核酸的结构和功能课件

第二章 核酸的结构和功能 1.20世纪50年代初，核酸是遗传物质得到公认。1953年Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型，从此，核酸的研究成了生命科学中最活跃的领域之一。分子生物学和分子遗传学等新兴学科随之兴起，极大地推动了生命科学的发展进程。对核酸结构和功能的深入研究，和一系列工具酶的使用，推动了分子生物学各个领域的快速发展。基因的复制和转录，分子杂交和基因芯片，DNA序列的测定，基因的克隆和表达，基因表达的调控等均以核酸结构和功能的研究为基础。因此，对生命科学工作者而言，掌握核酸的结构和功能是至关重要的。2.2.1 DNA是主要的遗传物质是主要的遗传物质 1869年Miescher从细胞核中分离出含磷很高的酸性化合物，称为核素(nuclein)，1889年Altman制备了不含蛋白质的核酸制品，命名为核酸核酸(nucleic acid)。Miescher在1892年曾推测核酸可能是遗传物质，但遗憾的是1940年代之前，这一推论未能得到实验的证实，也未得到学术界的重视。1910年Kossel证明核酸的主要成分是核糖、磷酸和碱基，1924年Feulgen根据核酸所含核糖的结构差别，将核酸分为核糖核酸核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)和脱脱氧核糖核酸氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。3.Kossel的学生Levene于 1909年发现酵母的核酸含有核糖，1929年发现核酸中的碱基主要是腺膘呤、鸟膘呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，并证明碱基、核糖、磷酸可以组成核苷酸，核酸则是由核苷酸组成的。1930年Levene发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖即脱氧核糖,得出了一个错误概念:植物核酸含核糖，动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚RNA和DNA的区别。Levene还提出了核酸的“磷酸-核糖(碱基)-磷酸”的骨架结构,解决了DNA分子的线性问题,并于1935年提出“四核苷酸”学说,认为这四种核苷酸的聚合体是构成核酸的基本单位，这一观点当时得到了广泛认同，一度阻碍了对核酸的研究工作。4.20世纪50年代以前，尽管已证明了生物体普遍含有DNA和RNA，但由于四核苷酸假说的影响，核酸的研究未能引起足够重视。1943年Chargaff等证明DNA中4种碱基的比例并不相等，四核苷酸假说开始受到质疑。1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，从有致病能力的有荚膜细菌分离蛋白质和DNA，分别加到无荚膜细菌(无致病能力)的培养液中，发现有荚膜细菌的DNA，可以使无荚膜细菌转化为有荚膜细菌，而蛋白质没有这种作用，说明DNA是遗传物质。5.The Avery-MacLeod-McCarty experiment.When injected into mice,the encapsulated strain of pneumococcus is lethal,whereas the nonencapsulated strain,like the heat-killed encapsulated strain,is harmless.Earlier research by the bacteriologist Frederick Griffith had shown that adding heat-killed virulent bacteria(harmless to mice)to a live nonvirulent strain permanently transformed the latter into lethal,virulent,encapsulated bacteria.Avery and his colleagues extracted the DNA from heat-killed virulent pneumococci,removing the protein as completely as possible,and added this DNA to nonvirulent bacteria.The DNA gained entrance into the nonvirulent bacteria,which were permanently transformed into a virulent strain.6.但由于四核苷酸假说的影响，这一结果一度受到质疑，理由是：（1）因认为蛋白相对分子质量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA相对分子质量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。Avery的进一步研究发现，加入蛋白酶和去除脂类并不影响DNA引起的转化作用，排除了上述质疑，证明了DNA是遗传物质。7.1952年Hershey和Chase分别用35S标记噬菌体T2的蛋白质，用32P标记噬菌体T2的DNA，然后感染大肠杆菌，说明噬菌体的DNA进入细菌后，合成了由其编码的外壳蛋白质，进一步证明DNA是遗传物质，其实验的过程如图2-1所示。8.The Hershey-Chase experiment.Two batches of isotopically labeled bacteriophage T2 particles were prepared.One was labeled with 32P in the phosphate groups of the DNA,the other with 35S in the sulfur-containing amino acids of the protein coats(capsids).