流式细胞术实验方法及应用课件

流式细胞术实验方法及应用流式细胞术实验方法及应用 科研型科研型 分选功能分选功能激光激光 四色荧光四色荧光(、）、）流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。前向散射激光的液流系统（如何形的液流系统（如何形成单个细胞流）成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管 近年来流式细胞术在我国得到很快的发近年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。化学等临床医学和基础医学研究领域。速度快速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个个细胞，甚至几万个细胞。细胞，甚至几万个细胞。多参数分析多参数分析可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把细胞群分为各亚群。细胞群分为各亚群。定性、定量分析细胞定性、定量分析细胞通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：、抗原或通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：、抗原或受体等进行定性、定量分析。受体等进行定性、定量分析。灵敏度高灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 、或或、白细胞分化抗原（分子）的命名：白细胞分化抗原（分子）的命名：年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为群，把每一群抗体称为一个分化抗体分化抗原反应性的类型划分为群，把每一群抗体称为一个分化抗体群群(，)，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由抗，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由抗体群识别的分化抗原就称为分子。目前已有个分化抗体群被鉴定并体群识别的分化抗原就称为分子。目前已有个分化抗体群被鉴定并命名命名 流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞免计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一群特疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及膜表面异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及膜表面标志，主要分为淋巴细胞标志，主要分为淋巴细胞()()、淋巴细胞、淋巴细胞()()、细胞、细胞()()三个亚群。三个亚群。淋巴细胞（）淋巴细胞（）淋巴细胞淋巴细胞 淋巴细胞（）淋巴细胞（）细胞（）细胞（）细胞细胞:()()淋巴细胞淋巴细胞:（）（）（）（）（）（）相应抗体相应抗体 避光孵育避光孵育 加加 溶血素溶血素 室温室温 洗一次洗一次 上机分析上机分析抗体抗体:三标抗体三标抗体二标抗体二标抗体二标抗体二标抗体同型对照同型对照淋巴细胞亚群检测临床意义：淋巴细胞亚群检测临床意义：、总数降低：细胞免疫功能低下、总数降低：细胞免疫功能低下 （）降低或（）降低或()()升高：、病毒感染、恶性肿瘤（复发升高：、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生障碍性贫血等或转移）、再生障碍性贫血等 ()()升高或升高或()()降低：自身降低：自身 免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血 细胞减少：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、细胞减少：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、严重免疫缺陷病。严重免疫缺陷病。()()活性低下：肿瘤、白血病、自身免疫病、活性低下：肿瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等免疫缺陷病等 ()()活性增高：多发性骨髓瘤、骨髓移植感活性增高：多发性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（病毒、疱疹病毒、肺）、习惯染、感染性疾病（病毒、疱疹病毒、肺）、习惯性流产等性流产等 细胞减少：体液免疫抑制细胞减少：体液免疫抑制 细胞增高：细胞恶性增殖性疾病（白血病）细胞增高：细胞恶性增殖性疾病（白血病）作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。利用不同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行分型：髓系、淋巴系、淋利用不同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行分型：髓系、淋巴系、淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线抗体包巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线抗体包括：胞浆（髓系，淋巴系括：胞浆（髓系，淋巴系,淋巴系）淋巴系）,胞膜胞膜(髓系、，淋巴系、髓系、，淋巴系、,淋巴系、淋巴系、)等等 采用和侧向散射采用和侧向散射(）设门）设门技术可将各细胞群分开，技术可将各细胞群分开，荧光从强大到弱：淋巴细荧光从强大到弱：淋巴细胞群胞群 单核细胞单核细胞 成熟粒细成熟粒细胞胞 原幼细胞原幼细胞(白血病细胞白血病细胞)，而成熟的红细胞和血小，而成熟的红细胞和血小板不表达。板不表达。各系表达的抗原各系表达的抗原造血干细胞：、造血干细胞：、髓系表达髓系表达 ：、：、巨核细胞巨核细胞 ：、：、细胞系：细胞系：、细胞系：、细胞系：、细胞细胞:、细胞因子（）主要由免疫细胞产生，也细胞因子（）主要由免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产生多种，一种也可由多产生。一种细胞可产生多种，一种也可由多种细胞产生。细胞因子分为类：白细胞介素种细胞产生。细胞因子分为类：白细胞介素（）；干扰素（）；造血生长因子；肿瘤坏（）；干扰素（）；造血生长因子；肿瘤坏死因子（）。死因子（）。血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，当其被各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加并不断分泌到细胞外而发挥作用。因此，要测定细胞内的细胞因子较为困难。通常应用刺激剂（如：佛波脂）来刺激细胞因子分泌，同时加入一定浓度的细胞内蛋白分泌抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，通过细胞因子特异的单克隆抗体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进行多色分析各种细胞内合成的细胞因子。