液相色谱解析课件

3.1 3.1 概述概述3.2 3.2 仪器结构及分离原理仪器结构及分离原理3.3 3.3 高效液相色谱分类及原理高效液相色谱分类及原理3.4 3.4 色谱分离条件的选择与优化色谱分离条件的选择与优化3.5 3.5 高效液相色谱方法的建立和应用高效液相色谱方法的建立和应用第三章第三章 高效液相色谱法高效液相色谱法 流流动动相相是是液液体体的的色色谱谱法法称称为为液液相相色色谱谱法法。液液相相色色谱谱可可分分为为平平板板色色谱谱和和柱柱色色谱谱，在在液液相相柱柱色色谱谱中中，采采用用颗颗粒粒十十分分细细的的高高效效固固定定相相，并并采采用用高高压压泵泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成输送流动相，全部工作通过仪器来完成,这种色谱法称为高效液相色谱法这种色谱法称为高效液相色谱法.1、高效液相色谱（、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱）和气相色谱GC的比较的比较 HPLCGC1、几乎可以分析各种化合物、几乎可以分析各种化合物只能分析挥发性物质，约只能分析挥发性物质，约20%的化合物的化合物2、可用于热不稳定物质的分析、可用于热不稳定物质的分析不能用于热不稳定物质的分析不能用于热不稳定物质的分析3、柱效不会很高、柱效不会很高可得到很高的柱效可得到很高的柱效4、流动相有毒，费用较高、流动相有毒，费用较高流动相为气体，无毒、易处理流动相为气体，无毒、易处理5、仪器制造难度较大、仪器制造难度较大仪器制造难度较小仪器制造难度较小3.1 概述概述 3.2 仪器结构仪器结构1.1.结构流程结构流程2.主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液泵 要求：能在高压下连续工作能在高压下连续工作能在高压下连续工作能在高压下连续工作 (5000 (5000psi)psi)较宽的可程序控制的流速范围较宽的可程序控制的流速范围较宽的可程序控制的流速范围较宽的可程序控制的流速范围 耐化学腐蚀耐化学腐蚀耐化学腐蚀耐化学腐蚀 无脉动输出无脉动输出无脉动输出无脉动输出 输出流量稳定、重复性好输出流量稳定、重复性好输出流量稳定、重复性好输出流量稳定、重复性好 易安装维护易安装维护易安装维护易安装维护(2)进样装置进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(3)高效分离柱高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效，现在已经有超发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效，现在已经有超高速高效液相色谱。高速高效液相色谱。(4)液相色谱检测器液相色谱检测器按检测对象分类按检测对象分类 溶质型检测器：对组分的物理或物理化学特性有响溶质型检测器：对组分的物理或物理化学特性有响应：紫外、荧光、电化学应：紫外、荧光、电化学 总体检测器：对试样或洗脱液总的物理或物理化学总体检测器：对试样或洗脱液总的物理或物理化学特性有响应：示差折光、介电常数、激光散射检测器特性有响应：示差折光、介电常数、激光散射检测器 a.紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：1、灵敏度高；灵敏度高；2、线形范围高；、线形范围高；3、流通池可做的很小（、流通池可做的很小（1mm 10mm，容积容积 8L）；）；4、对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱；、对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱；5、波长可选，易于操作；、波长可选，易于操作；b.b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器通用型检测器(每种物质具有不同的折光指数每种物质具有不同的折光指数)；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；d.荧光检测器荧光检测器 高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性；对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农农药药、氨氨基基酸酸、甾甾类类化化合合物物等有响应；等有响应；e.