(Note that DNA contains no sulfur and viral protein contains no phosphorus.)The two batches of labeled phage were then allowed to infect separate suspensions of unlabeled bacteria.Each suspension of phage-infected cells was agitated in a blender to shear the viral capsids from the bacteria.The bacteria and empty viral coats(called“ghosts”)were then separated by centrifugation.The cells infected with the 32P-labeled phage were found to contain 32P,indicating that the labeled viral DNA had entered the cells;the viral ghosts contained no radioactivity.The cells infected with 35S-labeled phage were found to have no radioactivity after blender treatment,but the viral ghosts contained 35S.Progeny virus particles(not shown)were produced in both batches of bacteria some time after the viral coats were removed,indicating that the genetic message for their replication had been introduced by viral DNA,not by viral protein.9.现已证明，除少数病毒以RNA为遗传物质外，多数生物体的遗传物质是DNA。原核生物的染色体是由一个环状DNA分子和少量蛋白质构成的，真核生物的染色体则是由DNA和约等量的蛋白质构成的。此外，原核生物含有较小的质粒DNA，真核生物的线粒体、叶绿体等细胞器也含有较小的DNA，细胞器DNA约占真核生物DNA总量的5%。不同生物体中DNA的结构差别(或RNA病毒中RNA的结构差别)，决定了其所含蛋白质的种类和数量有所差别，因而表现出不同的形态结构和代谢类型。RNA主要存在于细胞质中，核内RNA只占RNA总量的约10%。RNA的主要作用是从DNA转录遗传信息，并指导蛋白质的生物合成。此外，近些年发现不少小分子RNA有重要的调节功能和催化功能。10.2.2 核酸的组成成分 核酸可以水解成核苷酸，核苷酸可以水解成磷酸和核苷，核苷可以水解成戊糖和碱基，碱基可以分成多种类型。2.2.1 戊糖 RNA和DNA两类核酸是因所含的戊糖不同而分类的，RNA含D-核糖，DNA含D-2-脱氧核糖。某些RNA中含有少量的D-2-O-甲基核糖，即核糖的第2个碳原子上的羟基已被甲基化，D-核糖和D-2-脱氧核糖的结构式如图2-2所示。11.Conformations of ribose.In solution,the straightchain(aldehyde)and ring(-furanose)forms of free ribose are in equilibrium.RNA contains only the ring form,-D-ribofuranose.Deoxyribose undergoes a similar interconversion in solution,but in DNA exists solely as-2-deoxy-D-ribofuranose.12.在核酸中，戊糖的第一位与碱基形成糖苷键，形成的化合物称核苷。在核苷中，戊糖中的原子编号改为1，2，3，以区别于各碱基杂环中的原子编号。核糖和脱氧核糖均为-D-型呋喃糖，通常糖环的4个原子处于同一平面，另一个原子偏离平面，若突出的原子偏向C-5一侧，称内式(endo)，若偏向另一侧则称之为外式(exo)。DNA中的核糖通常为C-3内式，或C-2内式(图2-3)13.核酸中的碱基有嘌呤和嘧啶两大类，图2-4中嘌呤环和嘧啶环中各原子的编号是目前国际上普遍采用的统一编号。DNA和RNA均含有腺嘌呤和鸟嘌呤(图2-4)，但二者所含的嘧啶碱有所不同，RNA主要含胞嘧啶和尿嘧啶，DNA则含胞嘧啶和胸腺嘧啶(5-甲基尿嘧啶，图2-5，图2-6)。14.某些类型的DNA含有比较少见的特殊碱基，称稀有碱基。如小麦胚DNA含有较多的5-甲基胞嘧啶，在某些噬菌体(细菌病毒)中含有5-羟甲基胞嘧啶。稀有碱基是主要碱基经过化学修饰生成的，因此也可称作修饰碱基。在一些核酸中还存在少量的其它修饰碱基，如次黄嘌呤、二氢尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)、4-硫尿嘧啶等。tRNA中的修饰碱基种类较多，含量不等，某些tRNA中的修饰碱基可达碱基总量的10或更多。此外，修饰碱基常常扮演信号传导信使分子、营养因子、辅酶等角色，并对核酸结构的稳定性起着重要作用。15.16.17.含氧的碱基有烯醇式和酮式两种互变异构体(图2-7)，在生理pH条件下主要以酮式存在。体内核酸大分子中的碱基一般也是以酮式存在的。碱基可用英文名称前3个字母表示，如腺嘌呤(adenine)为Ade，鸟嘌呤(guanine)为Gua，胞嘧啶(cytosine)为Cyt，尿嘧啶(uracil)为Ura，胞腺嘧啶(thymine)为Thy，亦可用英文名称的第一个字母表示，分别为A、G、C、U和T，近些年单字符号使用更多。