网织红细胞检测进展与其临床应用课件

网织红细胞检测进展及其临床应用网织红细胞检测进展及其临床应用网织红细胞检测进展及其临床应用1概述概述网网织织红红细细胞胞(reticulocyte，Ret)是是介介于于晚晚幼幼红红细细胞胞和和成成熟熟红红细细胞胞之之间间的的过过渡渡阶阶段段细细胞胞，略略大大于于成成熟熟红红细细胞胞。网网织织红红细细胞胞是是有有核核红红细细胞胞刚刚刚刚失失去去核核的的阶阶段段，仍仍属属未未完完全全成成熟熟的的红红细细胞胞，浆浆内内尚尚残残留留有有嗜嗜碱碱性性RNA，经经碱碱性性染染料料（如如天天青青B、煌煌焦焦油油蓝蓝或或新新亚亚甲甲蓝蓝）活活体体染染色色后后，在在包包体体内内可可见见蓝蓝色色点点状状或或网网状结构，故名网织红细胞。状结构，故名网织红细胞。概述网织红细胞(reticulocyte，Ret)是介于晚幼2概述概述红细胞在骨髓中生成，至发育为成熟红细胞，经历了不红细胞在骨髓中生成，至发育为成熟红细胞，经历了不同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟红细胞。胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟红细胞。随着细胞的成熟，随着细胞的成熟，RNA含量逐渐减低，至细胞完全成熟含量逐渐减低，至细胞完全成熟后消失或接近消失，即红细胞中网线状结构越多，表示后消失或接近消失，即红细胞中网线状结构越多，表示细胞越幼稚。细胞越幼稚。ICSH将将Ret分为分为4型：型：型（丝球型）、型（丝球型）、型（花冠型或网型）、型（花冠型或网型）、型（破网型）、型（破网型）、型（颗粒型（颗粒型）。正常生理状态下，型）。正常生理状态下，型只存在于骨髓，型只存在于骨髓，型在外型在外周血也很难见到，周血也很难见到，型仅有少量释放到外周血，因此外型仅有少量释放到外周血，因此外周血网织红细胞计数时以周血网织红细胞计数时以型为主。型为主。概述红细胞在骨髓中生成，至发育为成熟红细胞，经历了不同阶段：3概述概述概述4概述概述Ret是是红红细细胞胞成成熟熟过过程程中中的的一一个个重重要要阶阶段段，是是判判断断骨骨髓髓红红系系造造血血情情况况和和疗疗效效观观察察的的重重要要指指标标。其其检检测测方方法法既既有有传传统统的的显显微微镜镜目目测测法法，又又有有现现代代化化的的仪仪器器计计数数法法(如如流流式式细细胞仪、网织红细胞计数仪及血细胞分析仪胞仪、网织红细胞计数仪及血细胞分析仪)。概述Ret是红细胞成熟过程中的一个重要阶段，是判断骨髓红系造5 网织红细胞检测进展网织红细胞检测进展1.手工法手工法2.血细胞分析仪法血细胞分析仪法3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪 网织红细胞检测进展1.手工6 1.手工法手工法手手工工法法分分玻玻片片法法和和试试管管法法。由由于于玻玻片片法法容容易易使使混混合合血血液液中中的的水水分分蒸蒸发发，染染色色时时间间偏偏短短，因因此此结结果果偏偏低低；试试管管法法容容易易掌掌握握，重重复复性性较较好好，必必要要时时还还可可以以从从混混合合血血液液中中再再取取标标本本重重新新涂涂片片复复查查。试试管管法法被被列列为为手手工工法法Ret计计数数的的参参考考方方法法。