沉淀反应课件

第五章沉淀反应第五章沉淀反应 (precipitation reaction)(precipitation reaction)1.指指可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体在适当条件下与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。发生特异性结合而出现的沉淀现象。沉淀反应沉淀反应+-2.l形成形成肉眼可见肉眼可见的大的免的大的免疫复合物疫复合物,反应慢。反应慢。l沉淀线或沉淀环的观察沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形点法就是测定此阶段形成的复合物成的复合物第一阶段第一阶段第二阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段沉淀反应分两个阶段l抗原抗体特异性结合，抗原抗体特异性结合，快速但不可见快速但不可见。l免疫比浊法中的速率免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率。免疫复合物形成的速率。沉淀反应的原理沉淀反应的原理3.抗原与抗体反应抗原与抗体反应4.n多克隆抗体多克隆抗体非常适用于免疫沉淀试验。非常适用于免疫沉淀试验。n单克隆抗体单克隆抗体|抗原表面只有一种表位，不易形成交联，抗原表面只有一种表位，不易形成交联，单克隆抗体一般不适用于免疫沉淀试验，单克隆抗体一般不适用于免疫沉淀试验，|抗原表面有抗原表面有2 2个以上相同的表位，单克隆抗个以上相同的表位，单克隆抗体也可用于免疫沉淀试验。体也可用于免疫沉淀试验。nR R型抗体：型抗体：沉淀反应中多用。沉淀反应中多用。5.环状沉淀试验环状沉淀试验絮状沉淀试验絮状沉淀试验单向扩散试验单向扩散试验双向扩散试验双向扩散试验对流免疫电泳、火箭免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳免疫电泳、免疫固定电泳液相沉淀液相沉淀试验试验凝胶沉淀凝胶沉淀试验试验免疫电泳免疫电泳试验试验沉淀反应分类沉淀反应分类免疫浊度免疫浊度试验试验免疫投射浊度测定免疫投射浊度测定免疫散射浊度测定免疫散射浊度测定6.第一节液相沉淀试验第一节液相沉淀试验（自学）（自学）n液相沉淀试验 是指可溶性抗原与抗体在含电解质的液体介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物。n经典的液相沉淀试验：絮状沉淀试验 环状沉淀试验7.第二节凝胶沉淀试验第二节凝胶沉淀试验（gel phase precipitationgel phase precipitation）|指可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，指可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。沉淀环。|常用的凝胶：琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚常用的凝胶：琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。丙烯酰胺凝胶。8.原原 理理n凝胶孔径3nm，抗原或抗体分子（AgAbAgC CAbAb、AgAg近似近似AgAb AgAb D DAgAbAgAbAbAb、AgAg近似近似E EAgAbAgAbAgAbAgAbF FAgAbAgAbAgAb27.5.抗原性质分析抗原性质分析A:A:两条沉淀线完全融合两条沉淀线完全融合，表明抗体与两个抗原中的相同表位，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，但这并不意为着两个抗原必定完全相同。结合而沉淀，但这并不意为着两个抗原必定完全相同。B:B:沉淀线交叉，沉淀线交叉，表明两个抗原完全不同；表明两个抗原完全不同；C:C:两条沉淀线相切，两条沉淀线相切，表明两个抗原部分相同，二者都有表位表明两个抗原部分相同，二者都有表位1 1，但其中另一个抗原还含有表位，但其中另一个抗原还含有表位2 2。28.|操作简单，无需特殊设备。|特异性高，结果可靠，成本低廉。|灵敏度低，耗时长，不能精确定量。