18.2.2.3 核苷核苷 核苷核苷(nucleoside)是戊糖和含氮碱生成的糖苷，核糖的1碳原子通常与嘌呤碱的第9氮原子或嘧啶碱的第1氮原子相连。在tRNA中有少量尿嘧啶的第5位碳原子与核糖的1碳原子相连，这是一种碳苷，因为戊糖与碱基的连接方式较特殊，也称为假尿苷。19.由嘌呤形成的核苷可以有顺式和反式两种结构类型，嘧啶形成的核苷只有反式构象是稳定的，在顺式结构中，C2位的取代基与糖残基存在空间位阻(图2-8)。20.The common ribonucleosidescytidine,uridine,adenosine,and guanosine.Also,inosine drawn in anti conformation.21.核苷常用单字符号(A,G,C,U)表示，脱氧核苷则在单字符号前加一小写的d(dA,dG,dC,dT)。常见的修饰核苷符号有：次黄苷或肌苷(inosine)为I，黄嘌呤核苷(xanthosine)为X，二氢尿嘧啶核苷(dihydrouridine)为D，假尿嘧啶核苷(pseudouridine)为。取代基团用英文小写字母表示，碱基取代基团的符号写在核苷单字符号的左下角，核糖取代基团的符号写在右下角，取代基团的位置写在取代基团符号的右上角，取代基的数量则写在右下角。如5-甲基脱氧胞苷的符号为m5dC，而N6,N6-二甲基腺嘌呤的符号为m26A。22.2.2.4 核苷酸核苷酸2.2.4.1 核苷酸的结构和功能核苷酸的结构和功能 核苷酸核苷酸(nucleotide)是核苷的磷酸酯。核苷中的核糖有3个自由的羟基，均可以被磷酸酯化，分别生成2-，3-和5-核苷酸。脱氧核苷酸的五碳糖上只有2个自由羟基，只能生成3-和5-脱氧核苷酸，各种核苷酸的结构已经用有机合成等方法证实。生物体内的游离核苷酸多为5-核苷酸(图2-9)，所以通常将核苷-5一磷酸简称为核苷一磷酸或核苷酸。各种核苷酸在文献中通常用英文缩写表示，如腺苷酸为AMP，鸟苷酸为GMP。脱氧核苷酸则在英文缩写前加小写d，如dAMP,dGMP等。23.24.Structures of the four common ribonucleotidesAMP,GMP,CMP,and UMPtogether with their two sets of full names,for example,adenosine 5-monophosphate and adenylic acid.Also shown is the nucleoside 3-AMP.25.26.其他单核苷酸也可以产生相应的二磷酸或三磷酸化合物。各种核苷三磷酸(ATP,GTP,CTP,UTP)是体内RNA合成的直接原料，各种脱氧核苷三磷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)是DNA合成的直接原料。核苷三磷酸化合物在生物体的能量代谢中起着重要的作用，在所有生物系统化学能的转化和利用中普遍起作用的是ATP。其它核苷三磷酸参与特定的代谢过程，如UTP参加糖的互相转化与合成，CTP参加磷脂的合成，GTP参加蛋白质和嘌呤的合成等等。生物体内的AMP可与一分子磷酸结合，生成腺苷二磷酸(ADP)，ADP再与一分子磷酸结合，生成腺苷三磷酸腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP,图2-10)。27.Formation of ADP and ATP by the successive addition of phosphate groups via phosphoric anhydride linkages.Note the removal of equivalents of H2O in these dehydration synthesis reactions.28.Phosphoryl and pyrophosphoryl group transfer,the major biochemical reactions of nucleotides.腺苷酸也是一些辅酶的结构成分，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I,NAD+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶II,ANDP+）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等。29.哺乳动物细胞中的3,5-环状腺苷酸环状腺苷酸(3,5-cyclic adenosine monophosphate,cAMP)是一些激素发挥作用的媒介物，被称为这些激素的第二信使。许多药物和神经递质也是通过cAMP发挥作用的。cGMP是cAMP的拮抗物，二者共同在细胞的生长发育中起重要的调节作用。某些哺乳动物细胞中还发现了cUMP和cCMP，功能不详。环核苷酸是在细胞内一些因子的作用下，由某种核苷三磷酸(NTP)在相应的环化酶作用下生成的，cAMP和cGMP的结构式如图2-11所示。30.31.在细菌的培养基中缺少某种必需氨基酸时，几秒钟内即发生GTP+ATP ppGpp或pppGpp的反应。在ppGpp或pppGpp的作用下，细菌会严格控制代谢活动以减少消耗，加快体内原有蛋白质的水解以获取所缺的氨基酸，并用以合成生命活动必需的蛋白质，从而延续生命。枯草杆菌在营养不利的情况下形成芽孢时，合成ppApp，pppApp和pppAppp，使细菌处于休眠状态度过恶劣时期。很多原核生物(如大肠杆菌)、真核生物(如酵母菌)和哺乳动物都存在A5pppp5A(Ap4A)，在哺乳动物中Ap4A含量与细胞生长速度有正相关。核苷酸及其衍生物在调控方面的作用，已成为生物体调控机制研究的一个重要领域。32.2.2.4.2 核苷酸的性质核苷酸的性质 核苷酸的碱基具有共轭双键结构，故核苷酸在260nm左右有强吸收峰。由于碱基的紫外吸收光谱受碱基种类和解离状态的影响，故测定核苷酸的紫外吸收时应注意在一定的pH下进行。图2-12表示了四种核苷酸在不同pH下的紫外吸收光谱。利用碱基紫外吸收的差别，可以鉴定各种核苷酸。