核苷酸和核酸培训课件

核苷酸和核酸CompletionofaCompletionofaworkingdraft,Juneworkingdraft,June26,2000.26,2000.HGPHGPleadersandleadersandPresidentClintonPresidentClintonannouncetheannouncethecompletionofacompletionofaworkingdraftDNAworkingdraftDNAsequenceofthesequenceofthehumangenome.humangenome.BiologyenteredaBiologyenteredabravenewera,thebravenewera,theAgeofGenomicsAgeofGenomics.2核苷酸和核酸2002年2月12日，历时年的人类基因组机会最终完成，报道了的人类基因组序列，从这时候起，生物学进入了后基因组时代（postgenomicera)，人类基因的研究由测定DNA序列，解释遗传信息的传递转移到从分子整体水平上对生物功能的研究，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘，包括蛋白质组学，功能基因组学，药物基因组学等。3核苷酸和核酸2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁家安德鲁菲尔和克雷格菲尔和克雷格梅洛，以表彰他们发现了梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰干扰现象。现象。年年诺贝尔化学化学奖授予美国科学家授予美国科学家罗杰杰科恩科恩伯格，以伯格，以奖励他在励他在“真核真核转录的分子基的分子基础”研究研究领域作出域作出的的贡献。献。2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国的马里奥年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国的马里奥-R-卡佩奇、奥利弗卡佩奇、奥利弗-史密斯和英国的马丁史密斯和英国的马丁-J-伊文思，以伊文思，以奖励他们在胚胎干细胞和奖励他们在胚胎干细胞和“基因打靶基因打靶”研究方面所做的研究方面所做的贡献。贡献。4核苷酸和核酸核酸的种类及功能单链单链DNADNA：某些病毒：某些病毒DNADNA环状双链环状双链DNADNA：质粒、细菌：质粒、细菌线状双链线状双链DNADNA：真核生物：真核生物mRNAmRNARNAtRNARNAtRNArRNArRNADNADNA主要的遗传物质主要的遗传物质RNARNA参与蛋白质的生物合成参与蛋白质的生物合成,某些病毒的遗传物质某些病毒的遗传物质5核苷酸和核酸肺炎球菌转化实验6核苷酸和核酸7核苷酸和核酸 碱基碱基嘧啶嘌呤碱基、核苷和核苷酸8核苷酸和核酸腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶9核苷酸和核酸 核苷：核苷：核苷碱基戊糖核糖脱氧核糖10核苷酸和核酸碱基和戊糖的结合方式11核苷酸和核酸HHHH嘌呤核苷嘧啶核苷12核苷酸和核酸核苷酸嘌呤核苷酸嘧啶核苷酸核苷酸：核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP 13核苷酸和核酸14核苷酸和核酸具有信号及调控作用的核苷酸15核苷酸和核酸16核苷酸和核酸辅酶A核苷酸参与构成的重要化合物17核苷酸和核酸18核苷酸和核酸稀有碱基19核苷酸和核酸20核苷酸和核酸2-核苷酸和3-核苷酸的混合物RNA在碱溶液中的水解21核苷酸和核酸 核核酸酸的的共共价价结结构构22核苷酸和核酸文字式：pApCpGpTpApACGTA23核苷酸和核酸碱基的性质：碱基的性质：异构化异构化内酰胺内酰胺内酰亚胺内酰亚胺双内酰亚胺双内酰亚胺24核苷酸和核酸DNA双螺旋中的碱基对氢键形式双螺旋中的碱基对氢键形式25核苷酸和核酸 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收 增色效应，减色效应增色效应，减色效应26核苷酸和核酸DNA的双螺旋结构27核苷酸和核酸RosalindFranklinDNA的X-射线衍射图28核苷酸和核酸2020世纪世纪4040年代后期，年代后期，Erwin ChargaffErwin Chargaff通过对各生物碱基组通过对各生物碱基组成分析，提出了重要的成分析，提出了重要的ChargaffChargaff定则：定则：(1)(1)A=TA=T(2)(2)G=CG=C(3)(3)A+G=T+CA+G=T+C29核苷酸和核酸30核苷酸和核酸DNA双链的方向31核苷酸和核酸双链DNA的俯视图32核苷酸和核酸通过对碱基组成特点及通过对碱基组成特点及DNADNA结晶的结晶的X X光衍射分析光衍射分析,19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick提出提出DNADNA双螺旋结构模型。