毛细管电泳法培训课件

文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.1、概述、概述4.2、理论基础、理论基础4.3、毛细管电泳仪、毛细管电泳仪4.4、毛细管电泳分离模式、毛细管电泳分离模式4.5、毛细管电泳应用、毛细管电泳应用1文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.1、概述、概述 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。样品的迁移速度和方向由其电荷移速率不同，可实现分离。样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定。和淌度决定。1937年，年，Tiselius(瑞典瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；球蛋白；1948年，获年，获诺贝尔化学诺贝尔化学奖；奖；2文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。利用电泳现象对利用电泳现象对化学或生物物质化学或生物物质进行分离分析的方法和技术进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。叫电泳法或电泳技术。按形状分类：按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，传统电泳分析：操作烦琐，所用分离柱的柱径大，柱较所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于短，分离效率不高（远低于HPLCHPLC），温度影响大。），温度影响大。4.1.1、经典的电泳分析方法、经典的电泳分析方法3文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。1981年年，Jorgenson等等用用75 m内内径径石石英英毛毛细细管管进进行行电电泳泳分分析析，柱柱效效高高达达40万万/m，迅迅速速发发展展成成为为可可与与GC、HPLC相相媲媲美美的的崭崭新新的的分分离离分分析析技技术术高高效毛细管电泳效毛细管电泳。4.1.2、毛细管电泳分析方法、毛细管电泳分析方法4文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一、采用了一、采用了 0.1mm电泳时，阴离离子在负极最后流出。子在负极最后流出。6文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的特点1、仪器简单、易自动化、仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶2、分析速度快、分离效率高、分析速度快、分离效率高 可在可在3.1 min内分离内分离36种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.1 min内分离内分离了了24种阳离子；分离柱效：种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数理论塔板数3、操作方便、消耗少、操作方便、消耗少、成本低、成本低 进样量极少，进样量极少，nL水平水平4、环境友好、环境友好5、应用范围极广、应用范围极广 无机物、无机物、有机物、生物小分子、中性分子；生物大分子等有机物、生物小分子、中性分子；生物大分子等 7文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.2、理论基础、理论基础4.2.1 电泳电泳 电泳电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：电场力：FE=qE 阻阻 力：力：F=f故：故：qE=f q离子所带的有效电荷；离子所带的有效电荷；E 电场强度；电场强度；离子在电场中的迁移速度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数平动摩擦系数8文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（球形离子球形离子）-溶液粘度溶液粘度 r-离子半径离子半径 物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度淌度：单位电场强度下的平均电泳速度：单位电场强度下的平均电泳速度:所以，迁移速度：所以，迁移速度：9文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.2.2、电渗现象与电渗流电渗现象与电渗流1、电渗流现象、电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面固界面形成双电层，二者之间存在电位差。形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（叫电渗流（electroosmotic flow，EOF）。）。10文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2、HPCE中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流 石英毛细管柱，内充液石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成时，表面电离成-SiO-，管，管内壁带负电荷，形成双电层。内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度的溶液整体向负极移动，速度EOF。11文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：石英毛细管，内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流石英毛细管，内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；向阴极；改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团；表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。3、HPCE中电渗流的方向中电渗流的方向12文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。电渗流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度EOF表示，取决于电渗淌度表示，取决于电渗淌度和电场强度和电场强度E。即。即 EOF=E 电渗淌度取决于电泳介质及双电层的电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即电势，即 =0 0真空介电常数；真空介电常数；介电常数；介电常数；毛细管壁的毛细管壁的Zeta电势。电势。EOF=0 E 实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 EOF=Lef/teo Lef 毛细管有效长度；毛细管有效长度；teo电渗流标记物（中性物质）电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。的迁移时间。4、HPCE中电渗流的大小中电渗流的大小13文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。5、HPCE中电渗流的流形中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管中心处液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管中心处的速度为平均速度的的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。倍（引起谱带展宽较大）。14文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。6、HPCE中电渗流的作用中电渗流的作用各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=EOF+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；阳离子运动方向与电渗流一致；-=EOF-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；阴离子运动方向与电渗流相反；0=EOF 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致；一般离子的电渗速度是电泳速度的一般离子的电渗速度是电泳速度的5-7倍，因此待测组分都能从阴极流出。倍，因此待测组分都能从阴极流出。（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变如同改变LC中的流速；中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；电渗流的微小变化影响结果的重现性；在在HPCE中，中，控制电渗流非常重要。控制电渗流非常重要。15文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.2.3、HPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小特性不同，产生的电渗流大小不同。