33.表 2-1 四种主要核苷酸可解离基团的pK值核苷酸pK0(碱基-N)pk1(磷酸基)pK2(磷酸基)5-AMP3.8(N-1)0.96.15-GMP9.4(N-1),2.4(N-7)0.76.15-CMP4.5(N-3)0.86.35-UMP9.5(N-3)1.06.434.图2-13是4种核苷酸的解离曲线。可以看出，当pH处于第一磷酸基和碱基解离曲线的交点时，二者的解离度刚好相等。在这个pH下，第二磷酸基尚未解离，所以这一pH为该核苷酸的等电点。当pH小于等电点时，该核苷酸带净正电荷。相反，如果pH大于核苷酸的等电点，则该核苷酸带净负电荷。35.在pH3.5时，各种核苷酸的第一磷酸基已完全解离，带1个单位的负电荷，第二磷酸基完全未解离。含氮碱基的解离度则有明显的差别，分别为CMP(+0.84)AMP(+0.54)GMP(+0.05)UMP(0)。这样，所有核苷酸都带净负电荷，且带负电荷的多少各不相同。在pH3.5的缓冲液中进行电泳，它们便以不同的速度向正极移动，其移动速度的顺序是UMP GMP AMP CMP，因而可以将它们分开。用阳离子交换树脂分离上述四种核苷酸时，先在低pH(例如pH1.0)下使它们都带上净正电荷(UMP除外)，经离子交换作用结合到树脂上，然后用pH或盐离子浓度递增的缓冲液进行洗脱。UMP因不带正电荷，首先被洗脱下来，接着是GMP，因为嘌呤环同离子交换树脂的非极性吸附比嘧啶环大许多倍，抵消了AMP和GMP之间正电荷的差别，故洗脱顺序是：UMP GMP CMP AMP。36.2.3 核酸的一级结构核酸的一级结构 实验证明DNA和RNA都是没有分支的多核苷酸长链，链中每个核苷酸的3-羟基和相邻核苷酸戊糖上的5-磷酸相连。因此，核苷酸间的连接键是3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键(3,5-phosphodiester bond)。由相间排列的戊糖和磷酸构成核酸大分子的主链，而代表其特性的碱基则可以看成是有次序地连接在其主链上的侧链基团。由于同一条链中所有核苷酸间的磷酸二酯键有相同的走向，RNA和DNA链都有特殊的方向性，而每条线形核酸链都有一个5-末端和一个3-末端(图2-14)。37.3,5 phosphodiester bridges link nucleotides together to form polynucleotide chains.38.核酸结构的简写式核酸结构的简写式 用简写式表示核酸的一级结构时，用p表示磷酸基团，当它放在核苷符号的左侧时，表示磷酸与糖环的5-羟基结合，右侧表示与3-羟基结合，如pApCpGpU。在表示核酸酶的水解部位时，常用这种简写式。pApCpGpU表示水解后C的3-羟基连有磷酸基，G的5-羟基是游离的。而pApCpGpU则表示水解后C的3-羟基是游离的，G的5-羟基连有磷酸基。在不需要标明核酸酶的水解部位时，上述简写式中的p亦可省去，用连字符代替，如pA-C-G-U，或将连字符也省去，写成pACGU。pACTG39.核酸的序列测定开展较晚，20世纪70年代中期出现了快速测定DNA序列的新方法，1977年Sanger测定了X174单链DNA 5386 b的全序列。随后序列测定方法不断改进，现时DNA序列测定已走向自动化，包括人类在内的几十个物种的DNA全序列测定已经完成。由于DNA序列测定的原理与DNA的双螺旋结构有关，测序的基本原理将在本章最后一节简要介绍。40.2.4 DNA 的二级结构的二级结构 DNA 双链的螺旋型空间结构称DNA的二级结构的二级结构(secondary structure of DNA)。1953年Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构(DNA double helix,duplex)，是20世纪自然科学最重要的发现之一，对生命科学的发展具有划时代的意义。41.2.4.1 双螺旋结构的实验依据双螺旋结构的实验依据2.4.1.1 X-射线衍射数据射线衍射数据 Franklin和Wilkins发现不同来源的DNA纤维具有相似的X-射线衍射图谱，而且延长轴有0.34nm和3.4nm两个重要的周期性变化，说明DNA可能有共同的空间结构。X-射线衍射数据说明，DNA含有两条或两条以上具有螺旋结构的多核苷酸链。用高度定向的用高度定向的DNA纤维得纤维得到的高质量到的高质量X-光衍射照片光衍射照片 42.2.4.1.2 关于碱基成对的证据关于碱基成对的证据 Chargaff等应用层析法对多种生物DNA的碱基组成进行分析，发现DNA中腺嘌呤和胸腺嘧啶的数目基本相等，胞嘧啶(包括5-甲基胞嘧啶)和鸟嘌呤的数目基本相等，这一规律被称作Chargaff规则规则(Chargaffs rules)。后来又有人证明腺嘌呤和胸腺嘧啶之间可以生成2个氢键，胞嘧啶和鸟嘌呤之间可以生成3个氢键。43.44.2.4.1.3 DNA的滴定曲线的滴定曲线 从pH7用盐酸滴定到pH2，用NaOH滴定到pH12，可得到图2-15的曲线I。在pH411之间，只要加入少量的酸或碱，pH就发生明显变化，说明这一pH区段无可滴定基团，由于这一pH范围是第二磷酸基的解离范围，这一结果说明第二磷酸基处于结合状态，表明核苷酸之间是通过磷酸二酯键连接的。在pH小于4.5时，加入一定量的酸不会引起pH的明显变化，这是碱基的N原子结合H+的结果，当pH大于11时，加入一定量的碱，不会引起pH值的明显变化，这是碱基烯醇式羟基解离的结果。在pH411之间，碱基的可解离基团不可滴定，一个合理的解释是DNA形成双链，有关基团参与了氢键的形成。若分别从pH2和pH12将DNA溶液滴定到pH7，可得图中的曲线II，非缓冲区在pH69之间，说明只有当pH大于6和小于9时，单链的DNA才能形成双链。45.*1953年Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型，从此，核酸的研究成了生命科学中最活跃的领域之一。