双螺旋结构模型。特点：特点：(1)(1)两条链反平行相互缠绕的右手螺旋，螺旋上有大沟两条链反平行相互缠绕的右手螺旋，螺旋上有大沟(major groove)(major groove)和小沟和小沟(minor groove)(minor groove)。(2)(2)碱基在内侧，磷酸和核糖在外侧。碱基在内侧，磷酸和核糖在外侧。(3)(3)螺旋直径螺旋直径2nm2nm，相邻碱基距，相邻碱基距0.34nm0.34nm，每圈，每圈1010（10.510.5）对碱基，螺距对碱基，螺距3.43.4（3.63.6）nmnm。(4)(4)A A与与T T配对，形成配对，形成2 2个氢键；个氢键；G G与与C C配对，形成配对，形成3 3个氢键。个氢键。(5)DNA(5)DNA双螺旋结构稳定的力主要是氢键（横向双螺旋结构稳定的力主要是氢键（横向)和碱基和碱基堆积力（纵向）。堆积力（纵向）。33核苷酸和核酸34核苷酸和核酸B-DNAA-DNA35核苷酸和核酸Z-DNA36核苷酸和核酸三种双螺旋三种双螺旋DNA类型的比较类型的比较A A型型B B型型Z Z型型螺旋手性螺旋手性右手性右手性右手性右手性左手性左手性分子形态分子形态较平滑双螺旋较平滑双螺旋平滑双螺旋平滑双螺旋Z Z字形扭曲字形扭曲螺旋直径（螺旋直径（nmnm）2.62.62.02.01.81.8碱基对碱基对/螺旋螺旋111110.510.51212碱基对上升高度碱基对上升高度(nm)(nm)0.260.260.340.340.370.37碱基倾角碱基倾角2020o o6 6oo1 1oo糖苷键构象糖苷键构象反式反式反式反式嘌呤顺式嘌呤顺式嘧啶反式嘧啶反式碱基排列方向碱基排列方向朝内朝内朝内朝内外露外露凹槽凹槽大沟（窄、深）大沟（窄、深）小沟（宽、浅）小沟（宽、浅）大沟（宽、深）大沟（宽、深）小沟（窄、浅）小沟（窄、浅）一种沟（小一种沟（小沟、窄、深）沟、窄、深）稳定存在条件稳定存在条件较高离子强度，相对较高离子强度，相对湿度湿度7575DNADNARNARNA杂交体杂交体低离子强度，细胞中低离子强度，细胞中DNADNA的构象的构象嘌呤嘧啶相嘌呤嘧啶相间排列间排列37核苷酸和核酸特殊的特殊的DNA碱基顺序：回文顺序和镜像重复顺序碱基顺序：回文顺序和镜像重复顺序（回文顺序）38核苷酸和核酸具有回文顺序的DNA可以形成“发夹”或“十字”形结构39核苷酸和核酸具有镜像对称顺序的碱基易于形成三链具有镜像对称顺序的碱基易于形成三链DNA(H DNA)40核苷酸和核酸Hoogsteen配对41核苷酸和核酸RNA的结构单链RNA（rRNA）因为分子内部的碱基配对形成的二级结构，无配对的碱基形成“突起”或“环”。42核苷酸和核酸3 -end5 -end16srRNA的二级结构43核苷酸和核酸tRNAtRNA的二级结构的二级结构 和三级结构和三级结构tRNAtRNA的的三叶草形三叶草形二级结构二级结构44核苷酸和核酸tRNA的倒L-形三级结构45核苷酸和核酸mRNA的结构单顺反子mRNA（monocistronicmRNA）与多顺反子mRNA（polycistronicmRNA）:原核生物的mRNA仅为一条肽链编码，称为单顺反子mRNA；为两条以上肽链编码则为多顺反子mRNA。46核苷酸和核酸hnRNA 内含子内含子(intron)mRNA 真核生物mRNA成熟过程：外显外显子子(exon)47核苷酸和核酸 核酸的变性、复性及杂交核酸的变性、复性及杂交核酸的变性在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程称为变性。变性后理化性质变化：OD260增高增高粘度下降粘度下降浮力密度升高浮力密度升高生物活性丧失等等生物活性丧失等等48核苷酸和核酸RNA和DNA的熔解温度曲线49核苷酸和核酸DNA 的的Tm值与值与G-C含量的关系含量的关系50核苷酸和核酸(G+C)%=(Tm-69.3)2.4451核苷酸和核酸退火退火:变性的变性的DNADNA经缓慢冷却后可复性，这一过程称为经缓慢冷却后可复性，这一过程称为退火。退火。淬火淬火:热变性热变性DNADNA溶液温度迅速降至溶液温度迅速降至0 0o oC C，DNADNA单链失去单链失去碰撞机会，不能复性，此种冷处理过程称为淬火。碰撞机会，不能复性，此种冷处理过程称为淬火。