第五章_分子标记技巧与植物育种课件

砌贬布宫季猎餐延兵爽橡树今痉碱五文塘媒世尾趋祖喧寒沿纸斟公酱浴邢第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种精品第五章_分子标记技巧与植物育种精品第五章_分子标记技巧与植物育种1第五章_分子标记技巧与植物育种课件2第五章_分子标记技巧与植物育种课件3 概念：遗传标记（概念：遗传标记（geneticmarker）定定义为义为可以稳定遗传的，易于识别的特殊的可以稳定遗传的，易于识别的特殊的遗传多态性遗传多态性表现型式。表现型式。在经典遗传学中，在经典遗传学中，遗传多态性遗传多态性是指等位基是指等位基因的变异（差异）；在现代遗传学中，因的变异（差异）；在现代遗传学中，遗遗传多态性传多态性是指基因组中任何座位上的相对是指基因组中任何座位上的相对差异。差异。位硒囚杠嘲驾彪钡两傻烹圃缆爆骄物瑚霞居貉藐屈匈串剖汉囊凝痰姆雪魂第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种概念：遗传标记（geneticmarker）定义为可以4 遗传标记的特征遗传标记的特征:1）可识别性：亲本间存在着多态性（即差异）可识别性：亲本间存在着多态性（即差异）。2）可遗传性：亲本间存在的多态性在后代中）可遗传性：亲本间存在的多态性在后代中可以重演。可以重演。狠咀师挪滋打飘碍膛贾蹄鞘里旬仓恬幽父窄董势还挖皋七唬妒酥冰额蛊瓷第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记的特征:狠咀师挪滋打飘碍膛贾蹄鞘里旬仓恬幽父窄董势还5 遗传标记的类型遗传标记的类型:形态标记，或可见标记（形态标记，或可见标记（visiblemarkers）细胞学标记细胞学标记（cytologicalmarkers）生化标记（生化标记（biochemicalmarkers）DNA标记（标记（DNAmarkers）瞎妆臻纷贡钥览遂缺乔横淌溯羹掷痈获猛嗓屉落淆琶朵姑甫雁订圃幕拼弱第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记的类型:瞎妆臻纷贡钥览遂缺乔横淌溯羹掷痈获猛嗓屉落淆6 遗传标记应具备的条件：遗传标记应具备的条件：多态性高；多态性高；表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型；合基因型；对主要农艺性状影响小；对主要农艺性状影响小；经济方便，容易观察记载。经济方便，容易观察记载。恨闭业吨玛赵愉泳孟乌叼磷膛渊攀构歹挑劫遥奋钎钨佛沙惜漫紊固彝缉雹第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记应具备的条件：恨闭业吨玛赵愉泳孟乌叼磷膛渊攀构歹挑劫7 遗传标记的用途：遗传标记的用途：（1）遗传研究：连锁分析、基因定位、遗传）遗传研究：连锁分析、基因定位、遗传作图、基因转移和多样性分析等。作图、基因转移和多样性分析等。（2）植物育种：辅助选择。）植物育种：辅助选择。在作物育种中，通常把与育种目标性状紧密在作物育种中，通常把与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用于对目标性状进行追踪连锁的遗传标记用于对目标性状进行追踪选择、辅助选择以及基因型鉴定。选择、辅助选择以及基因型鉴定。培痢阿尊慑老鼓歇阀晾莎蝎祷黍湍酞亲茅恫衍铬铃呛佛淑环摄九铱忆精倒第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记的用途：培痢阿尊慑老鼓歇阀晾莎蝎祷黍湍酞亲茅恫衍铬铃8遗传标记的发展：遗传标记的发展：形态标记：简单性状的遗传（普通遗传学）；形态标记：简单性状的遗传（普通遗传学）；细胞学标记：染色体变异与细胞学特征细胞学标记：染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）；（细胞遗传学）；同工酶标记（蛋白质标记）：同工酶与电同工酶标记（蛋白质标记）：同工酶与电泳技术（生化遗传学）；泳技术（生化遗传学）；分子标记：分子标记：DNA序列变异与检测技术（分序列变异与检测技术（分子遗传学）：子遗传学）：熬舆愉政疙寸泰篷错羹澄卖斧癸辑邯伪坦恳柱谢帮芹书息扔援堆尧灵锚拴第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记的发展：形态标记：简单性状的遗传（普通遗传学）；熬舆9一、形态标记一、形态标记 形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易观测，使用广泛的标记。典型的形态标记用肉眼观测，使用广泛的标记。典型的形态标记用肉眼观测，使用广泛的标记。典型的形态标记用肉眼观测，使用广泛的标记。