电化学检测器电化学检测器特点：1.灵敏度高，可测至灵敏度高，可测至10-15 molL-1；2.选择性好，只响应电活性物质；选择性好，只响应电活性物质；3.线性范围宽，可达线性范围宽，可达4 5个数量级。个数量级。HPLC-ECD法是目前多组分复杂样品分析中的一个重法是目前多组分复杂样品分析中的一个重要手段要手段,尤其尤其在分析低浓度生物样品中具有不可替代的在分析低浓度生物样品中具有不可替代的优势，逐渐受到生命科学和分析科学工作者的关注优势，逐渐受到生命科学和分析科学工作者的关注f.质谱仪质谱仪特点：1.灵敏度高，可获得待测化合物的结构信息灵敏度高，可获得待测化合物的结构信息(5)附属部件附属部件 脱气装置，自动进样装置，梯度洗脱装脱气装置，自动进样装置，梯度洗脱装置，柱温箱，衍生系统，馏分收集装置以及置，柱温箱，衍生系统，馏分收集装置以及数据处理等装置数据处理等装置如使用得当，会大大提高仪器的功能和提高如使用得当，会大大提高仪器的功能和提高工作效率工作效率 高效液相色高效液相色谱法的法的类型按型按组分在两相分在两相间分离机理的不同分离机理的不同主要分主要分为：液固吸附色液固吸附色谱法、液液分配色法、液液分配色谱法（正相与法（正相与反相）、离子交反相）、离子交换色色谱法及分子排阻色法及分子排阻色谱法法。其中：以反相的其中：以反相的化学化学键合相色合相色谱应用最用最为广泛广泛3.3 高效液相色谱分类及原理高效液相色谱分类及原理 液固吸附色谱法液固吸附色谱法固定相固定相为固体固体硅胶硅胶silica 和和 alumina（氧化氧化铝）是最常用的固定相是最常用的固定相 通通过一系列的吸附一系列的吸附/脱附步脱附步骤形成分离形成分离 样品分子品分子对固定相的吸附程度不同而形成分离固定相的吸附程度不同而形成分离 固定相流动相 液液分配色液液分配色谱法法固定液易流失固定液易流失 化学键合固定相化学键合固定相aqorgiiKi固定相流动相涂布式固定相涂布式固定相缺点：缺点：固定液易流失，重现性差，且不适合固定液易流失，重现性差，且不适合梯度洗脱和采用高速流动相梯度洗脱和采用高速流动相 采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇谱。用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基（基（Si-OH)与有机分子成键，利用化学反应将有机分子键合到载体表与有机分子成键，利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一的、牢固的单分子薄层而构成各种性能的固定相。采用面上，形成均一的、牢固的单分子薄层而构成各种性能的固定相。采用的键合反应有酯化键合的键合反应有酯化键合(SiOR型型)、硅烷化键合、硅烷化键合(Si-O-Si-R型型)和硅和硅氮键合氮键合(Si-N型型)等。以硅烷化键合反应最为常用等。以硅烷化键合反应最为常用.化学化学键合相具有以下特点：合相具有以下特点：1）固定相不易流失，柱的）固定相不易流失，柱的稳定性和寿命定性和寿命较高。高。2）能耐受各种溶）能耐受各种溶剂，可用于梯度洗脱。，可用于梯度洗脱。3）表面）表面较为均一，没有液坑，均一，没有液坑，传质快，柱效高。快，柱效高。4）能能键合合不不同同基基团以以改改变其其选择性性，例例如如键合合氰基基、氨氨基基等等极极性性基基团用用于于正正相相色色谱法法，链合合离离子子交交换基基团用用于于离离子子色色谱法法，键合合C2，C4，C6，C8，C16，C18，C22烷基基和和苯苯基基等等非非极极性性基基团用用于于反反相相色色谱法法等等。因因此此，它它是是HPLC较为理理想的固定相。想的固定相。离子交离子交换色色谱法法固定相表面带与被分析物相反电荷 一般使用弱离子交换树脂 根据电荷相互作用力的强弱产生分离 固定相流动相分子排阻色分子排阻色谱法法依照分子大小分离 固定相材质具有不同大小孔径 大分子因其经过的路径短，所以先流出 主要应用于聚合物、蛋白质等分子量范围的测定 3.4 色谱分离条件的选择与优化色谱分离条件的选择与优化分离条件的选择：分离条件的选择：样品、固定相、流动相、洗脱方式样品、固定相、流动相、洗脱方式一、分离类型选择一、分离类型选择一、分离类型选择一、分离类型选择 1.1.流动相的基本要求流动相的基本要求（1）与与色色谱谱柱柱不不发发生生不不可可逆逆化化学学变变化化，即即保保留留柱柱效效或或柱柱子的保留性质长期不变；子的保留性质长期不变；（2）能溶解被分离的样品；）能溶解被分离的样品；（3）与所用的检测器匹配；）与所用的检测器匹配；（4）黏度尽可能小，以获得高的柱效；）黏度尽可能小，以获得高的柱效；（5）价格便宜、毒性小、易于纯化；）价格便宜、毒性小、易于纯化；二、流动相的选择二、流动相的选择2.