46.DNA结构：1962生理学或医学奖蛋白质三维结构结构：1962化学奖47.2.4.2 DNA双螺双螺旋结构的要点旋结构的要点 (1)DNA分子由两条方向相反的平行多核苷酸链构成，一条链的5-末端与另一条链的3-末端相对，两条链的糖-磷酸交替排列形成的主链沿共同的螺旋轴扭曲成右手螺旋(图2-16)。48.(2)两条链上的碱基均在主链内侧，一条链上的A一定与另一条链上的T配对，G一定与C配对。根据分子模型计算，一条链上的嘌呤碱必须与另一条链上的嘧啶碱相匹配，其距离才正好与双螺旋的直径相吻合。根据碱基构象研究的结果，A与T配对形成2个氢键，G与C 配对形成3个氢键(图2-17)。由于碱基对的大小基本相同，所以无论碱基序列如何，双螺旋DNA分子整个长度的直径相同，螺旋直径为2nm。49.碱基之间的配对关系称碱碱基配对基配对(base pairing)，根据碱基配对的原则，在一条链的碱基序列被确定后，另一条链必然有相对应的碱基序列。如果DNA的两条链分开，任何一条链都能够按碱基配对的规律合成与之互补的另一条链。即由一个亲代DNA分子合成两个与亲代DNA完全相同的子代分子。事实上，Watson和Crick在提出双螺旋结构模型时，已经考虑到DNA复制问题，并很快提出了半保留复制假说。50.(3)成对碱基大致处于同一平面，该平面与螺旋轴基本垂直。糖环平面与螺旋轴基本平行，磷酸基连在糖环的外侧。相邻碱基对平面间的距离为0.34nm，该距离使碱基平面间的电子云可在一定程度上互相交盖，形成碱基堆积力碱基堆积力(base stacking force)。双螺旋每转一周有10个碱基对，每转的高度(螺距)为3.4nm(图2-18)。DNA分子的大小常用碱基对数(base pair,bp)表示，而单链分子的大小则常用碱基数(base,b)，或核苷酸数(nucleotide,nt)来表示。51.由于双螺旋每转一周有10个碱基对，相邻碱基平面之间会绕着双螺旋的螺旋轴旋转36o，或者说，碱基平面之间有36o的错位，这不利于形成碱基堆积力。对DNA空间结构的进一步研究发现，构成碱基对的两个碱基平面之间有图2-19所示的螺旋螺旋桨式的扭曲桨式的扭曲(propeller twisting)，这种扭曲可以使相邻碱基平面之间的重叠面增加，有利于提高分子的碱基堆积力。52.Helical twist and propeller twist in DNA.(a)Successive base pairs in B-DNA show a rotation with respect to each other(so-called helical twist)of 36 or so,as viewed down the cylindrical axis of the DNA.(b)Rotation in a different dimension propellor twistallows the hydrophobic surfaces of bases to overlap better.The view here is edge-on to two successive bases in one DNA strand(as if the two bases on the right-hand strand of DNA in(a)were viewed from the right-hand margin of the page;dots represent end-on views down the glycosidic bonds).Clockwise rotation(as shown here)has a positive sign.(c)The two bases on the left-hand strand of DNA in(a)also show positive propellor twist(a clockwise rotation of the two bases in(a)as viewed from the left-hand margin of the paper).53.(4)由于碱基对的糖苷键有一定的键角，使两个糖苷键之间的窄角为120o，广角为240o。碱基对因而向两条主链的一侧突出，碱基对上下堆积起来，窄角的一侧形成小沟小沟(minor groove)，其宽度为1.2nm。广角的一侧形成大沟大沟(major groove),其宽度为2.2nm。因此，DNA双螺旋的表面可看到一条连续的大沟，和一条连续的小沟(图2-20)。大沟和小沟可以特异性地与蛋白质相互作用。特别是在大沟处，A-T，T-A，G-C和C-G的有关基团分布各不相同，可以提供与蛋白质相互识别的丰富信息。54.WatsonCrick A:T and G:C base pairs.All H bonds in both base pairs are straight,with each H atom pointing directly at its acceptor N or O atom.Linear H bonds are the strongest.The mandatory binding of larger purines with smaller pyrimidines leads to base pairs that have virtually identical dimensions,allowing the two sugar phosphate backbones to adopt identical helical conformations.55.(5)大多数天然DNA属双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)，某些病毒如X174和M13的DNA为单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)。(6)双链DNA分子主链上的化学键受碱基配对等因素影响旋转受到限制，使DNA分子比较刚硬，呈比较伸展的结构。但一些化学链亦可在一定范围内旋转，使DNA分子有一定的柔韧性。