酶联免疫吸附双抗体夹心法培训ppt课件

酶联免疫吸附双抗体夹酶联免疫吸附双抗体夹心法心法酶联免疫吸附双抗体夹心法1Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO一、一、实验目的目的 1 掌握掌握酶酶联联免疫吸附免疫吸附实验实验（ELISAELISA）的原理）的原理2 熟悉熟悉酶酶联联免疫吸附免疫吸附实验实验的操作方法的操作方法酶联免疫吸附双抗体夹心法2一、实验目的 1 掌握酶联免疫吸附实验（ELIYour company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO二、实验原理二、实验原理vv基础知识基础知识基础知识基础知识 19711971年瑞典学者年瑞典学者EngvailEngvail和和Perlmann,Perlmann,荷兰学者荷兰学者VanVan WeermanWeerman和和SchuursSchuurs分别报道将免疫技术发分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即即酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)immunosorbent assay,ELISA)。ELISAELISA现在现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)immunoenzymatic techniques)的基础上发的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。展起来的一种新型的免疫测定技术。酶联免疫吸附双抗体夹心法3二、实验原理基础知识酶联免疫吸附双抗体夹心法3Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO 甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（fetoprotein fetoprotein fetoprotein fetoprotein，AFPAFPAFPAFP）一种含一种含4%4%碳水化合物的单链糖蛋白，分子量碳水化合物的单链糖蛋白，分子量70KD70KD，半衰期，半衰期 5 5天，由天，由592 592 个氨基酸残基的单肽链组成。基因位于第个氨基酸残基的单肽链组成。基因位于第4 4对对染色体染色体4q1124q214q1124q21区域，由区域，由 15 15 个外显子和个外显子和1414个内含子组个内含子组成，属于血清中一种成，属于血清中一种球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。自自19631963年发现以来年发现以来，作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用于临床。它对原发性肝癌的早期诊断具有重要意义，同时于临床。它对原发性肝癌的早期诊断具有重要意义，同时对肝细胞癌的鉴别诊断，流行病学调查和理论研究都很有对肝细胞癌的鉴别诊断，流行病学调查和理论研究都很有价值。价值。酶联免疫吸附双抗体夹心法4甲胎蛋白（fetoprotein，AFP）酶联免疫吸附双Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO酶联免疫吸附双抗体夹心法培训ppt课件5Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO双抗体夹心法双抗体夹心法v方法方法方法方法 用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物显色显色。固相固相固相固相(包被包被包被包被)抗体抗体抗体抗体Ab+Ab+样样品品品品(抗原抗原抗原抗原Ag)+Ag)+酶酶酶酶标标抗体抗体抗体抗体Ab*Ab*Ab-Ag-Ab*+Ab-Ag-Ab*+底物底物底物底物(TMB)(TMB)显显色色色色应用应用应用应用 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因因因因为其一端要为其一端要为其一端要为其一端要与与与与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端包被于固相载体上的抗体作用，而另一端包被于固相载体上的抗体作用，而另一端包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用则要与酶标记特异性抗体作用则要与酶标记特异性抗体作用则要与酶标记特异性抗体作用。酶联免疫吸附双抗体夹心法6双抗体夹心法方法酶联免疫吸附双抗体夹心法6Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO双抗体夹心法图示双抗体夹心法图示双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+-E EE EE EE EE EE EE EE EE E酶联免疫吸附双抗体夹心法7双抗体夹心法图示1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO三、实验仪器三、实验仪器&试剂试剂v仪器 全自动酶标仪、全自动酶标洗板机酶联免疫吸附双抗体夹心法8三、实验仪器&试剂仪器酶联免疫吸附双抗体夹心法8Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO试剂试剂试剂试剂 待测血清、抗待测血清、抗待测血清、抗待测血清、抗-AFP-L3-AFP-L3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过抗体、封闭蛋白溶液、辣根过抗体、封闭蛋白溶液、辣根过抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶（氧化物酶（氧化物酶（氧化物酶（HRPHRP）、底物四甲基联苯胺（）、底物四甲基联苯胺（）、底物四甲基联苯胺（）、底物四甲基联苯胺（TMB)TMB)、显色液、显色液、显色液、显色液、终止液终止液终止液终止液OR:OR:甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）定量测定试剂盒（酶联免疫法）定量测定试剂盒（酶联免疫法）定量测定试剂盒（酶联免疫法）定量测定试剂盒（酶联免疫法）酶联免疫吸附双抗体夹心法9试剂酶联免疫吸附双抗体夹心法9Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO四、实验步骤四、实验步骤获得获得AFPAFP未标定抗体未标定抗体将将AFPAFP抗体与固相抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加血清形成加血清形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物酶联免疫吸附双抗体夹心法10四、实验步骤获得AFP未标定抗体将AFP抗体与固相洗涤除去未Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加加HRPHRP酶标抗体生成酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤未结合彻底洗涤未结合 的的HRPHRP酶标抗体酶标抗体 加底物四甲基联苯胺加底物四甲基联苯胺(TMB(TMB)进行酶催化反应进行酶催化反应 根据颜色反应的程度根据颜色反应的程度进行进行AFPAFP的定量测定的定量测定酶联免疫吸附双抗体夹心法11洗涤除去其他加HRP酶标抗体生成彻底洗涤未结合加底物四甲基联Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO详细步骤详细步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。酶联免疫吸附双抗体夹心法12详细步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔1Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37温育30 分钟。4.配液：将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。酶联免疫吸附双抗体夹心法132.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)常用底物：常用底物：(1)(1)邻苯二胺邻苯二胺(OPD)(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。：反应显橙黄色，应避光，致癌性。(2)(2)四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)：TMBTMB是一种脂溶性较强的基团，是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRPHRP活性活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。酶反应用部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。酶反应用HCLHCL或或H2SO4H2SO4终止后，终止后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为长为 450nm450nm。酶联免疫吸附双抗体夹心法14辣根过氧化物酶(HRP)常用底物：酶联免疫吸附双抗体夹心法1Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO五、结果分析五、结果分析以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。酶联免疫吸附双抗体夹心法15五、结果分析以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO六、思考题六、思考题试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？（一）固相载体（二）抗原（三）试验样品（四）结合物 (五）洗涤剂与稀释剂（六）底物（七）作用时间 (八)试验的重复性（精确度）（九）对使用仪器要求 酶联免疫吸附双抗体夹心法16六、思考题试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？（一）固相Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO六、应用六、应用v检查抗原半抗原检查抗原半抗原检查抗原半抗原检查抗原半抗原1.内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等2.在血液学方面可用于检查凝固因子（如第凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等 v检查抗体检查抗体检查抗体检查抗体1.在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。2.在病原微生物方面已用于检查链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体。酶联免疫吸附双抗体夹心法17六、应用检查抗原半抗原酶联免疫吸附双抗体夹心法17Your company sloganYour company sloganLOGOLOGOLOGOLOGO酶联免疫吸附双抗体夹心法18谢谢大家！酶联免疫吸附双抗体夹心法18