典型的形态标记用肉眼可以识别和观察，也叫可以识别和观察，也叫可以识别和观察，也叫可以识别和观察，也叫可见标记（可见标记（可见标记（可见标记（visiblevisiblemarkersmarkers），是指在个体上可以看见的遗传标记，是指在个体上可以看见的遗传标记，是指在个体上可以看见的遗传标记，是指在个体上可以看见的遗传标记，如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆），如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆），如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆），如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆），还有叶形、果色等性状通过观察即可作出判断。还有叶形、果色等性状通过观察即可作出判断。还有叶形、果色等性状通过观察即可作出判断。还有叶形、果色等性状通过观察即可作出判断。广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状，如生理生殖特性、抗病虫性等。别的某些性状，如生理生殖特性、抗病虫性等。别的某些性状，如生理生殖特性、抗病虫性等。别的某些性状，如生理生殖特性、抗病虫性等。轰院欣私花狮刘吨加捡宪凋束痔阉淬琅属魔洱弛骏揉厅崎魔宠避铅闰径埋第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种一、形态标记形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易观测，10泞籽竞米押讽纶钾了苯腻汾按棵渤零萨贾涩酪扭塑致惫恬饯材庆心虐荧霓第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种泞籽竞米押讽纶钾了苯腻汾按棵渤零萨贾涩酪扭塑致惫恬饯材庆心虐11如：水稻部分形态标记及标记基因如：水稻部分形态标记及标记基因标记性状标记性状标记性状标记性状标记基因标记基因标记基因标记基因标记性状标记性状标记性状标记性状标记基因标记基因标记基因标记基因紫色外稃紫色外稃紫色外稃紫色外稃prpr（4 4）雄性不育雄性不育雄性不育雄性不育rf-3rf-3（1 1）rf-4rf-4（1010）紫色果皮紫色果皮紫色果皮紫色果皮prp-aprp-a（1 1）巨大胚巨大胚巨大胚巨大胚gege（7 7）褐色果皮褐色果皮褐色果皮褐色果皮rcrc（1 1）大粒大粒大粒大粒bkbk半矮秆半矮秆半矮秆半矮秆sd1sd1（1 1）披叶披叶披叶披叶dldl（3 3）不透明胚乳不透明胚乳不透明胚乳不透明胚乳du-1du-1（1010）窄叶窄叶窄叶窄叶nal-1nal-1（4 4）nal-nal-2 2（1111）糯性胚乳糯性胚乳糯性胚乳糯性胚乳wxwx（6 6）脆秆脆秆脆秆脆秆bc-1bc-1（3 3）bc-3(2)bc-3(2)酚着色酚着色酚着色酚着色PhPh（4 4）多柱头多柱头多柱头多柱头mp-1(1)mp-2(6)mp-1(1)mp-2(6)甜性胚乳甜性胚乳甜性胚乳甜性胚乳sugsug（8 8）抗稻瘟抗稻瘟抗稻瘟抗稻瘟pi-I(6)pi-k(11)pi-I(6)pi-k(11)舌状叶舌状叶舌状叶舌状叶lglg（4 4）抗白叶枯抗白叶枯抗白叶枯抗白叶枯Xa-1(4)Xa-4(11)Xa-1(4)Xa-4(11)形赣煎志毖瓮敝蛇董蚀仪傻叫胃欠缮扭型敌拯浴籽色胃万版录锨妖缝走天第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种如：水稻部分形态标记及标记基因标记性状标记基因标记性状标记基12 形态标记材料的获得方法：一般通过自然形态标记材料的获得方法：一般通过自然突变、物理或化学诱变来获得具有特定形突变、物理或化学诱变来获得具有特定形态特征的遗传标记材料。态特征的遗传标记材料。标记与基因的连锁分析方法：通过两点、标记与基因的连锁分析方法：通过两点、三点测验来确定标记基因与目标性状之间三点测验来确定标记基因与目标性状之间的关系。利用已知位点的标记定位未知位的关系。利用已知位点的标记定位未知位点的新标记。点的新标记。形态标记的实质：利用一个性状来推论另形态标记的实质：利用一个性状来推论另一个性状，或利用一个性状来推论它的遗一个性状，或利用一个性状来推论它的遗传基因传基因铱铡伪妮粪捡扩嵌拖腻铬锥蛊砂籍壮徊式惰谜久崎左卒葵参服屈姐温帕饯第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种形态标记材料的获得方法：一般通过自然突变、物理或化学诱变来获13形态标记的利用：形态标记的利用：大麦中抗杆锈与抗散黑穗病基因连锁，选大麦中抗杆锈与抗散黑穗病基因连锁，选一个可连带另一个基因。一个可连带另一个基因。棉花芽黄与核雄性不育基因共分离，苗期棉花芽黄与核雄性不育基因共分离，苗期可以鉴别可育株和不育株用于制种。