金免疫标记技术课件(模板)

知识目标技能目标素质目标1.1.掌握金免疫标记技术原理和分类掌握金免疫标记技术原理和分类2.2.了解标记物的制备了解标记物的制备3.3.了解金免疫检测的临床应用了解金免疫检测的临床应用 1.1.会金免疫标记物的制备操作会金免疫标记物的制备操作2.2.会熟练操作金免疫检测过程会熟练操作金免疫检测过程 树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。具有良好的职业素质和崇高的职业道德。任务目标任务目标v知知识识目目标标技能目技能目标标素素质质目目标标1.掌握金免疫掌握金免疫标记标记技技术术原理和分原理和分类类1.1任务对象任务对象肺炎支原体抗体检测肺炎支原体抗体检测v任任务对务对象肺炎支原体抗体象肺炎支原体抗体检测检测2 任务过程任务过程 复习提问复习提问 案例导入案例导入 讲解与示教讲解与示教学生操作学生操作讨论分析讨论分析 评价、考核评价、考核 课后思考题课后思考题 教教学学环环节节2 30 2 10 40 5 1 v 任任务过务过程程 复复习习提提问问 案例案例导导入入 讲讲解与示教学解与示教学3 患儿，女，患儿，女，患儿，女，患儿，女，11111111岁，间断发热岁，间断发热岁，间断发热岁，间断发热1 1 1 1周，伴咳嗽周，伴咳嗽周，伴咳嗽周，伴咳嗽3 3 3 3天。体温最高天。体温最高天。体温最高天。体温最高39393939。1 1 1 1度，病程第度，病程第度，病程第度，病程第2 2 2 2天查血常天查血常天查血常天查血常规正常，诊断规正常，诊断规正常，诊断规正常，诊断“呼吸道感染呼吸道感染呼吸道感染呼吸道感染”并静滴并静滴并静滴并静滴“阿阿阿阿奇霉素奇霉素奇霉素奇霉素”3 3 3 3天，无明显改变，即而出现咳天，无明显改变，即而出现咳天，无明显改变，即而出现咳天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？所致？所致？所致？如何快速诊断？如何快速诊断？如何快速诊断？如何快速诊断？案例导入案例导入v 患儿，女，患儿，女，11岁岁，间间断断发热发热1周，伴咳嗽周，伴咳嗽3天。体温最高天。体温最高394 斑点金免疫层析法演示斑点金免疫层析法演示斑点金免疫层析法演示斑点金免疫层析法演示 肺炎支原体诊断试剂盒肺炎支原体诊断试剂盒肺炎支原体诊断试剂盒肺炎支原体诊断试剂盒讲解与示教讲解与示教v 斑点金免疫斑点金免疫层层析法演示析法演示 肺炎支原体肺炎支原体诊诊断断试剂试剂盒盒讲讲解与示教解与示教5 二二二二用用用用采采采采血血血血针针针针采采采采指指指指尖尖尖尖血血血血 一一一一洗洗洗洗净净净净双双双双手手手手四四四四立立立立即即即即加加加加1 1 1 1-2 2 2 2滴滴滴滴缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液 三三三三将将将将1 1 1 1滴滴滴滴指指指指尖尖尖尖血血血血滴滴滴滴入入入入加加加加样样样样孔孔孔孔操作操作v 二用采血二用采血针针采指尖血采指尖血 一洗一洗净净双手四立即加双手四立即加1-2滴滴缓缓冲液冲液 三三6步骤步骤步骤步骤5 5：1515分钟读分钟读分钟读分钟读取结果取结果取结果取结果？结果？结果？结果？结果？结果？结果？结果？结果v步步骤骤5：15分分钟读钟读？结结果？果？结结果果7v胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。v了解金免疫检测的临床应用v在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。v会金免疫标记物的制备操作v胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。v01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4，溶液呈红色。v此简单、方便如何用荧光v这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、1820nm、30nm和50nmv四立即加1-2滴缓冲液v01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min30min，直至颜色变红。v（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.v在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。v45m）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。v制备高质量胶体金的注意事项vB液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变v（3）15nm、18nm20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.vB液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变v01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4，溶液呈红色。v这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、1820nm、30nm和50nmv根据需要迅速加入1枸橼酸三钠水溶液4ml、2.