按按卫卫生生部部全全国国临临床床检检验验操操作作规规程程第第2版版，采采用用试试管管法法用用煌煌焦焦油油蓝蓝染染液液对对血血液液标标本本进进行行红红细细胞胞活活体体染染色色、制制片片，选选择择细细胞胞分分布布较较均均匀匀、厚厚薄薄适适中中的的体体尾尾交交界界处处，每每份份标标本本油油镜镜下下参参照照陈陈宝宝梁梁的的建建议议，即即Ret6%，计计数数红红细细胞胞1000个个；3%5%计计数数红红细细胞胞2000个个；1%2%应应计计数红细胞数红细胞4000个；小于个；小于1%计数红细胞计数红细胞10000个。个。1.手工法手工法分玻7 1.手工法手工法传传统统的的显显微微镜镜计计数数方方法法操操作作较较繁繁琐琐、影影响响结结果果的的因因素素较较多多。近近年年来来，国国内内开开始始使使用用国国际际血血液液学学标标准准化化委委员员会会(ICSH)推推荐荐的的Miller窥窥盘盘进进行行计计数数，规规范范了了计计算算区区域域，减减少少了了实实验验误误差差，使使结结果果准准确确性性有有所所提提高高(卫卫生生部部临临检检中中心心建建议议，CV控控制制在在15%之之内内)。Miller窥窥盘盘法法是是将将一一种种光光学学圆圆片片状状Miller窥窥盘盘安安放放在在显显微微镜镜目目镜镜中中，窥窥盘盘中中有有面面积积比比例例为为1：9的的2个个正正方方形形计计数数方方格格，只只需需计计数数19小小方方格格内内的的红红细细胞胞即即可可准准确确估估量量出出整整个个大大方方格格内内的的红红细胞数量。细胞数量。1.手工法传统的显微镜8卫生部临床检验中心控制卫生部临床检验中心控制Ret计数计数CV15%需镜检的需镜检的RBC数目数目Ret(%)计数计数Miller窥盘小方格窥盘小方格RBC 相当于缩视野法计数相当于缩视野法计数RBC数目数目 1-244440003-5222200061111000卫生部临床检验中心控制Ret计数CV15%需镜检的RBC数9 1.手工法手工法国国内内很很多多学学者者在在此此基基础础上上设设计计了了几几种种改改良良的的Ret计计数数窥窥盘盘。张张时时民民等等设设计计了了一一种种双双环环式式结结构构的的Ret计计数数窥窥盘盘，该该盘盘的的特特点点是是小小圆圆环环和和大大圆圆环环面面积积之之比比为为1：10，小小圆圆环环为为计计数数红红细细胞胞数数量量，大大圆圆环环为为计计数数Ret数数量量。其其圆圆形形结结构构更更加加适适合合于于人人们们观观察察和和计计数数显显微微镜镜下下细细胞胞数数量量的的习习惯惯，而而且且此此比比例例更更加加易易于于计计算算红细胞和红细胞和Ret的比值。的比值。10 1.手工法手工法陈陈高高远远则则在在这这两两种种窥窥盘盘的的基基础础上上设设计计了了改改良良式式Miller窥窥盘盘，采采用用双双正正方方形形结结构构，小小方方格格和和大大方方格格之之比比也也达达到到1：10，只只是是将将红红细细胞胞计计数数区区域域位位移移至至中中心心部部位位，以以方方便便红细胞数量的计数。红细胞数量的计数。1.手工法陈高11 1.手工法手工法刘刘志志贤贤设设计计了了一一种种新新的的Ret计计数数窥窥盘盘即即1804扇扇形形Ret计计数数窥窥盘盘：圆圆形形直直径径为为19 mm，圆圆心心角角 AOB=COD=EOF=GOH=180。弧弧AB=CD=EF=GH=180。计计算算公公式式为为：Ret%=整整个个计计数数区区域域内内的的Ret数数(4个个小小扇扇面面区区域域内内的的RBC总总数数5)100。这这种种新新型型Ret计计数数窥窥盘盘4个个扇扇形形区区域域均均匀匀分分布布在在整整个个视视野野的的4个个方方向向，4个个扇扇形形面面积积之之和和是是整整个个圆圆形形面面积积的的15，因因此此在在理理论论上上基基本本解解决决了了红红细细胞胞分分布布不不均均匀匀引引起起的的问问题题，降降低低了了系系统统误误差差和和随机误差随机误差。