核酸分子杂交培训课件

核酸分子核酸分子杂交交21.Basic principle of nucleic acid hybridization2.Basic method of nucleic acid hybridization3.Biochip Technology4.Preparation&label of nucleic acid probes 5.Factors of nucleic acid hybridizationContents核酸分子杂交3核酸分子杂交技术的发展史核酸分子杂交技术的发展史Hall等等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。平衡密度梯度离心分离杂交体。Bolton等等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。琼脂技术。60年代末，年代末，Britten等研究液相中等研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复性以比较不同来源核酸的复杂度，用的复杂度，用UV260nm的吸光度来监测互补链的复性程度。的吸光度来监测互补链的复性程度。60年代中期年代中期Nygaard 等将等将DNA或或RNA探针固定在硝酸纤维素探针固定在硝酸纤维素（NC）膜上。）膜上。Brown等应用这一技术评估了爪蟾等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝基因的拷贝数。是现代膜杂交实验的基础。数。是现代膜杂交实验的基础。固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生。固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生。70年代末期到年代末期到80年代早期，分子克隆成为可能。可以从基因组年代早期，分子克隆成为可能。可以从基因组DNA文库和文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，制备大量的探针文库中获得特定基因克隆，制备大量的探针DNA。1975年英国爱丁堡大学的年英国爱丁堡大学的Southern建立了建立了Southern印记杂交技术，印记杂交技术，用于转化子的分析。用于转化子的分析。核酸分子杂交4The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993.for their discoveries of split genes 2006年上海交通大学微生物研究所年上海交通大学微生物研究所 核酸分子杂交5DNAmRNA法国科学家法国科学家Chambon的遗憾的遗憾hybridization electron micrograph of Ovalbumin mRNA and DNA 核酸分子杂交6Ovalbumin genehnRNAmodificationSplicing of hnRNAMature mRNA核酸分子杂交7Section IBasic principle of nucleic acid hybridization核酸分子杂交8denaturationrenaturation 核酸分子杂交是基于核酸分子的变性和复性原理核酸分子杂交是基于核酸分子的变性和复性原理的基础上产生和发展起来的。的基础上产生和发展起来的。核酸分子杂交9 DNA变变性性是是指指在在物物理理或或化化学学因因素素的的作作用用下下，DNA分分子子互互补补碱碱基基对对之之间间的的氢氢键键断断裂裂，使使双双链链DNA分分子子变变成成两两条条单单链链DNA的过程。的过程。I.Denaturation&renaturation of DNA核酸分子杂交101.Factors that cause DNA denaturation酸酸碱碱热热变性剂变性剂（尿素（尿素酰胺）酰胺）有机溶剂有机溶剂（乙醇（乙醇丙酮）丙酮）核酸分子杂交112.changes in physical and chemical properties of denatured DNA Hyperchromic effect粘度下降粘度下降浮力上升浮力上升核酸分子杂交12（nm）A8282OD260（A260）光密度（光密度（OD）亦）亦称光吸收值（称光吸收值（A）增色效应增色效应：DNA变性时，其溶液变性时，其溶液OD260增高。增高。Hyperchromic effect is the increase of OD260 of a material that occurs when the DNA duplex is denatured.