老师纠正老师纠正老师纠正老师纠正点评点评点评点评 学生操作学生操作一位学生一位学生一位学生一位学生操作演示操作演示操作演示操作演示学生分组学生分组学生分组学生分组再操作再操作再操作再操作v胶体金是由胶体金是由氯氯金酸（金酸（HAuCl4）在）在还还原原剂剂如白磷、抗坏血酸、枸如白磷、抗坏血酸、枸8讨论分析讨论分析提出问题提出问题为什么在小小的为什么在小小的试纸条上出现两条试纸条上出现两条红线就是阳性结果红线就是阳性结果，如此简单、方便，如此简单、方便的方法可靠吗？的方法可靠吗？有假阳性或假有假阳性或假阴性的可能吗？阴性的可能吗？如何检测出来如何检测出来的，原理是什么？的，原理是什么？v讨论讨论分析分析9胶体金标记技术胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique)是以胶体金作为示是以胶体金作为示踪标记物，应用于踪标记物，应用于抗原抗体反应的一抗原抗体反应的一种新型免疫标记技种新型免疫标记技术。术。讨论分析讨论分析v胶体金胶体金标记标记技技术术(Immunogold labeling t10胶胶体体金金标标记记技技术术讨论分析讨论分析v胶体金胶体金标记标记技技术讨论术讨论分析分析11（一）（一）（一）（一）金免疫检测原理金免疫检测原理胶体金是由氯金酸（胶体金是由氯金酸（胶体金是由氯金酸（胶体金是由氯金酸（HAuCl4HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、）在还原剂如白磷、抗坏血酸、）在还原剂如白磷、抗坏血酸、）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。白质的生物特性。白质的生物特性。白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如结合，如结合，如结合，如SPASPA、PHAPHA、ConAConA等。根据胶体金的一些物理等。根据胶体金的一些物理等。根据胶体金的一些物理等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。讨论分析讨论分析v（一）金免疫（一）金免疫检测检测原理胶体金是由原理胶体金是由氯氯金酸（金酸（HAuCl4）在）在还还原原剂剂12GeobeganGeobeganGeobeganGeobegan等将等将等将等将胶体金标记抗胶体金标记抗胶体金标记抗胶体金标记抗体用于普通光体用于普通光体用于普通光体用于普通光镜下检测镜下检测镜下检测镜下检测B B B B淋淋淋淋巴细脑表面膜巴细脑表面膜巴细脑表面膜巴细脑表面膜免疫球蛋白，免疫球蛋白，免疫球蛋白，免疫球蛋白，建立了光镜水建立了光镜水建立了光镜水建立了光镜水平的免疫金染平的免疫金染平的免疫金染平的免疫金染色。色。色。色。FaulkFaulk和和和和TaylorTaylor首首首首创胶体金标创胶体金标创胶体金标创胶体金标记免疫电镜记免疫电镜记免疫电镜记免疫电镜技术技术技术技术胶体金标记技术胶体金标记技术胶体金标记技术胶体金标记技术进一步发展应用进一步发展应用进一步发展应用进一步发展应用于免疫转印、流于免疫转印、流于免疫转印、流于免疫转印、流式细胞术、液相式细胞术、液相式细胞术、液相式细胞术、液相免疫测定、固相免疫测定、固相免疫测定、固相免疫测定、固相斑点金银染色斑点金银染色斑点金银染色斑点金银染色及斑点金免疫渗及斑点金免疫渗及斑点金免疫渗及斑点金免疫渗滤测定法等多种滤测定法等多种滤测定法等多种滤测定法等多种标记免疫检测方标记免疫检测方标记免疫检测方标记免疫检测方法法法法19711971年年年年19781978年年年年近年来近年来近年来近年来讨论分析讨论分析vGeobegan等将胶体金等将胶体金标记标记抗体用于普通光抗体用于普通光镜镜下下检测检测B淋巴淋巴细细13讨论分析讨论分析枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法鞣酸鞣酸鞣酸鞣酸枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法根据不同根据不同根据不同根据不同的还原剂的还原剂的还原剂的还原剂可以制备可以制备可以制备可以制备大小不同大小不同大小不同大小不同的胶体金的胶体金的胶体金的胶体金颗粒。常颗粒。常颗粒。常颗粒。常用来制备用来制备用来制备用来制备胶体金颗胶体金颗胶体金颗胶体金颗粒的方法粒的方法粒的方法粒的方法v讨论讨论分析枸分析枸橼橼酸三酸三钠还钠还原法鞣酸原法鞣酸枸枸橼橼酸酸钠还钠还原法根据不同原法根据不同14胶体金的制备胶体金的制备胶体金的制备胶体金的制备 1 1 1 1枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法 （1 1 1 1）10nm10nm10nm10nm胶体金粒的制备：取胶体金粒的制备：取胶体金粒的制备：取胶体金粒的制备：取0.010.010.010.01HAuCl4HAuCl4HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液水溶液水溶液100ml100ml100ml100ml，加入，加入，加入，加入1 1 1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液3ml3ml3ml3ml，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸30min30min30min30min，冷却至，冷却至，冷却至，冷却至4444，溶液呈红色。，溶液呈红色。，溶液呈红色。，溶液呈红色。