1.手工法刘志贤设12 手工法网织红细胞活体染色手工法网织红细胞活体染色染料评价染料评价染料染料评价评价新亚甲蓝新亚甲蓝WHO推荐使用，对RNA着色强，试剂稳定，Hb几乎不着色煌焦油蓝煌焦油蓝溶解度低，染料沉渣易附着红细胞表面，影响辨认；易受变性珠蛋白小体、HbH包涵体干扰中性红中性红染液浓度低、背景清晰、网织颗粒与红细胞对比鲜明；不受变性珠蛋白小体、HbH包涵体干扰 手工法网织红13 2.血细胞分析仪法血细胞分析仪法1993年年以以来来，可可进进行行Ret计计数数的的血血细细胞胞分分析析仪仪相相继继问问世世，因因其其具具有有重重复复性性好好、准准确确度度高高、省省时时等等优优点点，正正被被越越来来越越多多的的医医院院所所采采用用。仪仪器器法法Ret计计数数使使用用各各种种荧荧光光染染料料和和非非荧荧光光染染料料对对Ret进进行行染染色色，采采用用鞘鞘流流技技术术和和射射频频技技术术等等不不同同原原理理进进行行检检测测。血血细细胞胞计计数数仪仪不不仅仅可可以以计计数数Ret，同同时时还还能能检检测测出出网网织织红红细细胞胞绝绝对对值值Ret#、网网织织红红细细胞胞平平均均体体积积(MRV)、网网织织红红细细胞胞成成熟熟指指数数(RMI)等等许许多多参参数数，这这些些参参数数是是Ret分分析析、临临床床应应用用和研究的热门领域。和研究的热门领域。2.血细胞14 2.血细胞分析仪法血细胞分析仪法统统计计表表明明，仪仪器器法法测测定定Ret精精密密度度有有明明显显提提高高：对对低低Ret标标本本，CV值值在在10%21%之之间间；对对正正常常范范围围的的标标本本，C V值值在在3%16%之之间；高值标本，间；高值标本，C V值在值在2%10%之间。之间。2.血15 2.血细胞分析仪法血细胞分析仪法虽虽然然仪仪器器法法Ret计计数数有有诸诸多多优优点点，而而且且精精密密度度明明显显优优于于手手工工法法，但但也也存存在在一一些些不不足足：第第一一，所所有有仪仪器器分分析析的的基基本本原原理理都都是是检检测测Ret内内RNA 的的存存在在量量来来决决定定其其百百分分率率和和绝绝对对值值，当当某某些些患患者者血血液液中中有有核核细细胞胞或或淋淋巴巴细细胞胞异异常常增增加加时时，可可导导致致Ret计计数数结结果果的的假假性性增增加加；第第二二，冷冷凝凝集集素素存存在在、红红细细胞胞的的聚聚集集、某某些些病病理理因因素素或或药药物物都都能能使使红红细细胞胞产产生生自自身身荧荧光光；第第三三，自自动动化化分分析析仪仪结结果果的的准准确确性性除除了了依依赖赖于于仪仪器器本本身身的的良良好好性性能能外外，还还应应有有良良好好的的质质控控物物随随时时检检测测仪仪器器的的状状态态。另另外外，仪仪器器成成本本高高、价价格贵，基层医疗单位投入较为困难。格贵，基层医疗单位投入较为困难。16 3.流式细胞仪法和专用流式细胞仪法和专用 网织红细胞分析仪网织红细胞分析仪流流式式细细胞胞仪仪(flowcytometry，FCM)是是一一种种多多用用途途的的精精密密分分析析仪仪器器，应应用用派派若若宁宁、吖吖啶啶橙橙、噻噻唑唑橙橙等等这这些些特特殊殊的的荧荧光光染染料料与与Ret中中的的RNA结结合合，当当FCM 发发出出的的激激光光照照射射于于细细胞胞上上时时，根根据据细细胞胞能能否否发发射射出出特特定定颜颜色色的的荧荧光光，通通过过单单参参数数定定量量测测定定RNA，从从而而精精确确测测定定Ret占占成成熟熟红红细细胞胞的的比比率率。