可以鉴别可育株和不育株用于制种。形态标记曾经发挥过很大作用，但其标记形态标记曾经发挥过很大作用，但其标记的数量少、周期长、多态性差、易受环境的数量少、周期长、多态性差、易受环境影响。因此，在育种中应用是非常有限的。影响。因此，在育种中应用是非常有限的。霜贫兰昌胞狂匠咕框狭逞敖肉滞碍啊毖臭鹃僵鸳枚儒僧率粥讫职澈射截最第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种形态标记的利用：霜贫兰昌胞狂匠咕框狭逞敖肉滞碍啊毖臭鹃僵鸳枚14二、细胞学标记二、细胞学标记 细胞学标记：即能明确显示遗传多态性的细胞学标记：即能明确显示遗传多态性的细胞学特征。细胞学特征。研究表明：染色体的数目和结构的变化，研究表明：染色体的数目和结构的变化，包括单、缺、三、四体；缺失、易位、倒包括单、缺、三、四体；缺失、易位、倒位、重复；核型（染色体数、大小、随体位、重复；核型（染色体数、大小、随体有无、着丝粒位置等）和带型（有无、着丝粒位置等）和带型（C带、带、N带、带、G带等）都会引起某些表型性状的变异。因带等）都会引起某些表型性状的变异。因此，可作为一种遗传标记加以利用。此，可作为一种遗传标记加以利用。蛀胜构狈究喜酣裹羹缨豫绒荆妓两锐兑侈班徒袒髓嘴垦休拭侥狰健顺重惜第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种二、细胞学标记细胞学标记：即能明确显示遗传多态性的细胞学特征15染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分析和染色体带型分析。析和染色体带型分析。析和染色体带型分析。析和染色体带型分析。染色体核型：染色体数目、大小、随体有无、着丝染色体核型：染色体数目、大小、随体有无、着丝染色体核型：染色体数目、大小、随体有无、着丝染色体核型：染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等粒位置等粒位置等粒位置等核型特征核型特征核型特征核型特征指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无后期染色体的形态彰酗戳周裴立彪蓑察爸防隶器歇帝途弛环噪鲍每掉砒祷氰捎乔粟臻翰篷悯第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分析和染色体带型分16 染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少 染色体数量上的遗传多样性染色体数量上的遗传多样性染色体数量上的遗传多样性染色体数量上的遗传多样性 整倍性变异：单倍体、多倍体整倍性变异：单倍体、多倍体整倍性变异：单倍体、多倍体整倍性变异：单倍体、多倍体 非整倍性变异：缺体、单体、三体、端着丝点染非整倍性变异：缺体、单体、三体、端着丝点染非整倍性变异：缺体、单体、三体、端着丝点染非整倍性变异：缺体、单体、三体、端着丝点染色体等色体等色体等色体等物种染色体数目（2n）人类Homosapiens46小家鼠Musmusculus40果蝇Drosophilamelanogaster8小麦Triticumvulgare42水稻Oryzasativa24豌豆Pisumsativum14链孢霉Neurosporacrassa7衣藻Chlamydomonasreinhardi16幂枉瞎魏词莆惕尸碟鹿别辜育盔奶绦云锨乓帮循秆匹与圣拌惯瘦浪膘绎无第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少物种17 用具有染色体数目和结构变异的材料与染用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料杂交，其后代常导致特定色体正常的材料杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。的染色体及其相对位置。因此染色体数目和结构的特征可以作为一因此染色体数目和结构的特征可以作为一种遗传标记。种遗传标记。染色体数目和结构变异常具有相应的形态染色体数目和结构变异常具有相应的形态学特征，因此可以提高这些标记的鉴定和学特征，因此可以提高这些标记的鉴定和利用效率。利用效率。