核酸分子杂交13OD260的应用的应用 核酸浓度的测定核酸浓度的测定 核酸纯度的测定核酸纯度的测定 dsDNA：1 OD260=50ug/mlssDNA/RNA：1 OD260=40ug/ml寡核苷酸寡核苷酸：1 OD260=20ug/mlDNAOD260OD280=1.82.0 2.0 RNA污染污染 2.2 降解为核苷酸降解为核苷酸 1.7 蛋白质、酚污染蛋白质、酚污染核酸分子杂交14 Tm：双双链链DNA变变性性一一半半所所需需要要的的温温度度称称为为解解链链温温度度或或融融解解温温度（度（melting temperature,Tm）。）。不不同同的的DNA具具有有不不同同的的Tm值值，一一般般为为8590，其其大大小小与与G+C含量成正比。含量成正比。Tm=（G+C）%0.41+69.3Thermal denaturation核酸分子杂交15PCR热变性温度，一般为热变性温度，一般为9397。核酸分子杂交16 变性变性DNA在适当条件下，两条互补链可恢复天在适当条件下，两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。然的双螺旋构象，这一现象称为复性。减色效应：减色效应：DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。3.Renaturation of DNAHypochromic effect is the decrease of OD260 of a material that occurs when the DNA is renatured.核酸分子杂交17Base pairing of DNA renaturation核酸分子杂交18 DNA浓度浓度 DNA片段的大小片段的大小 DNA片段复杂性片段复杂性 合适的复性温度合适的复性温度 适当的离子强度适当的离子强度影响复性速度的因素：影响复性速度的因素：核酸分子杂交19II.核酸分子杂交核酸分子杂交 不同来源不同来源的具有互补序具有互补序列的两条核酸单链在一定条列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双件下按碱基配对原则形成双链的过程。链的过程。DNA-DNADNA-RNARNA-RNA探针探针待测核酸待测核酸分类分类核酸分子杂交20 DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性复性 DNA-RNA杂交双链分子杂交双链分子 RNA-RNA 杂交双链分子杂交双链分子 寡核苷酸寡核苷酸-DNA或或RNA 杂交双链分子杂交双链分子核酸分子杂交21核酸分子杂交技术的基本原理核酸分子杂交技术的基本原理 有互补特定核苷酸序列的单链有互补特定核苷酸序列的单链DNA或或RNA混在一起时，混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段已知基因（如把一段已知基因（DNA或或RNA）核酸序列用合适标）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe),与变性后的单链与变性后的单链DNA或或RNA进行杂交。进行杂交。再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。贝数及表达丰度等。核酸分子杂交22 应应 用用：(1)(1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；系；(2)(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。与否、拷贝数及表达丰度。核酸分子杂交23第第 二二 节节核酸分子杂交核酸分子杂交的基本方法的基本方法核酸分子杂交24液相杂交液相杂交固相杂交固相杂交原位杂交原位杂交Southern blot（检测（检测DNA）Northern blot（检测（检测RNA）斑点杂交斑点杂交/狭缝杂交狭缝杂交核酸分子杂交25三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较Southern blotNorthern blotWestern blot核酸分子杂交26 是指将电泳分离、原位变性的单链是指将电泳分离、原位变性的单链DNADNA片段转移到固相支持物上，然后，与核酸探片段转移到固相支持物上，然后，与核酸探针杂交，检测针杂交，检测DNADNA的方法。的方法。