还还可可根根据据激激光光照照射射后后发发射射出出的的荧荧光光强强度度，或或光光吸吸收收量量大大小小、光光散散射射量量多多少少等等参参数数的的比比例例关关系系对对Ret成成熟熟程程度度进进行行分分群群，将将其其划划分分为为低低荧荧光光强强度度网网织织红红细细胞胞(LFR)、中中荧荧光光强强度度网网织红细胞织红细胞(MFR)、高荧光强度网织红细胞、高荧光强度网织红细胞(HFR)。17 3.流式细胞仪法和专流式细胞仪法和专 用网织红细胞分析仪用网织红细胞分析仪FCM 测定精密度明显高于手工法测定精密度明显高于手工法36倍，可在数倍，可在数秒中检秒中检20000个以上的红细胞，如个以上的红细胞，如Ret在在1.76.6%，其平均，其平均CV值在值在4.3%。不足之处，流式细。不足之处，流式细胞仪计数胞仪计数Ret受受HOWELLJolly小体、疟原虫和小体、疟原虫和血小板等干扰。血小板等干扰。18 网织红细胞计数方法学评价网织红细胞计数方法学评价检测方法检测方法评价评价普通显微镜法普通显微镜法简便、成本低，可直观细胞形态；影响因素多，重复性差玻片法水分易蒸发，染色时间短，结果偏低试管法易掌握，重复性较好，易复查Miller窥盘计数法规范计算区域，减少了实验误差，ICSH推荐方法仪器法仪器法检测细胞多，精密度高，与手工法相关性好，易标准化。仪器贵；受H-J小体、有核红细胞、血小板等干扰 网织19 网织红细胞检测的临床应用网织红细胞检测的临床应用Ret计计数数及及其其各各种种参参数数(IRF、RMI、MRV、RPI等等)在在贫贫血血的的诊诊治治、骨骨髓髓移移植植、肿肿瘤瘤的的放放化化疗疗和和药药物物疗疗效效检检测测等等方方面面具具有有重重要要参参考价值。考价值。网织红细胞检测20 1网织红细胞计数的应用网织红细胞计数的应用贫贫血血的的恢恢复复是是通通过过骨骨髓髓释释放放红红细细胞胞生生成成素素(EPO)完完成成的的，Ret增增加加可可被被看看成成是是骨骨髓髓造造血血功功能能对对贫贫血血的的正正常常反反应应。失失血血性性贫贫血血时时患患者者Ret各各项项指指标标会会显显著著增增高高，失失血血510 d内内Ret可可达达高高峰峰，出出血血停停止止后后2周周可可恢恢复复正正常常，临临床床上上可可应应用用此此参参数数和和特特点点来来判判别别出出血血是是否否停停止止；缺缺铁铁性性贫贫血血、巨巨幼幼细细胞胞性性贫贫血血时时也也可可见见患患者者Ret轻轻度度增增加加。Ret降降低低主主要要和和造造血血功功能能减减低低有有关关，典典型型病病例例为为原原发发性性再再生生障障碍碍性性贫贫血血、溶溶血血性性再再生生障障碍碍性性危危象象；此此外外还还有有急急性性白白血血病病、继继发发性性再再生生障障碍碍性性贫贫血血、化疗和放疗引起的骨髓造血功能抑制或减退等化疗和放疗引起的骨髓造血功能抑制或减退等。121 2网织红细胞生成指数网织红细胞生成指数(RPI)的应用的应用RPI代表网织红细胞的生成相当于正常人代表网织红细胞的生成相当于正常人的多少倍。的多少倍。不同生理、病理情况下，不同生理、病理情况下，Ret从骨髓释放人外周血所需时间不同，故从骨髓释放人外周血所需时间不同，故Ret计数值不能确切反映骨髓红细胞系统计数值不能确切反映骨髓红细胞系统造血功能，还应考虑造血功能，还应考虑Ret生存期限。生存期限。通常通常Ret生存期限约为生存期限约为2d，若未成熟网织红细，若未成熟网织红细胞提前释放入血，胞提前释放入血，Ret生存期限将延长，生存期限将延长，为了纠正网织红细胞提前释放引起的偏为了纠正网织红细胞提前释放引起的偏差，用差，用RPI来反映来反映Ret生成速率。