评评 价价29.优点：优点：1.1.加快反应的速度。加快反应的速度。2.2.提高了灵敏度。提高了灵敏度。3.3.增加了分辨率。增加了分辨率。电泳分析电泳分析沉淀反应沉淀反应抗原抗体反应抗原抗体反应的高度特异性的高度特异性电泳技术的高分辨电泳技术的高分辨率、快速、微量率、快速、微量第三节第三节 免疫电泳技术免疫电泳技术30.原理：原理：双向扩散双向扩散+电泳电泳在在pH8.6pH8.6的琼脂凝胶中，的琼脂凝胶中，|抗原蛋白：等电点抗原蛋白：等电点4 45 5，带较多的，带较多的“-”-”，且分子，且分子较小，向正极的泳动速度大于向负极的电渗，抗原较小，向正极的泳动速度大于向负极的电渗，抗原泳向正极；泳向正极；|抗体蛋白：等电点较高，带较少的负电荷，且分抗体蛋白：等电点较高，带较少的负电荷，且分子较大，向正极的泳动速度小于向负极的电渗，抗子较大，向正极的泳动速度小于向负极的电渗，抗体泳向负极。体泳向负极。一、对流免疫电泳一、对流免疫电泳31.通电通电AgAg蛋白质抗原常蛋白质抗原常带较强的负电带较强的负电荷，在电场中荷，在电场中向正极移动向正极移动抗体球蛋白抗体球蛋白带负电荷较少，带负电荷较少，籍电渗作用向籍电渗作用向负极泳动负极泳动AbAb正极正极负极负极对流免疫电泳原理对流免疫电泳原理沉淀线沉淀线32.应用与评价应用与评价n用于抗原或抗体的定性分析、效价测定和纯度鉴定等。n灵敏度比双向免疫扩散试验高816倍。n分辨力低于双向免疫扩散试验。n不适宜于抗原为免疫球蛋白的情况，因这会导致电泳时抗原抗体朝一个方向泳动。33.电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。呈正相关。原理原理单向免疫扩散电泳单向免疫扩散电泳,定量检测技术定量检测技术二、火箭免疫电泳二、火箭免疫电泳34.火箭免疫电泳图火箭免疫电泳图为标准抗原；为标准抗原；为标本为标本-+火箭免疫电泳示意图火箭免疫电泳示意图35.应用与评价应用与评价n用于抗原蛋白定量，如IgA、IgG、IgM和SIgA，C3和C4及其裂解产物，AFP等。n若琼脂中加定量抗原可检测标本中抗体的含量，称为反向火箭免疫电泳（reversed rocket immunoelectrophoresis）。n本法影响因素多，现应用较少。36.原理：原理：区带电泳双向扩散区带电泳双向扩散1 1、电泳：、电泳：将蛋白质抗原在凝胶中电泳分将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带成肉眼不可见的若干区带 2 2、双扩：、双扩：沿电泳方向挖一与之平行的抗沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。三、免疫电泳三、免疫电泳37.+-抗体槽抗体槽Ag+-+1.1.电泳分离抗原电泳分离抗原2.2.在槽内加抗血清在槽内加抗血清3.3.实验结果实验结果38.-+M M：骨髓瘤患者血清免疫电泳图：骨髓瘤患者血清免疫电泳图 N N：正常人血清免疫电泳图：正常人血清免疫电泳图39.应应 用用纯化抗原或抗体的成分分纯化抗原或抗体的成分分析，粗略检测其纯度。析，粗略检测其纯度。正常和异常体液中蛋白质正常和异常体液中蛋白质组成分析，如无丙种球蛋组成分析，如无丙种球蛋白血症、多发性骨髓瘤等白血症、多发性骨髓瘤等病人的血清蛋白成分分析；病人的血清蛋白成分分析；不同抗体成分的研究，如不同抗体成分的研究，如免疫后抗体组分的动态变免疫后抗体组分的动态变化。化。评评 价价n方法简单，样品用量方法简单，样品用量少，特异性高，分辨少，特异性高，分辨率高，可分出人血清率高，可分出人血清中中20203030种蛋白质。种蛋白质。n沉淀线的数目和分辨沉淀线的数目和分辨率受多种因素的影响，率受多种因素的影响，判定结果要慎重。判定结果要慎重。40.四、自动化免疫电泳四、自动化免疫电泳1.1.电泳系统电泳系统2.2.光密度扫描系统光密度扫描系统41.第四节免疫浊度测定第四节免疫浊度测定n应用抗原、抗体在液相中特异性反应，形应用抗原、抗体在液相中特异性反应，形成成免疫复合物微粒对光线的干扰免疫复合物微粒对光线的干扰，可用仪可用仪器检测的特点，对可溶性抗原定量，将现器检测的特点，对可溶性抗原定量，将现代光学仪器与自动化分析检测系统相结合代光学仪器与自动化分析检测系统相结合应用于沉淀反应。应用于沉淀反应。