按照Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构，相邻碱基平面之间会旋转36o的角度，但Dickerson等研究人工合成的12bp DNA的空间结构，发现相邻碱基平面之间的旋转角度可在28o42o的之间变动。研究发现，双螺旋结构可以发生一定的变化而形成不同的类型，亦可进一步扭曲成三级结构。56.2.4.3 DNA二级结构的其它类型二级结构的其它类型 Watson和Crick依据相对湿度92%的DNA钠盐所得到的X射线衍射图提出的双螺旋结构称B-DNA(B form DNA)，细胞内的DNA与B-DNA非常相似。相对湿度为75%的DNA钠盐结构有所不同，称A-DNA(A form DNA)，A-DNA的碱基平面倾斜了20o，螺距和每一转的碱基对数目变化如表2-2所示。A-DNA与RNA分子中的双螺旋区，以及DNA-RNA杂合双链分子在溶液中的构象很接近，因此推测基因转录时，DNA分子发生B-DNA A-DNA的转变。在A-DNA和B-DNA中碱基均以反式构象存在，但二者的糖环构象不同，B-DNA为C-2-endo构象，而A-DNA为C-3-endo构象。A-DNA的碱基平面因此而倾斜了20，同时，分子表面的大沟变得狭而深，小沟变得宽而浅。57.1979年底Rich等将人工合成的DNA片段d(CpGpCpGpCpGp)制成晶体，并进行了X射线衍射分析(分辨是0.09nm)，证明此片段糖-磷酸主链形成锯齿形(zig-zag)的左手螺旋，命名为Z-DNA(Z form DNA)。Z-DNA直径约1.8nm，螺旋的每转含12个碱基对，整个分子比较细长而伸展，其碱基对偏离中心轴，靠近螺旋外侧，螺旋的表面只有小沟没有大沟。在Z-DNA中，嘌呤核苷酸的糖环为C-3-endo构象，嘧啶核苷酸的糖环为C-2-endo构象，嘌呤核苷酸为顺式构象，嘧啶核苷酸为反式构象。Rich等还发现用荧光化合物标记Z-DNA特异性抗体与果蝇唾液腺染色体的许多部位结合，在鼠类和各种植物的完整细胞核等自然体系中也找到了含有Z-DNA的区域。说明在天然DNA中确有Z-DNA，且执行着某种细胞功能。在接近生理条件的盐浓度时，甲基化的d(GC)n 可以从B型结构转变为Z型结构。已知当双螺旋DNA处于高度甲基化的状态时，基因表达一般受到抑制，反之则得到加强，说明B-DNA与Z-DNA的相互转换可能和基因表达的调控有关。58.Comparison of the deoxyguanosine conformation in B-and Z-DNA.In B-DNA,the ClN-9 glycosyl bond is always in the anti position(left).In contrast,in the lefthanded Z-DNA structure,this bond rotates(as shown)to adopt the syn conformation.59.Z-DNA存在的条件：存在的条件：（1）高盐：NaCl 2Mol/L,MgCl2 0.7 Mol/L （2）Pu,Py相间排列。（3）在活细胞中如果有m5C，则无需嘌呤-嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下可产生Z型将结构。（4）在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺等阳离子，可和磷酸基因结合，使B-DNA转变成Z-DNA。（5）某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电荷，可使DNA周围形成局部的高盐浓度微环境。（6）负超螺旋的存在。60.Z-DNA的生物学意义的生物学意义 (1)可能提供某些调节蛋白的识别位点。啮齿类动物病毒的复制起始部位有d（GC）有交替顺序的存在；在SV40的增强子中有三段8bp的Z-DNA存在。(2)原生动物纤毛虫，有大、小两个核，大核大核有转录活性，小核小核与繁殖有关。Z-DNA抗体以萤光标记后，显示仅和大核DNA结合，而不和小核的DNA结合，说明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和转录调控有关。（3）DNA的甲基化与基因表达的调控有关，一定程度的甲基化可以促进Z-DNA的生成，说明Z-DNA与基因表达的调控有关。61.62.Comparison of the A-,B-,and Z-forms of the DNA double helix.The distance required to complete one helical turn is shorter in A-DNA than it is in B-DNA.The alternating pyrimidinepurine sequence of Z-DNA is the key to the“left-handedness”of this helix.63.螺距 残基数 碱基倾斜 A型(75%,Na)2.8 11 20B型(92%,Na)3.4 10 0C型(66%,Li)3.1 9.3 6D/R hybrid 2.8 11 20Z型 4.6 12 964.DNA中存在不少如图2-23所示的二重对称结构二重对称结构(two fold rotationally symmetry)，即一条链碱基序列的正读与另一条链碱基序列的反读是相同的。这种序列也可称作反向重复顺序反向重复顺序(invert repeat sequence)或者回文顺序回文顺序(palindrome sequence)，这样的序列很容易形成发夹结构或十字架结构。有些回文顺序可以作为限制性核酸内切酶的识别位点，还有些回文顺序形成的发夹结构在转录的终止，或转录活性的调控方面发挥重要作用。鸟啼正落花鸟啼正落花花落正啼鸟花落正啼鸟65.Hairpins and cruciforms.Palindromic DNA(or RNA)sequences can form alternative structures with intrastrand base pairing.