全血或单细胞刺激素全血或单细胞刺激素(佛波脂佛波脂)和阻断剂和阻断剂(莫能霉素莫能霉素)培养培养 加入细胞表面抗加入细胞表面抗体体(如、如、)孵育孵育 洗次洗次 加固定破膜加固定破膜剂剂 室温室温 加入加入 和抗体和抗体 孵育孵育 洗两次洗两次 。结果分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（）和侧向结果分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（）和侧向散射（）圈出淋巴细胞，再用和设门圈出淋巴细胞，再用散射（）圈出淋巴细胞，再用和设门圈出淋巴细胞，再用设门选定淋巴细胞亚群，再分析和设门选定淋巴细胞亚群，再分析和淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞（）淋巴细胞（）（）（）检测检测 是高特异性荧光指示剂，能与特异结合。它本身是亲水性，是高特异性荧光指示剂，能与特异结合。它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨不易透过膜的，依赖其脂溶性（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去重新生成亲水性形过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去重新生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离浓度的离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离浓度的变化。变化。单细胞悬液单细胞悬液 避光孵育避光孵育 洗次洗次 上机检测上机检测 线粒体膜电位（）是线粒体功能的重线粒体膜电位（）是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映线粒体功能及数量，下降，的大小直接反映线粒体功能及数量，下降，其氧化磷酸化功能障碍，使产生减少，导致其氧化磷酸化功能障碍，使产生减少，导致细胞凋亡和坏死。细胞凋亡和坏死。（罗丹明）、等多种亲脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测 的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线粒体内膜的内侧带负电荷，当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。当降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，当降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反映线粒体数量和的降低或丧失。反映线粒体数量和的降低或丧失。操作：单细胞悬液（操作：单细胞悬液（*）的）的 洗两次洗两次 上机检测上机检测 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。半胱氨酸蛋白酶（）以无活性的酶原形式半胱氨酸蛋白酶（）以无活性的酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片段。活化的进一步激活其他的前体，形成了级片段。活化的进一步激活其他的前体，形成了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目前已发现个家族成员，分别命名为。白酶系统，目前已发现个家族成员，分别命名为。在家族成员中，是最重要的指示蛋白酶。在家族成员中，是最重要的指示蛋白酶。操作：操作：单细胞悬液（单细胞悬液（*）固定和破膜剂固定和破膜剂 冰浴冰浴 洗两次洗两次 单抗单抗 室温孵育室温孵育 洗次洗次 加加 上机检测。上机检测。细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有家族、基因家族等。抗凋亡基因、等 促凋亡基因、等 染色标记同 又称，即分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的又称，即分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重细胞死亡受体。是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重要分子结合要分子结合,可向细胞传递死亡信号可向细胞传递死亡信号,引起细胞凋亡。引起细胞凋亡。检测：同表面标记检测：同表面标记被认为比较成熟的方法：被认为比较成熟的方法：单染色法单染色法 双染法。双染法。法法碘化丙啶（）单染法（周期分析）：碘化丙啶（）单染法（周期分析）：由于凋亡细胞被降解，小分子可由于凋亡细胞被降解，小分子可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分，造成凋亡细胞含量减体也可带走部分，造成凋亡细胞含量减少，与荧光染料结合减少，荧光强度减少，与荧光染料结合减少，荧光强度减弱，在直方图上显示在峰前出现一个含弱，在直方图上显示在峰前出现一个含量减少的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。量减少的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。双染法：双染法：在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞丝氨酸（）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征，被特异的表面，构成早期凋亡的重要生化特征，被特异的 探针所标记，而对细活细胞和早期凋亡细胞是拒探针所标记，而对细活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，故染的，故 双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。死亡细胞。机械损伤细胞：机械损伤细胞：晚期凋亡、坏死细晚期凋亡、坏死细胞：胞：早期凋亡细胞：早期凋亡细胞：活细胞：活细胞：法：法：细胞凋亡时，双链会出现断裂点，细胞凋亡时，双链会出现断裂点，即产生一系列即产生一系列 端。在脱氧核糖核酸转移端。在脱氧核糖核酸转移酶酶()()催化的反应下，能将荧光素脱氧尿苷催化的反应下，能将荧光素脱氧尿苷三磷酸三磷酸()()标记到断裂的末端，从而使凋标记到断裂的末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。亡的细胞具有荧光。淋巴细胞亚群（、）淋巴细胞亚群（、）白血病免疫分型（、等）白血病免疫分型（、等）阵发性血红蛋白尿（、）阵发性血红蛋白尿（、）血小板活化指标（、）血小板活化指标（、）细胞周期分析细胞周期分析