n特点：操作简便、快速、易于自动化，而特点：操作简便、快速、易于自动化，而且灵敏度较高。且灵敏度较高。42.基本原理基本原理n在抗体过量且固定的条件下，形成的免疫复合物量随抗原在抗体过量且固定的条件下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增强，即待测抗原量量增加而增加，反应液的浊度亦随之增强，即待测抗原量与反应后溶液的浊度呈正相关。与反应后溶液的浊度呈正相关。n用一系列已知浓度的抗原标准品进行试验，制备剂量用一系列已知浓度的抗原标准品进行试验，制备剂量-反应反应曲线，即求出标本中抗原含量。曲线，即求出标本中抗原含量。小分子小分子可溶性免疫复合物可溶性免疫复合物（19S）反应液出现浊度反应液出现浊度增浊剂增浊剂可溶性抗原可溶性抗原+抗体抗体43.n根据检测器的位置及其所检测的光信号性质不同，免疫浊根据检测器的位置及其所检测的光信号性质不同，免疫浊度测定分为：度测定分为：免疫透射浊度测定（免疫透射浊度测定（turbidimetryturbidimetry）：检测透射光强度）：检测透射光强度 免疫散射浊度测定（免疫散射浊度测定（nephelometrynephelometry）：检测散射光强度）：检测散射光强度44.一、免疫透射浊度测定一、免疫透射浊度测定（一）原理（一）原理n一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的混合液一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的混合液时，被其中的免疫复合物微粒吸收、衍射、反射和时，被其中的免疫复合物微粒吸收、衍射、反射和折射而减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物折射而减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标抗原和抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。准品比较，可确定标本中抗原含量。n免疫复合物颗粒大小约免疫复合物颗粒大小约35nm35nm100nm100nm，对近紫外光，对近紫外光的干扰最大（最大吸收峰），选择的干扰最大（最大吸收峰），选择290nm290nm410nm410nm波波长测定最佳，目前多用长测定最佳，目前多用340nm340nm。45.（二）技术要点（二）技术要点1.1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释；将待检标本和抗原参考品作适当稀释；2.2.将抗原标准液（将抗原标准液（5 5或或6 6个浓度）和待检标本个浓度）和待检标本与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在抗原抗体反应完成后，在340nm340nm处测定各管处测定各管吸光度；吸光度；3.3.按按log-logitlog-logit转换或转换或y=ax3+bx2+cx+dy=ax3+bx2+cx+d方程进方程进行曲线拟合，制备剂量行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，以此作反应曲线，以此作为标本中抗原的定量依据。为标本中抗原的定量依据。46.（三）注意事项（三）注意事项1.在标本收集、保存和处理过程中，需防灰尘等能散射光的物质。2.血清样品最好在稀释后测定。3.计算时需扣除标本、抗血清和试剂本底。4.每更换一批试剂，重新制作剂量-反应曲线。47.（三）方法评价（三）方法评价 优点优点:灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确。灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确。不足不足:抗体用量较大；抗体用量较大；溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。48.1.粒子对光线的散射作用：粒子对光线的散射作用：|溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。产生反射和折射而形成散射光。|悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：密切相关，其公式如下：二、免疫散射比浊法二、免疫散射比浊法(一一)原理原理49.I：与入射光成与入射光成角处散射光强度；角处散射光强度；和和I0：为入射光的波长和强度；为入射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；为颗粒分子量；c为浓度；为浓度；N为阿佛加德指数；为阿佛加德指数；为颗粒到检测器的距离；为颗粒到检测器的距离；为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。II042（dn/dc)2 Mc(1+cos)N2450.nRayleighRayleigh散射：当粒径小于入射光波长的散射：当粒径小于入射光波长的1/101/10时，散射光时，散射光强度在各个方向的分布均匀一致强度在各个方向的分布均匀一致nDebyeDebye散射：当粒径大于入射光波长的散射：当粒径大于入射光波长的1/101/10或接近入射光或接近入射光波长时，散射光呈明显的不均匀分布，向前散射光大于向波长时，散射光呈明显的不均匀分布，向前散射光大于向后散射光后散射光nMieMie散射：当粒径等于或大于入射光波长时，向前散射光散射：当粒径等于或大于入射光波长时，向前散射光远远大于向后散射光。远远大于向后散射光。31310 090900 0DebyeDebye散射散射51.2.免疫散射浊度测定对抗原定量的原理免疫散射浊度测定对抗原定量的原理n一定波长的光线沿水平轴通过抗原抗体反应混合液时，由于反应液中免疫复合物微粒对光线的衍射和折射而形成散射光，散射光强度与免疫复合物量呈正相关。n在抗体过量的情况下，免疫复合物量与参与反应的抗原量呈正相关，与已知浓度的抗原标准品比较，即可计算出标本中抗原含量。n现用散射比浊仪测量散射光的角度多采用550，测量向前散射光。52.1.1.终点散射比浊法终点散射比浊法 (end-point nephelometry)(end-point nephelometry)2.2.固定时间散射比浊法固定时间散射比浊法 （fixed time ephelometryfixed time ephelometry）3.3.速率散射比浊法（速率散射比浊法（rate nephelometryrate nephelometry）（二）方（二）方 法法53.原理：原理：在抗原抗体反应达到平衡时测定散射光强度。必须在免疫复合物相互聚合形成絮状沉淀之前进行浊度测定，以免光散射值降低，得出偏低的结果。1.1.终点终点散射比浊法散射比浊法54.反应时间较速率法稍长；反应时间较速率法稍长；可自动化；可自动化；计算时需要减去本底值；计算时需要减去本底值；检测限达微克水平检测限达微克水平（g/Lg/L），但低于速），但低于速率散射比浊法。率散射比浊法。（1）技术要点）技术要点将待检标本和抗原标准品将待检标本和抗原标准品作适当稀释；作适当稀释；标本和抗原标准液（标本和抗原标准液（5 5或或6 6个浓度）与抗血清混合，在个浓度）与抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应一定条件下，抗原抗体反应完成后，散射比浊仪测定反完成后，散射比浊仪测定反应液的散射光强度；应液的散射光强度；与抗原标准品比较，确定与抗原标准品比较，确定标本中抗原含量。标本中抗原含量。（2）方法评价）方法评价55.n原理：原理：在保证抗体过量的情况下，加入待测抗在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应即散射光信号在开始反应7.5s7.5s2min2min内的第一内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。读数，将检测误差降到最低。2.固定时间散射比浊法固定时间散射比浊法56.技术要点技术要点 抗原抗体预反应：少量（十分之一）标本与一抗原抗体预反应：少量（十分之一）标本与一定量抗体混合反应，几秒钟后测定散射光信号，定量抗体混合反应，几秒钟后测定散射光信号，若信号值超过预设阈值，提示标本中待测抗原浓若信号值超过预设阈值，提示标本中待测抗原浓度过高，应将标本适当稀释后重做；度过高，应将标本适当稀释后重做；加入全量标本，几分钟后再测定散射光信号；加入全量标本，几分钟后再测定散射光信号；以第二次测得的信号值减去第一次信号值，获以第二次测得的信号值减去第一次信号值，获得待测抗原得待测抗原-抗体复合物产生的信号值，经计算抗体复合物产生的信号值，经计算机处理转换为抗原浓度。