（2 2 2 2）15nm15nm15nm15nm胶体金颗粒的制备：取胶体金颗粒的制备：取胶体金颗粒的制备：取胶体金颗粒的制备：取0.010.010.010.01HAuCl4HAuCl4HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液水溶液水溶液100ml100ml100ml100ml，加入，加入，加入，加入1 1 1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液2ml2ml2ml2ml，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸15min15min15min15min30min30min30min30min，直至颜色变红。冷却后加入，直至颜色变红。冷却后加入，直至颜色变红。冷却后加入，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml0.1Mol/L K2CO30.5ml0.1Mol/L K2CO30.5ml0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。混匀即可。混匀即可。混匀即可。（3 3 3 3）15nm15nm15nm15nm、18nm18nm18nm18nm20nm20nm20nm20nm、30nm30nm30nm30nm或或或或50nm50nm50nm50nm胶体金颗粒的制备：胶体金颗粒的制备：胶体金颗粒的制备：胶体金颗粒的制备：取取取取0.010.010.010.01HAuCl4HAuCl4HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液水溶液水溶液100ml100ml100ml100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入，加热煮沸。根据需要迅速加入，加热煮沸。根据需要迅速加入，加热煮沸。根据需要迅速加入1 1 1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液4ml4ml4ml4ml、2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml、1ml1ml1ml1ml或或或或0.75ml0.75ml0.75ml0.75ml，继续煮沸，继续煮沸，继续煮沸，继续煮沸约约约约5min5min5min5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm15nm15nm15nm、1818181820nm20nm20nm20nm、30nm30nm30nm30nm和和和和50nm50nm50nm50nm讨论分析讨论分析v胶体金的制胶体金的制备备 1枸枸橼橼酸三酸三钠还钠还原法原法讨论讨论分析分析152 2鞣酸鞣酸鞣酸鞣酸枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法 AA液：液：液：液：1 1HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液水溶液水溶液1ml1ml加入加入加入加入79ml79ml双馏水中混匀。双馏水中混匀。双馏水中混匀。双馏水中混匀。BB液：液：液：液：1 1枸橼酸三钠枸橼酸三钠枸橼酸三钠枸橼酸三钠4ml4ml，1 1鞣酸鞣酸鞣酸鞣酸0.7ml0.7ml，0.1Mol/L 0.1Mol/L K2CO3K2CO3液液液液0.2ml0.2ml，混合，加入双馏水至，混合，加入双馏水至，混合，加入双馏水至，混合，加入双馏水至20ml20ml。将将将将AA液、液、液、液、BB液分别加热至液分别加热至液分别加热至液分别加热至6060，在电磁搅拌下迅速将，在电磁搅拌下迅速将，在电磁搅拌下迅速将，在电磁搅拌下迅速将BB液加入液加入液加入液加入AA液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm5nm。如需。如需。如需。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表要制备其它直径的金颗粒，则按表要制备其它直径的金颗粒，则按表要制备其它直径的金颗粒，则按表15-115-1所列的数字所列的数字所列的数字所列的数字调整鞣酸及调整鞣酸及调整鞣酸及调整鞣酸及K2CO3K2CO3的用量的用量的用量的用量 讨论分析讨论分析v2鞣酸鞣酸枸枸橼橼酸酸钠还钠还原法原法讨论讨论分析分析16（1 1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2 2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂试剂试剂试剂经超滤或微孔滤膜（经超滤或微孔滤膜（经超滤或微孔滤膜（经超滤或微孔滤膜（0.45m0.45m）过滤，以除去其中的）过滤，以除去其中的）过滤，以除去其中的）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。聚合物和其它可能混入的杂质。聚合物和其它可能混入的杂质。聚合物和其它可能混入的杂质。制备高质量胶体金的注意事项制备高质量胶体金的注意事项 讨论分析讨论分析v（1）玻璃器皿必）玻璃器皿必须彻须彻底清洗，最好是底清洗，最好是经过经过硅化硅化处处理的玻璃器皿，或理的玻璃器皿，或17（3 3）配制胶体金溶液的）配制胶体金溶液的）配制胶体金溶液的）配制胶体金溶液的pHpH以中性（以中性（以中性（以中性（pH7.2pH7.2）较好。较好。较好。较好。（4 4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。是进口的。是进口的。是进口的。（5 5）氯金酸配成）氯金酸配成）氯金酸配成）氯金酸配成1 1水溶液在水溶液在水溶液在水溶液在4 4可保持数月可保持数月可保持数月可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。