蛋白纯化策略和工艺课件

蛋白纯化策略和工艺吕虎2017.8.18蛋白纯化策略和工艺吕虎1五大层析原理五大层析原理2内容内容:简介蛋白纯化策略如何建立纯化方案纯化工具总结内容:3简介简介4早期的蛋白纯化1789-1940s层析纯化1950s-1980s今天的蛋白纯化早期的蛋白纯化层析纯化今天的蛋白纯化5决定因素决定因素6层析技术层析技术7蛋白纯化策略蛋白纯化策略8蛋白纯化策略CIPPKEEP SIMPLE蛋白纯化策略CIPPKEEP SIMPLE9关键因子分辨率速度载量回收率Phase 1：CapturePhase 2：Intermediate PurificationPhase 3：Polishing关键因子分辨率速度载量回收率Phase 1：CaptureP10层析技术的推荐层析技术的推荐11交替运用互补技术，合理衔接减少样品处理，尽量简单化交替运用互补技术，合理衔接减少样品处理，尽量简单化12综合考虑起始和结束条件的衔接综合考虑起始和结束条件的衔接13设计合理的纯化路线互相衔接，减少中间处理设计合理的纯化路线互相衔接，减少中间处理14建立纯化方案明确纯化目的了解纯化产物的特性CIPP纯化策略建立有效分析方法确立最终的纯化方案建立纯化方案明确纯了解纯化产物的特性CIPP纯化策略建立有效15明确纯化目的MassspectrometryAntigen forimmunizationFunctionalstudiesStructuralstudiesTherapeuticproteinHomogeneityActivityPurityAmount pg ng ug mg g kgOften not necessary rigid requirements Moderate 80%High 95%-99%Very high 99%Often not necessary rigid requirements明确纯化目的MassAntigen forFunctiona16了解目的产物的特性目的产物的特性:分子量 等电点可溶性稳定性 起始条件:样品量 pH离子强度成分关键杂质 了解目的产物的特性目的产物的特性:起始条件:17CIPP纯化策略筛选层析技术筛选填料优化条件CIPP纯化策略筛选层析技术筛选填料优化条件18筛选层析技术：标签蛋白筛选层析技术：标签蛋白19筛选层析技术:非标签蛋白筛选层析技术:非标签蛋白20筛选填料筛选填料21筛选填料筛选填料22筛选填料不同HIC填料分离同种蛋白质的分离结果筛选填料不同HIC填料分离同种蛋白质的分离结果23优化条件不同pH条件下，目的蛋白与DEAE柱的结合情况优化条件不同pH条件下，目的蛋白与DEAE柱的结合情况24优化条件不同洗脱方式对蛋白纯化结果的影响优化条件不同洗脱方式对蛋白纯化结果的影响25有效的分析方法有效的分析方法26纯化追踪表Purification stepProteinConc.（mg/ml）Volume（ml）AmounttotalProtein（mg）Totalactivity（U）Specificactivity（U/mg）recovery（%）Purification factor回收率&纯化因子纯化追踪表PurificationProteinVolume27纯化工具手动纯化:重力纯化磁珠纯化离心纯化优点:简单易掌握经济自动纯化:预装柱配合层析设备优点:自动化解放人力更高效洗脱手段多样化结果更优高重复性，结果可追溯纯化工具手动纯化:自动纯化:28总结纯化目的&目的产物特性CIPP纯化策略Capture、Intermediate Purification and Polishing综合运用多种层析技术互相衔接保持简单纯化工具总结纯化目的&目的产物特性29思考：如果要得到一个去GST标签的蛋白，该如何设计纯化实验？如何选择层析柱？如何搭配层析设备？中试放大？思考：如何选择层析柱？如何搭配层析设备？中试放大？30Thank you for your listening!Thank you for your listening!31