机处理转换为抗原浓度。57.3.速率散射比浊法速率散射比浊法（rate nephelometry）n速率：指单位时间内抗原抗体特异结合形成分子量大于3106的免疫复合物量（不是累积量）。n抗原与抗体混合的瞬间便引发反应，开始有数秒的滞后时间，随后反应加快，在抗体过量的前提下，抗原抗体反应速度由慢到快，单位时间内形成的免疫复合物不断增多，随后又逐渐减慢，连续动态监测单位时间内形成的免疫复合物微粒产生的散射光强度，可发现在某一单位时间内抗原抗体反应速度最快、免疫复合物形成量最多、散射光强度最大，即为所谓的速率峰，该峰值大小与抗原浓度呈正相关。58.抗原抗体复合物形成的速率抗原抗体复合物形成的速率累计时间（累计时间（s s）形成）形成ICIC总量速率总量速率累计时间（累计时间（s s）形成）形成ICIC总量速率总量速率 5 5 8 81010 13 13 5 51515 25 2512122020 60 6035352525 150 15090903030 230 23080803535 300 300 70704040 360360 60604545 415 415 55555050 450 450 45455555 480480 30306060 500500 202059.60.61.（1）技术要点）技术要点 将待检标本和抗原参考品作适当稀释；开启机器，对仪器定标；将待测标本和抗血清分别放入样本盘和试剂盘，输入命令，选择检测项目，仪器自动取一定量标本和适量抗血清混合，并动态监测反应液的速率变化，微电脑对测量数据自动分析处理，即可得知标本中抗原含量。62.（2）方法评价）方法评价 本法为自动化免疫化学分析技术，具有快速（一般在3060s内即可完成测试）、灵敏（最小检出量达g/L）、准确、精密度高、稳定性好、节省试剂、检测范围广、不需减去样本和试剂本底值等优点；但在实际应用中，测定结果与仪器的性能和试剂的质量密切相关，特别对抗体的质量要求高。63.BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪全自动特定蛋白分析仪64.IMMAGE全自动特定蛋白分析仪全自动特定蛋白分析仪65.n为一种带载体的免疫比浊法。为一种带载体的免疫比浊法。n在一般的免疫浊度测定中，少量小分子免疫复合在一般的免疫浊度测定中，少量小分子免疫复合物极难形成浊度，要形成较大的免疫复合物，需物极难形成浊度，要形成较大的免疫复合物，需参与反应的抗原、抗体量较大，这显然不符合微参与反应的抗原、抗体量较大，这显然不符合微量化的要求，为提高免疫浊度测定的灵敏度，发量化的要求，为提高免疫浊度测定的灵敏度，发展了免疫胶乳粒子增强浊度测定。展了免疫胶乳粒子增强浊度测定。三、免疫胶乳粒子增强浊度测定三、免疫胶乳粒子增强浊度测定66.用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为（一般为0.2 m），），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚，使透射光和散射光即出现特异结合，引起胶乳颗粒凝聚，使透射光和散射光即出现显著变化。显著变化。如图所示：如图所示：a a为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b b为抗原抗体结合形成为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。（一）（一）原理：原理：Ab致敏的颗粒ab67.（二）测定方法（二）测定方法 （三）方法评价（三）方法评价n敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平；n操作简便，易自动化；n血清中C1q和RF可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；n免疫胶乳轻度自凝或免疫活性降低会严重影响结果。1.透射比浊法：测定透射光强度2.散射比浊法：测定散射光强度68.四、免疫速率抑制浊度测定四、免疫速率抑制浊度测定（自学）（自学）l竞争抑制试验，用于药物、激素和毒物等小分子半抗原物质的定量测定。