生成速率。2网织红细22 2网织红细胞生成指数网织红细胞生成指数(RPI)的应用的应用 RPI=RET%被被测测HCT/正正常常人人HCT 1/RET 成成熟熟天天数数。释释放放入入外外周周血血的的网网织织红红细细胞胞越越趋趋于于幼幼稚稚，其其成成熟熟时时间间越越长长。由由于于网网织织红红细细胞胞体体积积大大于于成成熟熟红红细细胞胞，大大量量网网织织红红细细胞胞的的提提前前释释放放在在某某种种程程度度上上影影响响血血细细胞胞比比容容的的测测定定结结果果。经经观观察察，网网织织红红细胞成熟时间与细胞成熟时间与Hct存在下列关系存在下列关系 HCT0.39-0.450.34-0.380.24-0.330.15-0.230.15Ret成熟时间(d)11.52.02.53.0 2网织红细胞生成指23 2网织红细胞生成指数网织红细胞生成指数(RPI)的应用的应用RPI在估计红细胞生成有效性和贫血起因在估计红细胞生成有效性和贫血起因的分类方法中起到重要作用的分类方法中起到重要作用。Kinetic等等应用应用RPI较为准确地表达出较为准确地表达出Ret的成熟状的成熟状态，从而对贫血的类型进行划分，如健态，从而对贫血的类型进行划分，如健康者平均康者平均RPI为为1，当，当RPI3时表示红细时表示红细胞生成增加，如溶血性贫血和治疗后的胞生成增加，如溶血性贫血和治疗后的营养性贫血；而营养性贫血；而RPI2时为红细胞生成减时为红细胞生成减少，如缺铁性贫血；对于少，如缺铁性贫血；对于EPO缺乏、无缺乏、无效造血等情况时，效造血等情况时，RPI多在多在23之间，之间，Kinetic法则还无法确定。法则还无法确定。2网织红细24 3网织红细胞成熟度网织红细胞成熟度(IRF)的应用的应用 IRF为为不不成成熟熟的的Ret与与总总Ret的的比比值值，健健康康者者平平均均值值为为0.22，参参考考范范围围0.10.38，IRF越越大大表表示示不不成成熟熟的的Ret的的数数量量越越多多。这这种种幼幼稚稚Ret水水平平的的改改变变一一般般比比患患者者HGB、血血小小板板、白白细细胞胞和和临临床床症症状状的的变变化化出出现现更更早早。IRF和和HFR的的增增高高在在很很多多白白血血病病患患者者化化疗疗中中是是与与粒粒细细胞胞反反应应一一致致的的指指标标和和骨骨髓髓移移植植后后恢恢复复的的第第一一信信号号。IRF与与Ret#和和RPI呈呈一一弱弱的的、显显著著的的正正相相关关：IRF增增加加(0.23)，一一般般伴伴有有Ret#增增加加，提提示示患患者者对对于于贫贫血血有有足足够够的的红红系系反反应应；若若IRF0.23，且且RPI2，则则说说明明红红系系造造血血活活性性下下降降，则则以以慢慢性性肾肾功功能能不不全全居居多多；Ret#正正常常或或略略低低，RPI2，但但IRF0.23，见见于于急急性性感感染染、镰镰状状细细胞胞性性贫贫血血危危象象、妊妊娠娠和和MDS等等状状况况。IRF是是评评价价贫贫血血红红系系增增生生活活性性的的一一项项新新的的有有用用的的指指标标，IRF结结合合Ret#和和RPI可以为进一步阐明贫血分类提供有价值的信息。可以为进一步阐明贫血分类提供有价值的信息。25 4网织红细胞成熟指数网织红细胞成熟指数(RMI)的应用的应用该该参参数数是是计计算算参参数数，可可由由仪仪器器自自动动计计算算，也也可可将将仪仪器器测测定定的的Ret分分群群参参数数经经过过人人工工计计算算得得到到。计计算算公公式式为为：RMI=(MFR+HFR)LFR100%。