一、一、Southern Blot核酸分子杂交27带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转膜转膜杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶滤膜滤膜（尼龙膜（尼龙膜/硝酸纤维素膜）硝酸纤维素膜）吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern Southern 印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程胶内变性胶内变性核酸分子杂交28基本步骤基本步骤DNA制备、酶切制备、酶切电泳分离电泳分离原位原位DNA变性变性DNA转膜转膜预杂交、杂交、洗脱预杂交、杂交、洗脱杂交结果检测杂交结果检测（二）（二）待测待测DNA样品的电泳分离样品的电泳分离 （三）（三）凝胶中核酸的变性凝胶中核酸的变性（四）（四）Southern 转膜转膜（一）（一）待测核酸样品的制备待测核酸样品的制备（五）（五）Southern 杂交杂交（六）（六）杂交结果的检测杂交结果的检测核酸分子杂交29细胞细胞组织组织化学试剂化学试剂裂解细胞裂解细胞匀浆器匀浆器研磨破碎组织中的细胞研磨破碎组织中的细胞蛋白酶、蛋白酶、RNA酶酶消化大部分蛋白质和消化大部分蛋白质和RNA酚酚/氯仿氯仿除去残余蛋白质除去残余蛋白质DNA（100 kb ）乙醇乙醇（一）待测核酸样品的制备（一）待测核酸样品的制备核酸分子杂交30 部分消化部分消化 充分消化充分消化限制酶消化EEEEEEHHDNA片段：片段：（最长的（最长的DNA片段控制在大约片段控制在大约2 kb）核酸分子杂交3120001000500250100750121：DNA marker2：实验组（：实验组（EcoR I）0.8 1 非变性琼脂糖凝胶非变性琼脂糖凝胶（二）待测（二）待测DNA样品的电泳分离样品的电泳分离核酸分子杂交32碱变性：碱变性：DNA原位变性，形成单链分子，原位变性，形成单链分子，以便进行分子杂交。以便进行分子杂交。酸中和：凝胶酸中和：凝胶pH值恢复中性，值恢复中性，以便以便DNA片段转移。片段转移。（三）凝胶中核酸的变性（三）凝胶中核酸的变性核酸分子杂交33 （四）（四）Southern 转膜及固定转膜及固定（250-500g）毛细管虹吸印迹法毛细管虹吸印迹法l毛细转移毛细转移l真空转移真空转移l电转移电转移核酸分子杂交34核酸分子杂交35核酸分子杂交36转转移移后后，各各个个DNA片片段段在在膜膜上上的的相相对对位位置置与与在在凝凝胶胶中中的的相对位置仍然一样，因而称为印迹（相对位置仍然一样，因而称为印迹（blot）。）。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜印迹（印迹（blotblot）注意：做好点样方向标记注意：做好点样方向标记核酸分子杂交37预杂交：预杂交：目的是将膜上所有能与目的是将膜上所有能与DNA结合的位点结合的位点 全部封闭，降低本底，使背景清晰干净。全部封闭，降低本底，使背景清晰干净。甲酰胺甲酰胺 20 SSCDenhardt氏溶液氏溶液鲑精鲑精DNASDS杂交：杂交：预杂交液预杂交液+探针探针DNA（六）（六）Southern 杂交杂交预杂交液预杂交液（五）探针的制备（五）探针的制备核酸分子杂交38洗膜：洗膜：高高低低1SSC:Na+浓度浓度 0.2 mol/L2SSC:Na+浓度浓度 0.4 mol/L0.2SSC:Na+浓度浓度 0.04 mol/L0.1SSC:Na+浓度浓度 0.02 mol/LNa+浓度浓度 除去：除去：未反应的探针未反应的探针 与滤膜疏松结合的探针与滤膜疏松结合的探针 非特异性结合的探针非特异性结合的探针核酸分子杂交39 X-ray片片杂交膜杂交膜放射自显影放射自显影（七）（七）杂交结果的检测杂交结果的检测非放射性杂化分子的检测非放射性杂化分子的检测核酸分子杂交40DNA分子杂交的应用分子杂交的应用:可进行可进行DNA片段的定位和分子量的测定片段的定位和分子量的测定 可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析 可用于检出特异的可用于检出特异的DNA片段片段 可用于基因文库和可用于基因文库和cDNA文库的筛选文库的筛选核酸分子杂交41分子杂交实验流程分子杂交实验流程核酸分子杂交42 是指待测是指待测RNA样品经电泳分离样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固记的核酸探针进行固-液相杂交，检液相杂交，检测测RNA（mRNA）的方法。）的方法。二、二、Northern Blot样品是样品是RNA。电泳前，不酶切。电泳前，不酶切。电泳前，样品变性。电泳前，样品变性。电泳过程中，样品保电泳过程中，样品保持变性状态。持变性状态。电泳后，样品不再变电泳后，样品不再变性，直接转膜。性，直接转膜。需要特别注意防止需要特别注意防止RNA被降解。所有被降解。所有器皿都要进行处理，器皿都要进行处理，尽可能除尽尽可能除尽RNA酶。酶。核酸分子杂交43三、三、Western blotting核酸分子杂交44 将将RNA或或DNA变性后直接点样于硝酸纤变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行进行杂交，这种杂交方法称为杂交，这种杂交方法称为斑点杂交（斑点杂交（dot blotting）或或狭缝杂交（狭缝杂交（slot blotting）。