(a)When only a single DNA(or RNA)strand is involved,the structure is called a hairpin.(b)When both strands of a duplex DNA are involved,it is called a cruciform.Blue shading highlights asymmetric sequences that can pair with the complementary sequence either in the same strand or in the complementary strand.66.DNA的镜像重复(mirror repeat)可能形成三螺旋三螺旋DNA(triple-helical DNA)的结构(图2-24)。在三螺旋结构中，存在T-A*T，C-G*C+，T-A*A和C-G*G四种三联碱基配对(图2-25)，其中的“-”表示Wotson-Crick碱基对，“*”表示Hoobsteen碱基配对，这种碱基配对是Hoobsteen于1963年首先发现的，因此而得名。C+表示质子化的C，由于DNA的三螺旋结构中存在C+，因此，也可被称作H-DNA。67.68.原核生物基因组中不乏可形成三螺旋结构的DNA序列。在细胞外，三螺旋结构的形成需要酸性条件。但研究发现，多胺类（如精胺和亚精胺）在生理条件下可促进三螺旋结构的形成，其可能的原因是，多胺类降低了三条链的磷酸骨架之间的静电斥力。利用抗三螺旋DNA的抗体发现，真核生物的染色体中确实存在三螺旋DNA。研究发现，三螺旋结构可阻止DNA的体外合成。一种假设的可能的机制是，当DNA聚合酶到达镜像重复序列的中央时，模板会回折，与新合成的DNA形成稳定的三螺旋结构，使DNA聚合酶无法沿模板链移动，从而终止复制过程。细胞内是否存在这样的机制，有待实验工作来证实。69.DNA的某些特殊序列还可形成四链结构四链结构(tetrasomy structure)，目前发现的四链结构均是由串联重复的鸟苷酸链构成的。对四链结构的X-射线衍射研究发现，四链结构可以看成是由G-四联体片层以螺旋方式堆积而成的。如图2-26所示，4个G以Hoobsteen配对方式形成四联体，中心的4个羰基氧原子形成一个负电微区，可以同阳离子结合。G-四联体中的每一个G分别来自4条多聚鸟苷酸链，G与戊糖形成的糖苷键为反式构象。每个片层之间的旋转角度为30o，可使螺旋轴延伸0.34nm。环境中的阳离子可影响DNA四链结构的空间构象。70.真核生物染色体的端粒DNA中有许多鸟苷酸的串联重复，在一定的条件下，有可能形成四链DNA结构。研究发现，在非变性电泳中，端粒DNA有很高的泳动度，端粒DNA对水解单链核酸的酶有抗性，核磁共振和X-射线衍射研究发现，端粒DNA中存在G-G氢键，这些实验证据支持端粒DNA中存在四链DNA结构。除端粒DNA外，免疫球蛋白铰链区所对应的DNA片段，成视网膜细胞瘤敏感基因、tRNA基因和SupF基因的一些特殊序列，均存在串联重复的鸟苷酸链，有可能形成四链DNA结构。在酵母提取液中，发现了以四链DNA为底物的核酸酶，提示生物体内可能有天然存在的四链DNA结构。四链DNA结构的生物学意义有待深入研究。71.2.5 DNA的高级结构的高级结构2.5.1 环状环状DNA的超螺旋结构的超螺旋结构 细菌的染色体DNA，某些病毒的DNA，细菌质粒、真核生物的线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状DNA。在生物体内，绝大多数双链环状双链环状DNA(double-strand circular DNA,dcDNA)可进一步扭曲成超螺旋超螺旋DNA(superhelix DNA)，这种结构还可被称为共价闭环共价闭环DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。超螺旋DNA具有更为致密的结构，可以将很长的DNA分子压缩在一个较小的体积内，同时，也增加了DNA的稳定性。由于超螺旋DNA的密度较大，在离心场中和凝胶电泳中的移动速度较线性DNA快。若超螺旋DNA的一条链断裂，分子将释放扭曲张力，形成松弛环状松弛环状DNA(relaxed circular DNA)，也称为开环开环DNA(open circular DNA,ocDNA)。开环DNA在离心场中和凝胶电泳中的移动速度较线性DNA慢。若超螺旋DNA的两条链均断裂，就会转化为线性线性DNA(linear DNA)。72.为了更好的描述超螺旋DNA，将DNA中一条链绕另一条链的总次数定义为连环数连环数(linking number,L)，双螺旋的圈数定义为扭转数扭转数(twising number,T)，超螺旋数定义为缠绕数缠绕数(writhing number,W)。如图2-27所示，一段双螺旋圈数为40的B-DNA，在40转螺旋均已形成的情况下连接成环形时，双链环不发生进一步扭曲，构成松弛环形DNA，其L和T均为40，W为0。若在DNA旋转酶(Gyrase)，即拓扑异构酶II(TopII)的作用下，使上述环形DNA形成4周右手超螺旋，则连环数减少4周，即L为36，而双螺旋的圈数，即T依然是40。将这种状态下的超螺旋数规定为负值，即W为4。即可得出下列关系式：L=T+W。这种在拓扑异构酶的作用下，通过减少连环数形成的超螺旋称作负超螺旋负超螺旋DNA(negative supercoilid DNA)。若在两条链均不断开的情况下解开负超螺旋，则双螺旋的部分区域会形成单链区，在图2-27的例子中，L和T均为36，W为0，依然满足L=T+W的关系式，这种形式称解链环形DNA。73.White方程：方程：L=T+W L：连环数或称拓扑环绕数，指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数。其特点是：(1)L是整数；(2)在 cccDNA中任何拓扑学状态中其值保持不变；（3）右手螺旋的L取正值。