1 细菌形态的描述【实验报告】2）填表【实验报告】18资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验报告】2思考题（1）涂片为什么要固定，固定时应注意什么问题？（2）你在涂片染色过程中遇到了什么问题？试分析其中原因？（3）革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如何控制这一步。（4）不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？【实验报告】2思考题19
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