四、四、斑点及狭缝杂交斑点及狭缝杂交核酸分子杂交45多孔过滤加样器多孔过滤加样器加样板支撑板抽真空板接真空泵印迹为圆形的，称为斑点印迹印迹为圆形的，称为斑点印迹印迹为线状的，称为狭缝印迹印迹为线状的，称为狭缝印迹核酸分子杂交46正常对照组正常对照组实验组实验组 1 1实验组实验组 2 2实验组实验组 3 3用于特定基因表达的定性及定量研究用于特定基因表达的定性及定量研究用于基因突变的分析用于基因突变的分析核酸分子杂交47 标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法交并对其进行检测的一种方法称原位杂交称原位杂交。五、原位杂交五、原位杂交 （in situ hybridization）检测基因在细胞内的表达与定位检测基因在细胞内的表达与定位 检测染色体中特定基因的位置等检测染色体中特定基因的位置等 可用于基因克隆筛选的菌落原位杂交可用于基因克隆筛选的菌落原位杂交(裂菌裂菌)核酸分子杂交48基本步骤：基本步骤：原位杂交分为：原位杂交分为：组织、细胞的固定组织、细胞的固定预处理预处理预杂交、杂交预杂交、杂交杂交结果检测杂交结果检测细胞内原位杂交和组织切片原位杂交细胞内原位杂交和组织切片原位杂交（10甲醛等）（蛋白酶、SDS、Triton X-100）（核素和非核素标记探针）核酸分子杂交49菌落原位杂交菌落原位杂交核酸分子杂交50核酸分子杂交51HPVFISH荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization)人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 核酸分子杂交52三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较Southern blotNorthern blotWestern blot胶内变性胶内变性上样前变性上样前变性上样前变性上样前变性变性胶变性胶预杂交预杂交-核酸分子杂交53第第 三三 节节生物芯片技术生物芯片技术核酸分子杂交54生物芯片生物芯片 生物芯片（生物芯片（biochip）是近年来在生命）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的体芯片表面构建的微型生物化学分析系统微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组及其他生物组分的准确、快速与分的准确、快速与大信息量大信息量的检测。的检测。核酸分子杂交55DNA芯片芯片蛋白质芯片蛋白质芯片其它芯片其它芯片生物芯片包括：生物芯片包括：按用途分：按用途分：-样品制备芯片样品制备芯片-生化反应芯片生化反应芯片-检测芯片检测芯片核酸分子杂交56是指将许多是指将许多特定的特定的DNADNA片段片段有规律地紧密排列有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光待测的荧光标记样品标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定定性和定量性和定量的结果。该技术亦被称作的结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)核酸分子杂交57基因芯片基因芯片(gene chip)Cy3Cy5核酸分子杂交58许多特定的许多特定的DNA片段片段或或cDNA片段作为探针片段作为探针Cy3Cy5核酸分子杂交59核酸分子杂交60芯片制作工艺流程图（芯片制作工艺流程图（光引导原位聚合技术光引导原位聚合技术）核酸分子杂交61生物芯片研究的总流程图生物芯片研究的总流程图主要的基因芯片生产厂商：主要的基因芯片生产厂商：Affymetrix公司公司Clontech公司公司Panomics公司公司核酸分子杂交62是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理核酸分子杂交63蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)抗原芯片原理图抗原芯片原理图 核酸分子杂交65核酸探针核酸探针（probe）：）：探针是指带有检测标记的，能与被检测核探针是指带有检测标记的，能与被检测核苷酸片段互补的一段已知核苷酸片段。苷酸片段互补的一段已知核苷酸片段。cDNA探针探针基因组基因组DNA探针探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针RNA探针探针探针的种类：探针的种类：核酸分子杂交66一一、合成寡核苷酸探针注意原合成寡核苷酸探针注意原则则(1)长度（长度（10-50 bp);(2)G:C对含量对含量40%-60%；(3)探针内避免互补；探针内避免互补；(4)避免同一碱基连续出现；避免同一碱基连续出现；(5)与非靶序列有与非靶序列有70%以上同源性或连续以上同源性或连续8个个以上碱基序列相同，最好不用。以上碱基序列相同，最好不用。