流动相选择的基本原则流动相选择的基本原则原则：原则：与固定相极性越接近的流动相，其洗脱能力越与固定相极性越接近的流动相，其洗脱能力越强。强。例：例：采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)3.3.流动相处理流动相处理 （1）用）用0.45m的微孔滤膜过滤，以防不溶物的微孔滤膜过滤，以防不溶物磨损高压泵和堵塞流路、色谱柱等磨损高压泵和堵塞流路、色谱柱等；（2）对流动相进行脱气处理，否则，溶于流）对流动相进行脱气处理，否则，溶于流动相中的气体形成气泡会影响泵、检测器的使动相中的气体形成气泡会影响泵、检测器的使用；用；洗脱方式：等度洗脱和梯度洗脱洗脱方式：等度洗脱和梯度洗脱 等度洗脱等度洗脱：流动相组成不随分析时间变化，始终是均一的：流动相组成不随分析时间变化，始终是均一的流动相洗脱，适合于较简单样品分析流动相洗脱，适合于较简单样品分析梯度洗脱梯度洗脱：洗脱方式可以是线性的或非线性的，也可以是：洗脱方式可以是线性的或非线性的，也可以是二元的或多元的，采用二元或多元组合溶剂作为流动相可二元的或多元的，采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间整出峰时间三、三、三、三、洗脱方式的选择洗脱方式的选择3.5 色谱的应用色谱的应用1.药学：药学：药物质量控制、药材最佳采收期、炮制工艺确定、药物质量控制、药材最佳采收期、炮制工艺确定、新药研发；新药研发；2.环境检测：环境检测：大气、土壤、水体等中污染物的定性定量分析；大气、土壤、水体等中污染物的定性定量分析；3.食品分析：食品分析：农残分析、兽残分析、营养成分定性定量分析；农残分析、兽残分析、营养成分定性定量分析；4.化工：化工：工艺研究、反应进度确定、产品质量控制；工艺研究、反应进度确定、产品质量控制；5.临床、临床、药物代谢：药物体内代谢研究、临床病例研究。药物代谢：药物体内代谢研究、临床病例研究。标准号标准号标准名称标准名称GB/T18294.4-2007火灾技术鉴定方法第4部分:高效液相色谱法GB/T18397-2001复合预混合饲料中泛酸的测定高效液相色谱法GB/T18872-2002饲料中维生素K3的测定高效液相色谱法GB/T18932.18-2003蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法液相色谱-紫外检测法GB/T18932.25-2005蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氧青霉素、双氧青霉素残留量的测定方法液相色谱-串联质谱法GB/T18932.26-2005蜂蜜中甲硝哒唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑残留量的测定方法液相色谱法GB/T18932.3-2002蜂蜜中链霉素残留量的测定方法液相色谱法GB/T18932.4-2002蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法液相色谱法GB/T18932.5-2002蜂蜜中磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲氧嘧啶残留量的测定方法液相色谱法GB/T18932.7-2002蜂蜜中苯酚残留量的测定方法液相色谱法GB/T19182-2003咖啡咖啡因含量的测定高效液相色谱法GB/T19267.11-2003刑事技术微量物证的理化检验第11部分:高效液相色谱法GB/T19371.2-2003饲料中液态蛋氨酸羟基类似物的测定高效液相色谱法GB/T19423-2003饲料中尼卡巴嗪的测定高效液相色谱法标准号标准号标准名称标准名称GB/T19427-2003蜂胶中芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定方法液相色谱-串联质谱检测法和液相色谱-紫外检测法GB/T19542-2004饲料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的测定高效液相色谱法GB/T19681-2005食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法GB/T19684-2005饲料中金霉素的测定高效液相色谱法GB/T20189-2006饲料中莱克多巴胺的测定高效液相色谱法GB/T20362-2006鸡蛋中氯羟吡啶残留量的检测方法高效液相色谱法GB/T20365-2006硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定液相色谱法GB/T20379-2006淀粉衍生物葡萄糖浆、果糖浆和氢化葡萄糖浆成分的测定高效液相色谱法GB/T20741-2006畜禽肉中地塞米松残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T20742-2006牛甲状腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巯基苯并咪唑残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T20743-2006猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T20744-2006蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑残留量的测定液相色谱-串联质谱法1）HPLC-DAD方法的建立方法的建立 1、丹参营养器官中丹参营养器官中丹参酮丹参酮I和丹参酮和丹参酮IIA的测定的测定HPLC-DAD提取条件提取条件洗脱条件洗脱条件检测条件检测条件方法学考察方法学考察1）HPLC-DAD方法的建立方法的建立 1、丹参营养器官中丹参营养器官中丹参酮丹参酮I和丹参酮和丹参酮IIA的测定的测定HPLC-DAD提取条件提取条件洗脱条件洗脱条件检测条件检测条件方法学考察方法学考察提取条件的选择：提取条件的选择：分别考察了回流提取法和超声分别考察了回流提取法和超声提取法，结果显示：回流提取法和超声提取法均可达提取法，结果显示：回流提取法和超声提取法均可达到同样的提取效率，但超声提取法提取时间明显缩短，到同样的提取效率，但超声提取法提取时间明显缩短，提取操作简单方便，故本实验采用超声提取法。然后，提取操作简单方便，故本实验采用超声提取法。然后，分别考察了不同比例的二氯甲烷分别考察了不同比例的二氯甲烷-甲醇溶剂及不同提取甲醇溶剂及不同提取时间时间2种成分的提取率。实验结果显示：采用二氯甲烷种成分的提取率。实验结果显示：采用二氯甲烷-甲醇甲醇(1 9)作提取溶剂效果最好，超声提取作提取溶剂效果最好，超声提取0.5 h，丹，丹参酮参酮I和丹参酮和丹参酮IIA的提取率均达到最大的提取率均达到最大 提取条件：提取条件：二氯甲烷甲醇（二氯甲烷甲醇（v/v=1/9）混合溶剂超）混合溶剂超声提取声提取0.5 h色色谱谱洗洗脱脱条条件件:美美国国Zorbax SB-C18（150 mm 4.6 mm,5.0 m）色色谱谱柱柱；流流动动相相：甲甲醇醇 水水，梯梯度度洗洗脱脱，其其时时间间程程序序为为01013 min，甲甲醇醇体体积分数相应为积分数相应为72%87%72%，流速：，流速：1.0 mLmin-1甲醇甲醇/水水色谱柱色谱柱流速流速等度洗脱等度洗脱柱温柱温梯度洗脱梯度洗脱洗脱条件洗脱条件色谱洗脱条件的优化色谱洗脱条件的优化检测条件的选择检测条件的选择用用DAD对丹参酮对丹参酮I和丹参酮和丹参酮IIA进行进行190 400 nm全波长扫描，结果丹参酮全波长扫描，结果丹参酮I和丹参酮和丹参酮IIA的最大吸收的最大吸收波长分别为波长分别为246和和270 nm 故本实验采用双波长检测，在故本实验采用双波长检测，在246 nm检测丹参酮检测丹参酮I，在，在270 nm检测丹参酮检测丹参酮IIA。色谱条件：色谱条件：色谱柱色谱柱：Zorbax SB-C18（150 mm 4.6 mm,5.0 m）流动相流动相：甲醇：甲醇-0.4%磷酸磷酸洗脱条件洗脱条件：梯度洗脱，其时间程序为：梯度洗脱，其时间程序为：01013 min01013 min，甲醇体积分数相应为甲醇体积分数相应为72%87%72%72%87%72%流速流速：1.0 mLmin-1 柱温柱温：30检测条件检测条件：二极管阵列检测器：检测波长分别为：二极管阵列检测器：检测波长分别为 246，270 nm化合物化合物丹参酮丹参酮I丹参酮丹参酮IIA线性关系线性关系Y=74.61C 118.86(r=0.9994)Y=55.58C 94.75(r=0.9996)精密度精密度1.7%1.9%稳定性稳定性2.1%2.1%重复性重复性2.3%2.5%加样回收率加样回收率99.4%(RSD=2.3%)100.1%(RSD=2.5%)方法学考察方法学考察2）样品的测定样品的测定