最好将整个小包装一次性溶解。最好将整个小包装一次性溶解。最好将整个小包装一次性溶解。制备高质量胶体金的注意事项制备高质量胶体金的注意事项制备高质量胶体金的注意事项制备高质量胶体金的注意事项 讨论分析讨论分析v（3）配制胶体金溶液的）配制胶体金溶液的pH以中性（以中性（pH7.2）较较好。制好。制备备高高质质18v2鞣酸枸橼酸钠还原法v在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。v根据需要迅速加入1枸橼酸三钠水溶液4ml、2.v这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、1820nm、30nm和50nmv会熟练操作金免疫检测过程v会熟练操作金免疫检测过程v会熟练操作金免疫检测过程v（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.v身形成免疫分析过程后的颜色标记v根据需要迅速加入1枸橼酸三钠水溶液4ml、2.v金免疫法能测出抗体，如vB液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变v在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。v（3）15nm、18nm20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.v身形成免疫分析过程后的颜色标记v胶体金标记技术(Immunogold labeling technique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。v四立即加1-2滴缓冲液v在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。v调整鞣酸及K2CO3的用量v（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.v（3）15nm、18nm20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.缺点缺点金标法金标法 优点优点 v灵敏度不如酶标技术灵敏度不如酶标技术灵敏度不如酶标技术灵敏度不如酶标技术v一般作为定性，不易定量。一般作为定性，不易定量。一般作为定性，不易定量。一般作为定性，不易定量。讨论分析讨论分析v2鞣酸鞣酸枸枸橼橼酸酸钠还钠还原法金原法金标标法灵敏度不如法灵敏度不如酶酶标标技技术讨论术讨论分析分析19自带质控对照自带质控对照自带质控对照自带质控对照简便、经济实用简便、经济实用简便、经济实用简便、经济实用符号显示结果符号显示结果符号显示结果符号显示结果快速：全部检测过程快速：全部检测过程快速：全部检测过程快速：全部检测过程仅需仅需仅需仅需 3-203-203-203-20分钟。分钟。分钟。分钟。示踪剂：以胶体金为指示剂，本示踪剂：以胶体金为指示剂，本示踪剂：以胶体金为指示剂，本示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记身形成免疫分析过程后的颜色标记身形成免疫分析过程后的颜色标记身形成免疫分析过程后的颜色标记讨论分析讨论分析可单份检测，稳定性好可单份检测，稳定性好可单份检测，稳定性好可单份检测，稳定性好v自自带质带质控控对对照照简简便、便、经济实经济实用符号用符号显显示示结结果快速：全部果快速：全部检测过检测过程示踪程示踪20斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验夹心法夹心法夹心法夹心法竞争法竞争法竞争法竞争法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法讨论分析讨论分析分类分类分类分类v斑点金免疫斑点金免疫层层析析试验夹试验夹心法心法竞竞争法双抗原争法双抗原夹夹心法双抗体心法双抗体夹夹心法心法讨论讨论分分21 双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法G G区：金标特异性区：金标特异性区：金标特异性区：金标特异性抗体抗体抗体抗体(兔型兔型兔型兔型)C C区：羊区：羊区：羊区：羊抗兔抗兔抗兔抗兔IgIgT T区：特异区：特异区：特异区：特异性抗体性抗体性抗体性抗体 吸水纸吸水纸吸水纸吸水纸标本标本标本标本讨论分析讨论分析v 双抗体双抗体夹夹心法心法G区：金区：金标标特异性抗体特异性抗体(兔型兔型)C区：羊抗兔区：羊抗兔22讨论分析讨论分析v讨论讨论分析分析23竞争法竞争法竞争法竞争法标本标本标本标本GG区：金标特异性抗体区：金标特异性抗体区：金标特异性抗体区：金标特异性抗体(兔型兔型兔型兔型)C C区：羊区：羊区：羊区：羊抗兔抗兔抗兔抗兔IgIgT T区：标准区：标准区：标准区：标准抗原抗原抗原抗原 吸水纸吸水纸吸水纸吸水纸阳性结果阳性结果阳性结果阳性结果讨论分析讨论分析v竞竞争法争法标标本本G区：金区：金标标特异性抗体特异性抗体(兔型兔型)C区：羊抗兔区：羊抗兔IgT区：区：24标本标本G G区：金标特异性抗体区：金标特异性抗体(兔型兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原 吸水纸阴性结果讨论分析讨论分析v标标本本G区：金区：金标标特异性抗体特异性抗体(兔型兔型)C区：羊抗兔区：羊抗兔IgT区：区：标标准抗准抗25讨论分析讨论分析v讨论讨论分析分析26 斑点金免疫渗滤测定法（斑点金免疫渗滤测定法（斑点金免疫渗滤测定法（斑点金免疫渗滤测定法（dot immunodot immunogold filtration assay,DIGFAgold filtration assay,DIGFA）此法原理）此法原理）此法原理）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIVHIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。