文文献献报报道道RMI的的参参考考范范围围，男男性性：17%37%，女女性性：1 6%35%。据据报报道道，急急性性白白血血病病化化疗疗后后Ret#正正常常而而RMI较较高高，化化疗疗中中则则Ret#和和RMI都都低低；出出现现溶溶血血危危象象时时Ret#和和RMI都都高高；ITP则则Ret#正正常常而而RMI较高。较高。26 5网织红细胞分群的应用网织红细胞分群的应用LFR 和和HFR可作为贫血鉴别诊断的初筛指标。可作为贫血鉴别诊断的初筛指标。研研究究表表明明，溶溶血血性性贫贫血血(HA)患患者者由由于于骨骨髓髓造造血血功功能能活活跃跃，大大量量新新生生的的Ret释释放放到到外外周周血血，导导致致Ret、LFR和和HFR明明显显增增高高；。肾肾性性贫贫血血时时HFR上上升升，LFR下下降降而而Ret变变化化不不大大；缺缺铁铁性性贫贫血血患患者者铁铁剂剂治治疗疗前前，Ret无无明明显显改改变变，HFR轻轻度度增增高高，铁铁剂剂治治疗疗一一周周后后，Ret及及HFR可可呈呈中中度度增增高高，因因此此两两个个参参数数可可作作为为缺缺铁铁性性贫贫血血患患者者铁铁剂剂治治疗疗后后的的疗疗效效观观察察指指标标；再再生生障障碍碍性性贫贫血血(AA)患患者者外外周周血血Ret中中度度减减低低，而而HFR中中度度增增高高，这这种种现现象象可可能能反反映映了了AA患患者者造造血血功功能能紊紊乱乱时时的的红红细细胞胞生生成成变变化化；在在鉴鉴别别诊诊断断MDS方方面面，MDS患患者者产产生生的的大大量量生生存存期期延延长长的的“幼幼稚稚”的的Ret是是导导致致HFR增加的原因。增加的原因。527HFR和和MFR+HFR可作为骨髓移植、化疗可作为骨髓移植、化疗的监测指标，尤其是的监测指标，尤其是MFR+HFR的变化可以的变化可以作为评价肿瘤患者化疗期间检测骨髓造血作为评价肿瘤患者化疗期间检测骨髓造血功能受抑制和开始恢复的较敏感指标。文功能受抑制和开始恢复的较敏感指标。文献报道献报道，骨髓移植后血小板、中性粒细胞、，骨髓移植后血小板、中性粒细胞、白细胞、白细胞、Ret及目测法及目测法Ret计数恢复的天数计数恢复的天数分别为分别为16.4、16.8、16.2、13.7、14.8 d。HFR和MFR+HFR可作为骨髓移植、化疗的监测指标，尤其28心血管疾病研究发现网织红细胞绝对值在急性心肌梗死（AMI）患者和正常人间存在显著差异，AMI患者中Ret增高组相对于Ret正常组，急性心肌梗死的发生率和住院死亡率均明显升高。心血管疾病研究发现网织红细胞绝对值在急性心肌梗死（AMI）患29肾脏疾病当肾功能处于代偿期时，网织红细胞百分率往往表现出与正常无差异，未成熟网织红细胞（IFR）往往表现出高于正常，显示骨髓处于造血旺盛期；随着病情加重，网织红细胞百分率也逐渐升高。肾病病人应用EPO治疗后，IRF的升高表现的更为明显。故网织红细胞参数的检测在肾病病人的病程和治疗中起着重要作用肾脏疾病当肾功能处于代偿期时，网织红细胞百分率往往表现出与正30肝脏疾病肝脏疾病会出现营养物质的吸收障碍，进而营养不良，造血物质缺乏，产生贫血，机体又会代偿性的加快造血过程，使部分未完全成熟的细胞释放入外周血，所以外周血的网织红细胞计数也会比正常人要高在肝病治疗过程中广泛使用的干扰素是一种具有抑制骨髓增生作用的抗病毒药，用药过程中对骨髓造血功能势必要进行密切观察，此时利用网织红细胞参数反映骨髓造血功能就比骨髓活检要方便的多肝脏疾病肝脏疾病会出现营养物质的吸收障碍，进而营养不良，造血31谢谢！谢谢！32