l基本原理：让一定量的已知半抗原-载体与限量的特异性抗体反应，生成的载体-半抗原-抗体复合物可产生一定的光散射速率峰值。当向反应系统中加入标本时，待测半抗原与半抗原-载体竞争结合相应抗体，从而抑制载体-半抗原-抗体复合物的形成，使光散射速率峰值降低，其降低的程度与待测半抗原量成正相关。69.五、免疫浊度测定的主要影响因素五、免疫浊度测定的主要影响因素（一）抗原抗体比例（一）抗原抗体比例n钩状效应：钩状效应：当抗原过量当抗原过量时，形成的免疫复合物分子时，形成的免疫复合物分子小，而且会发生解离，使浊度反而下降，光散射件小，而且会发生解离，使浊度反而下降，光散射件减少，形成高剂量钩状效应。减少，形成高剂量钩状效应。n海德堡曲线：海德堡曲线：当当抗体过量抗体过量时，复合物的形成随着抗时，复合物的形成随着抗原量的增加而增加，当抗原抗体比例达到最佳时，原量的增加而增加，当抗原抗体比例达到最佳时，免疫复合物的量达到高峰。免疫复合物的量达到高峰。保持抗体过剩是免疫比浊法测定抗原含量的条件，保持抗体过剩是免疫比浊法测定抗原含量的条件，但抗体过剩必须适量。但抗体过剩必须适量。70.非待测抗原抗体特异结合生成的免疫复合物形成的浊度。非待测抗原抗体特异结合生成的免疫复合物形成的浊度。（二）伪浊度（二）伪浊度混浊、高血脂、长期保存或反复冻融、处理不当。混浊、高血脂、长期保存或反复冻融、处理不当。抗体效价低于抗体效价低于1:201:20会增加伪浊度；会增加伪浊度；抗血清灭活处理；抗血清灭活处理；抗血清含有交叉反应性抗体；抗血清含有交叉反应性抗体；PEGPEG浓度过高引起血清中杂蛋白的非特异性共浓度过高引起血清中杂蛋白的非特异性共沉；沉；试剂污染（如细菌、尘埃等）和变质。试剂污染（如细菌、尘埃等）和变质。（1）标本）标本（2）试剂）试剂1.伪浊度形成的原因伪浊度形成的原因（3）器材）器材不够清洁、尘埃污染等，尤其是比色杯。不够清洁、尘埃污染等，尤其是比色杯。71.标本新鲜，必要时离心或稀释标本后测定避免加热灭活抗血清和标本；容器洁净；试剂用0.22m滤膜过滤；设置试剂、样品和抗血清对照等。2.减少或消除伪浊度的方法减少或消除伪浊度的方法72.抗体高特异性；抗体高特异性；效价高，大于效价高，大于1:201:20；亲和力高，可加快抗原抗体反应，抗原亲和力高，可加快抗原抗体反应，抗原-抗体复合抗体复合物牢固不易解离；物牢固不易解离；抗血清来源，由于标本中待测抗原量高低差别大，抗血清来源，由于标本中待测抗原量高低差别大，实际工作中很难掌握抗原抗体的恰当比例，故实际工作中很难掌握抗原抗体的恰当比例，故H H型型抗体不适合用作比浊试剂。在抗体过剩条件下，抗体不适合用作比浊试剂。在抗体过剩条件下，R R型抗体是免疫比浊法的理想试剂。型抗体是免疫比浊法的理想试剂。（三）抗体的质量73.1.pH值：pH6.58.5。2.电解质的性质和强度:|在一定范围内，离子强度大免疫复合物形成快，但离子强度过高可引起蛋白质盐析，形成伪浊度。|离子的种类也可影响免疫复合物的形成，高强度的负离子可加快免疫复合物的形成，而强度低的负离子使免疫复合物形成减慢。|常用磷酸盐缓冲液作为免疫浊度测定的反应液。（四）抗原抗体反应的环境条件（四）抗原抗体反应的环境条件74.n无论是透射比浊还是散射比浊，入射光波无论是透射比浊还是散射比浊，入射光波长均影响浊度测定的敏感度；若血清成分长均影响浊度测定的敏感度；若血清成分能吸收部分入射光，透射比浊法会误测为能吸收部分入射光，透射比浊法会误测为抗原的高浓度，散射比浊法会误测为抗原抗原的高浓度，散射比浊法会误测为抗原的低浓度。浊度测定的波长选择很重要。的低浓度。浊度测定的波长选择很重要。（五）入射光波长（五）入射光波长75.（六）内源性光散射（六）内源性光散射n免疫浊度测定常受内源性光散射的干扰，免疫浊度测定常受内源性光散射的干扰，血清中的乳糜微粒、血清中的乳糜微粒、VLDLVLDL和和LDLLDL等都会产生等都会产生杂散光，另外，血浆蛋白的荧光对浊度测杂散光，另外，血浆蛋白的荧光对浊度测定也产生干扰。采用血清对照和限制标本定也产生干扰。采用血清对照和限制标本用量可消除这些干扰。用量可消除这些干扰。76.六、免疫浊度测定的应用六、免疫浊度测定的应用|主要用于多种血浆蛋白的定量主要用于多种血浆蛋白的定量|用于尿和脑脊液中微量蛋白质的定量用于尿和脑脊液中微量蛋白质的定量|用于血浆药物浓度测定用于血浆药物浓度测定77.个人观点供参考，欢迎讨论！