讨论分析讨论分析v 斑点金免疫渗斑点金免疫渗滤测滤测定法（定法（dot immu27以双抗体夹心法以双抗体夹心法以双抗体夹心法以双抗体夹心法HCGHCGHCGHCG为例：标本中为例：标本中为例：标本中为例：标本中HCGHCGHCGHCG与与与与NCNCNCNC膜上抗膜上抗膜上抗膜上抗-HCG-HCG-HCG-HCG结结结结合，再加胶体金标记的抗合，再加胶体金标记的抗合，再加胶体金标记的抗合，再加胶体金标记的抗-HCG-HCG-HCG-HCG抗体，形成双抗体夹心复合抗体，形成双抗体夹心复合抗体，形成双抗体夹心复合抗体，形成双抗体夹心复合物（红色）物（红色）物（红色）物（红色）讨论分析讨论分析v以双抗体以双抗体夹夹心法心法HCG为为例：例：标标本中本中HCG与与NC膜上抗膜上抗-HCG结结28v1Mol/L K2CO30.vB液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变v调整鞣酸及K2CO3的用量v了解金免疫检测的临床应用v以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结v根据需要迅速加入1枸橼酸三钠水溶液4ml、2.vB液：1枸橼酸三钠4ml，1鞣酸0.v患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。v根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。v01HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。v调整鞣酸及K2CO3的用量v四立即加1-2滴缓冲液v身形成免疫分析过程后的颜色标记vB液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变v会金免疫标记物的制备操作v45m）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。v（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。v（5）氯金酸配成1水溶液在4可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。v在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。v了解金免疫检测的临床应用v01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min30min，直至颜色变红。v了解金免疫检测的临床应用v四立即加1-2滴缓冲液v制备高质量胶体金的注意事项v以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结v制备高质量胶体金的注意事项v免疫能检测出吗？，下一v这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、1820nm、30nm和50nmv1度，病程第2天查血常规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。v根据需要迅速加入1枸橼酸三钠水溶液4ml、2.vB液：1枸橼酸三钠4ml，1鞣酸0.v胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。v身形成免疫分析过程后的颜色标记v胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法v身形成免疫分析过程后的颜色标记v（1）10nm胶体金粒的制备：取0.v01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4，溶液呈红色。v（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。v75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。v（5）氯金酸配成1水溶液在4可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。v以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结v01HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。考核评分表考核评分表考核评分表考核评分表 布置作业布置作业布置作业布置作业 1.1.实验报告实验报告实验报告实验报告评价、考核评价、考核v1Mol/L K2CO30.了解金免疫了解金免疫检测检测的的临临床床应应用考核用考核评评分分29思考题思考题金免疫法能测出抗体，如金免疫法能测出抗体，如金免疫法能测出抗体，如金免疫法能测出抗体，如此简单、方便如何用荧光此简单、方便如何用荧光此简单、方便如何用荧光此简单、方便如何用荧光免疫能检测出吗？，下一免疫能检测出吗？，下一免疫能检测出吗？，下一免疫能检测出吗？，下一次课学习荧光免疫检测，次课学习荧光免疫检测，次课学习荧光免疫检测，次课学习荧光免疫检测，预习相关内容预习相关内容预习相关内容预习相关内容 v思考思考题题金免疫法能金免疫法能测测出抗体，如出抗体，如30