核酸分子杂交67(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同标记前后探针基本结构、化学性质相同;(2)特异性强、本底低、重复性好；特异性强、本底低、重复性好；(3)操作简单、节时；操作简单、节时；(4)安全、无环境污染。安全、无环境污染。二、二、标记物标记物1、一个理想的标记物应满足：一个理想的标记物应满足：核酸分子杂交682、标记物的种类标记物的种类 32 32P P、3535S S、3 3H H、125125I I等等半抗原：生物素（半抗原：生物素（biotin）、地高辛（地高辛（Dig）荧光素：异硫氰酸荧光素（荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明等罗丹明等酶：辣根过氧化物酶酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等碱性磷酸酶等化学发光探针：化学发光探针：增强鲁米诺发光体系、吖啶类化合物发光体系和碱性增强鲁米诺发光体系、吖啶类化合物发光体系和碱性 磷酸酶催化的磷酸酶催化的1，2-二氧环己烷发光体系二氧环己烷发光体系非核素标记物非核素标记物核素标记物核素标记物核酸分子杂交69体体 内内 标标 记记体体 外外 标标 记记化化 学学 法法酶酶 法法三、标记方法三、标记方法缺口平移法缺口平移法随机引物标记法随机引物标记法PCRPCR标记法标记法末端标记法末端标记法核酸分子杂交70利利用用标标记记物物分分子子上上的的活活性性基基团团与与探探针针分分子子上上的的基基团团（如如磷磷酸酸基基团团）发发生生的的化化学学反反应应将将标标记物直接结合到探针分子上记物直接结合到探针分子上。化学法：化学法：多聚体乙撑亚胺多聚体乙撑亚胺聚苯醌酶（如酶（如HRP）交联多聚体乙撑亚胺多聚体乙撑亚胺酶酶DNA戊二醛交联核酸分子杂交71酶酶 法：法：OH555533 32P-dATP 生物素生物素-dUTP orNTP 地高辛地高辛-dUTP orNTP 荧光素荧光素-dNTP核酸分子杂交72DNase I5555333355553333DNA聚合酶聚合酶5-3外切酶活力外切酶活力55553333DNA聚合酶聚合酶 5-3聚合酶活力聚合酶活力55553333（一）缺口平移法（一）缺口平移法-32PdATP核酸分子杂交73553355553333553333555533模板模板变性变性合成标记合成标记Klenow酶酶（二）随机引物法（二）随机引物法核酸分子杂交74 在在PCR反反应应底底物物中中，将将一一种种dNTP换换成成标标记记物物标标记记的的dNTP，这这样样，标标记记的的dNTP就就可可在在PCR反应的同时掺入到新合成的反应的同时掺入到新合成的DNA链上。链上。dCTPdGTPdTTPdATP-32-5353底底 物物引物引物模模 板板（三）（三）PCR标记法标记法核酸分子杂交75 只将标记物标记在只将标记物标记在DNA链的链的3末末端和端和5末末端的方法端的方法称为末端标记称为末端标记。3端端DNA末端标记末端标记 5端端DNA末端标记末端标记（四）（四）末端标记法末端标记法核酸分子杂交76 3端端DNA末端标记末端标记核酸分子杂交77T4噬菌体多噬菌体多苷酸激酶苷酸激酶 5端端DNA末端标记末端标记-32PdATP先用碱性磷酸酶切除先用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或双链分子或RNA单链单链5末端的磷酸基团，使其成为末端的磷酸基团，使其成为5-OH核酸分子杂交781乙醇沉淀法乙醇沉淀法2Sephadex G-50柱层析法柱层析法3微柱离心法微柱离心法四、四、探针的纯化探针的纯化核酸分子杂交79第第 五五 节节影响核酸分子杂交影响核酸分子杂交的基本因素的基本因素核酸分子杂交801.核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度：50300 bp,0.10.5 g 2.温度温度:Tm-253.离子强度离子强度:Na+浓度约为浓度约为1 mol/L4.杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺:50%甲酰胺甲酰胺,降低降低Tm5.核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性6.非特异性杂交反应非特异性杂交反应:封闭封闭影响杂交的因素影响杂交的因素核酸分子杂交81常用封闭物：常用封闭物：变性非特异变性非特异DNA：鲑鱼精子：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺小牛胸腺DNA 高分子化合物：高分子化合物：Denhardt溶液溶液 脱脂奶粉脱脂奶粉 BSA Tm值的估算值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺（甲酰胺%）核酸分子杂交