W：扭曲数，即超螺旋数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；(3)右手超螺旋的W取负值。T：缠绕数，即双螺旋的圈数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；(3)右手螺旋时T为正值。超螺旋的量度可以用超螺旋密度来表示：=（L T）/T 在天然DNA中，约为 0.05，大约20个双螺旋有1个超螺旋。74.DNA两条链的关系很像两股扭在一起的蝇子，用具一定弹性的两股绳子(如软电线)可演示图2-27所示的各种状态。在环状DNA的两条链均不断开的情况下，若双螺旋进一步解开，即会形成左手超螺旋，称正超螺正超螺旋旋DNA(positive supercoilid DNA)。超螺旋DNA复制或转录时，两条链要不断解开，为防止正超螺旋的形成，可在拓扑异构酶的作用下，消除形成正超螺旋的扭曲张力。75.负超螺旋负超螺旋负超螺旋负超螺旋 右手右手右手右手正超螺旋正超螺旋正超螺旋正超螺旋 左手左手左手左手 DNA双螺旋为右手螺旋。细胞中的环状DNA一般呈负超螺旋，即右手螺旋不足造成的扭曲张力，导致分子通过整体的右手超螺旋来补足右手双螺旋，在数学上呈1：1，即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解开过度的螺旋。76.Supercoiled DNA topology.77.拓扑异构酶II可以将DNA的两条链切断，使其中的一段DNA跨越另一段DNA后再连接。在消耗ATP的情况下，每作用一次可引入2个负超螺旋，使L减少2，W取值则为2(图2-28)。若将负超螺旋解开，则双螺旋减少2周。在不消耗ATP的情况，该酶可消除负超螺旋。拓扑异构酶I(TopI)曾被称作蛋白，松驰酶等，是Mr为1.1105的一条肽链，由top基因编码。其作用机制是切开DNA双链中的一条链，绕另一条链一周后再连接，可以改变DNA的连环数，从而改变超螺旋的圈数。Top I可消除和减少负超螺旋，对正超螺旋不起作用，其作用过程不需要ATP提供能量。78.Visualization of topoisomers.In this experiment,all DNA molecules have the same number of base pairs but exhibit some range in the degree of supercoiling.Because supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules,they migrate more rapidly during gel electrophoresis.The gels shown here separate topoisomers(moving from top to bottom)over a limited range of superhelical density.In lane 1,highly supercoiled DNA migrates in a single band,even though different topoisomers are probably present.Lanes 2 and 3 illustrate the effect of treating the supercoiled DNA with a type I topoisomerase;the DNA in lane 3 was treated for a longer time than that in lane 2.As the superhelical density of the DNA is reduced to the point where it corresponds to the range in which the gel can resolve individual topoisomers,distinct bands appear.Individual bands in the region indicated by the bracket next to lane 3 each contain DNA circles with the same linking number;the linking number changes by 1 from one band to the next.79.2.5.2 真核生物染色体的结构真核生物染色体的结构 真核细胞的染色质和一些病毒的DNA是双螺旋线形分子，由于与组蛋白结合，其两端不能自由转动。双螺旋DNA分子先盘绕组蛋白形成核核小体小体(nucleosome)，或称核粒，许多核小体由DNA链连在一起构成串珠状结构。每个核小体的直径为11nm，它是由DNA分子在组蛋白核心外面缠绕约1.75圈(约146bp)构成的。组蛋白(histone)因所含碱性氨基酸的比例不同，可用聚丙烯酰胺凝胶电泳分为H1，H2A，H2B，H3和H4五种。核小体的核心含H2A，H2B，H3和H4各两分子，这4种组蛋白的C端富含疏水氨基酸，使各个亚基可以通过疏水作用相互结合，N端富含带正电荷的碱性氨基酸，可以同带负电荷的DNA结合。这4种组蛋白没有种属和组织特异性，进化上很保守。连接核粒核心的DNA片段称间隔区，长度一般为2060bp，可结合一分子H1(图2-29)，H1分子较大，有一定的种属和组织特异性。组蛋白与DNA之间主要通过离子键和氢键结合，其相互作用是结构性的，不依赖于核苷酸的特异序列。80.核小体的电镜照片核小体的电镜照片Electron micrograph of Drosophila melanogaster chromatin after swelling reveals the presence of nucleosomes as“beads on a string.”81.DNA分子缠绕组蛋白核心时，也会发生拓扑结构的变化，其原理如图2-30所示。因此，缠绕在组蛋白核心DNA分子也是一种