52核苷酸和核酸不同来源的单链核酸依据分子的互补性形成双螺旋的过程称为分子杂交。利用分子杂交技术，可以用设计的DNA探针钓出特殊的DNA顺序或基因。DNA的杂交53核苷酸和核酸 核酸的复性核酸的复性：影响复性的因素：冷却的快慢，影响复性的因素：冷却的快慢，DNADNA的浓度，的浓度，DNADNA的复杂程度的复杂程度复性的快慢以复性的快慢以C Co ot t1/21/2(K K，分子的复杂度，分子的复杂度)来表示，表来表示，表明明DNADNA复性反应的初始浓度与反应完成一半所需时间的乘积复性反应的初始浓度与反应完成一半所需时间的乘积是个常数。是个常数。K K随随DNADNA分子量的增加而增大。分子量的增加而增大。54核苷酸和核酸核酸的化学反应：碱基的脱氨基作用:碱基的环外氨基的丢失C:10-7/24A/G:10-9/2455核苷酸和核酸2.核酸的脱嘌呤作用：10-/2456核苷酸和核酸DNA的突变紫外线的诱导57核苷酸和核酸DNA链上的胸腺嘧啶二聚体58核苷酸和核酸B.化学诱变剂C.脱氨基试剂：亚硝酸类化合物D.烷化剂：SAM,二甲基硫酸酯等E.超氧化物：H2O2等59核苷酸和核酸60核苷酸和核酸C.DNA的酶法甲基化D.SAM介导的甲基化系统E.Dam甲基化酶介导的甲基化：5GATC3F.DNA的甲基化有调控基因表达的作用。61核苷酸和核酸核酸外切酶：蛇毒磷酸二酯酶，牛脾磷酸二酯酶核酸内切酶ab63核苷酸和核酸核酸的限制性内切酶核酸的限制性内切酶1962年发现细菌中含有特异的核酸内切酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化而避免水解，而外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解。这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定。这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。64核苷酸和核酸II 类限制性核酸内切酶类限制性核酸内切酶特点：特点：只由一条肽链构成，作用不需ATP，仅需Mg2+，不进行甲基化或其他化学修饰；作用位点有4或6个核苷酸残基，作用位点具有回文结构，得到粘末端或平末端。65核苷酸和核酸产生5突出粘性末端:以EcoRI为例：5GAATTC35GpHOTTAAC33CATAAG53CTTAAOHpG5产生3突出的粘性末端：以PstI为例：5CTGCAG35CTGCApHOG33GACGTC53GOHpACGTC5产生平末端：以Nru为例：5TCGCGA35TCGpHOCGA33AGCGCT53AGCOHpGCT566核苷酸和核酸67核苷酸和核酸68核苷酸和核酸限制性酶切图谱：各种限制性内切酶在某一DNA分子或DNA片段上切点的排列，各酶切位点之间的距离以碱基对数目表示。也称物理图。限制图的制作：对DNA链的一端进行放射性同位素标记单酶切琼脂糖凝胶电泳切点数各片段分子量双酶切琼脂糖凝胶电泳69核苷酸和核酸DNA一级结构的测定：双脱氧末端终止法DNA的酶促合成条件：条件：模板模板引物引物四种四种dNTPdNTPDNADNA聚合酶聚合酶70核苷酸和核酸SangerSanger末端终止法原理：末端终止法原理：把聚合反应分四组把聚合反应分四组，每组加入一种每组加入一种22，33双脱氧核双脱氧核苷三磷酸。它随机地掺入到合成的苷三磷酸。它随机地掺入到合成的DNADNA中，一旦掺入，中，一旦掺入，DNADNA的合成就终止，所以加入有的合成就终止，所以加入有22，33双脱氧腺苷酸双脱氧腺苷酸(ddATP)(ddATP)的的那一组所有的片断均是以那一组所有的片断均是以ddATPddATP为为33末端，其余类似。末端，其余类似。71核苷酸和核酸双脱氧末端终止法72核苷酸和核酸核酸自动测序仪的原理73核苷酸和核酸DNA的超螺旋正超螺旋：正超螺旋：螺旋过份，即每圈螺旋的碱基对数目小于10.5;负超螺旋：负超螺旋：螺旋不足,即每圈螺旋的碱基对数目大于10.5;74核苷酸和核酸负超螺旋可以形成两种不同的状态天然DNA都以负超螺旋的形式存在。负超螺旋易于形成“泡状”结构，有利于DNA的复制、重组和转录等功能。75核苷酸和核酸超螺旋数：Lk Wr+Tw Wr：超螺旋数（Lk，螺旋轴的缠绕数）Lk：拓扑连系数（拓扑旋转数）Tw：螺旋数（Lk0,BDNA螺旋数）对一个含有210bp的环形闭合DNA分子，T210/10.5=20如果从中解开2个超螺旋，则Lk 18，超螺旋数Wr Lk T18-20=-2 超螺旋密度 2/20=-0.1 细胞中DNA 的超螺旋密度一般为-5%-7%.76核苷酸和核酸