不同。16文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响 （1）溶液）溶液pH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大；电势增大，电渗流增大；pH3，完全被氢离，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持来保持pH稳定。稳定。（2）阴离子的影响）阴离子的影响 阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。热不同。缓冲溶液缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降流下降。17文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。18文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.温度的影响温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于温度变化来自于“焦耳热焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。强度成正比。温度每变化温度每变化1K，将引起背景电解质溶液黏度变化，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%；19文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。5.添加剂的影响添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，溶液离子强度增大，电渗流减小。电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；电渗流的大小和方向；加入阳离子表面活性剂可改变加入阳离子表面活性剂可改变电渗流方向。电渗流方向。（3 3）加入有机溶剂可改变电渗流大小。）加入有机溶剂可改变电渗流大小。20文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.2.4、淌度淌度 淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。1.有效淌度有效淌度(effective mobility)ef 溶液中溶液中离子的电泳淌度离子的电泳淌度ef=aii（不考虑电渗流）（不考虑电渗流）ai 溶质溶质i 的解离度；的解离度；i 溶质溶质i 在解离状态下的绝对淌度在解离状态下的绝对淌度2.表观淌度表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：ap=ap E ap=ef+EOF21文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.2.5、HPCE中的参数与关系式中的参数与关系式 1.迁移时间（保留时间）迁移时间（保留时间）HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。谱理论也适用。V外加电压；L毛细管总长度；2.分离效率（塔板数）分离效率（塔板数）在在HPCE中，仅考虑纵向扩散，中，仅考虑纵向扩散，2=2Dt 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。物大分子的依据。22文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.分离度分离度 影响分离度的主要因素；工作电压影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：23文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.2.6、影响分离效率的因素影响分离效率的因素区带展宽区带展宽1.纵向扩散的影响纵向扩散的影响 在在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：中，纵向扩散引起的峰展宽：2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；离效率明显下降；实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。24文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：m电解质溶液的摩尔电导；电解质溶液的摩尔电导；I工作电流：工作电流：cm电解质浓度；电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：改善方法：（1）减小毛细管内径；）减小毛细管内径；（2）控制散热；）控制散热；25文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.溶质与管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。积大，又增加了溶质吸附的机会。26文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.3、毛细管电泳仪、毛细管电泳仪4.3.1、仪器流程与主要部件仪器流程与主要部件 电压：电压：0 030 kV30 kV；分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；紫外或激光诱导荧光检测器；激光诱导荧光检测器可检测到：激光诱导荧光检测器可检测到：1010-19-191010-21-21 mol mol27文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。1.高压电源高压电源（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；）电源极性易转换；2.毛细管柱毛细管柱（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；外涂覆聚酰亚胺保护层。检测窗口制作。能差；外涂覆聚酰亚胺保护层。检测窗口制作。（2）规格：内径）规格：内径25100m，外径，外径150400m；长度；长度电泳电泳时时,阴离子在负极阴离子在负极最后流出最后流出,在这种情况下在这种情况下,不但可以不但可以按类分离按类分离,同种类离子由于差速迁同种类离子由于差速迁移被相互分离。移被相互分离。最基本、应用最广的分离模式；最基本、应用最广的分离模式；32文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带电的胶束。浓度，形成一疏水内核、外部带电的胶束。4.4.2、胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱 micellar electrokinetic chromatography，MEKC 在电场力的作用在电场力的作用下，胶束在柱中移下，胶束在柱中移动。动。加入十二烷基磺酸钠加入十二烷基磺酸钠33文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流电渗流 电泳电泳，负电胶，负电胶束以较慢的速度向负极移动；束以较慢的速度向负极移动；5.色谱与电泳分离模式的结合。色谱与电泳分离模式的结合。3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；范围；34文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.4.3、毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、蛋白质、DNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZE模模式很难分离，采用式很难分离，采用CGE能获得良好分离能获得良好分离。采用芯片阵列技术，为完成人类采用芯片阵列技术，为完成人类DNA基因测序，基因测序，CGE作出作出了极大的贡献。了极大的贡献。35文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为驱动力，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动渗流为驱动力，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。色谱过程。4.4.4、毛细管电色谱毛细管电色谱 capillary electroosmostic chromatography，CEC填充柱的基本结构填充柱的基本结构1 入口柱塞入口柱塞;2 填充部分填充部分;3 出口柱塞出口柱塞;4 检测窗口检测窗口;5 开管部分开管部分 36文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.5、毛细管电泳应用、毛细管电泳应用一、离子分析一、离子分析二、药物分析二、药物分析三、手性化合物分析三、手性化合物分析四、氨基酸分析四、氨基酸分析五、核酸分析及五、核酸分析及DNA测序测序六、蛋白质分析六、蛋白质分析37文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。毛细管区带电泳分离毛细管区带电泳分离30种阴离子电泳图种阴离子电泳图38文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。39