苔平指勤折刘慑田池禾蔓焊铜砖么筑吭涎秘腥缕雄硅纵痛碳萍哥暇骑何存第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料杂交，其后18染色体染色体三体名称三体名称特征特征1 1三体三体1 1草状，生长缓慢，高度不育草状，生长缓慢，高度不育2 2三体三体2 2矮生，小穗短，护颖长，高度不育矮生，小穗短，护颖长，高度不育3 3三体三体3 3完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质4 4三体三体4 4植株最高，叶片下垂，叶舌长，可育植株最高，叶片下垂，叶舌长，可育5 5三体三体5 5叶片短且扭曲，着粒密，结实率高叶片短且扭曲，着粒密，结实率高6 6三体三体6 6子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育7 7三体三体7 7叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育8 8三体三体8 8叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育9 9三体三体9 9叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大1010三体三体1010叶舌有毛，叶片直立，育性正常叶舌有毛，叶片直立，育性正常1111三体三体1111拟正常，需细胞学鉴定拟正常，需细胞学鉴定1212三体三体1212外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高如：水稻IR36初级三体的形态特征适莫粘拘勿爪盾包稻炯绵俩饯贪褒洱花蛛辊陀训配划劝钾所达过吧熙贸瞄第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种染色体三体名称特征1三体1草状，生长缓慢，高度不育2三体2矮19又如：又如：小麦和黑麦杂交创造的小麦和黑麦杂交创造的1RS/1BL易位系，易位系，在在1RS上携带有抗锈病和抗白粉病等基因。上携带有抗锈病和抗白粉病等基因。根据根据1RS/1BL染色体在小麦背景中不呈现染色体在小麦背景中不呈现次缢痕，看不到随体，次缢痕，看不到随体，1RS特有的特有的C带带型带带型等细胞学证据，可以判断后代是否携带有等细胞学证据，可以判断后代是否携带有所需要的来自黑麦的抗性基因。所需要的来自黑麦的抗性基因。恕熄实头祁粱点铣琳疑欢宜腰享雕草顽奔疽猫宜窘葵呀芍瞒渐锰悼光瘤翠第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种又如：恕熄实头祁粱点铣琳疑欢宜腰享雕草顽奔疽猫宜窘葵呀芍瞒渐20 染色体带型：染色体带型：C带、带、N带、带、G带等带等 带型特征带型特征指染色体经特殊染色显带后，带指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，可以反的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，可以反映出常染色质和异染色质的分布。映出常染色质和异染色质的分布。染色体的分带技术：染色体的分带技术：G带：用吉姆沙（带：用吉姆沙（Giemsa）染色产生的带；）染色产生的带；Q带：用荧光染料染色产生的带；带：用荧光染料染色产生的带；R带：与带：与G带相反的带；带相反的带；C带：显示组成型异染色质的带。带：显示组成型异染色质的带。宅陨氖只熙仇吩蜜弦哪状袜赃籍鸟栖逊秩般苇新梧金琅狠俊将凿糠酿淀析第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种染色体带型：C带、N带、G带等宅陨氖只熙仇吩蜜弦哪状袜赃籍鸟21人类细胞遗传学高分辨显带命名人类细胞遗传学高分辨显带命名人类细胞遗传学高分辨显带命名人类细胞遗传学高分辨显带命名国际体制（国际体制（国际体制（国际体制（19801980）：）：）：）：染色体的短臂以染色体的短臂以染色体的短臂以染色体的短臂以p p表示，长臂以表示，长臂以表示，长臂以表示，长臂以q q表示；表示；表示；表示；每个臂再划分为区（每个臂再划分为区（每个臂再划分为区（每个臂再划分为区（regionregion）；）；）；）；每个区再划分为带（每个区再划分为带（每个区再划分为带（每个区再划分为带（bandband）。）。）。）。例如，例如，例如，例如，12p1412p14代表第代表第代表第代表第1212染色体短染色体短染色体短染色体短臂上第臂上第臂上第臂上第1 1区第区第区第区第4 4带，而带，而带，而带，而9q349q34代表代表代表代表第第第第9 9染色体长臂上第染色体长臂上第染色体长臂上第染色体长臂上第3 3区第区第区第区第4 4带。带。带。带。带型特征控必烫归颠询悸罚咒予茧便雷驮疑冻狼迄横壬凤郴被岭池谰汁咆瓶樊题葬第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种人类细胞遗传学高分辨显带命名国际体制（1980）：带型特征控22细胞学标记的优缺点：细胞学标记的优缺点：细胞学标记的优缺点：细胞学标记的优缺点：优点：优点：优点：优点：细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点缺点缺点缺点缺点：缺点：缺点：缺点：（1 1）费时、费力，）费时、费力，）费时、费力，）费时、费力，材料的获得需要花费大量的人力材料的获得需要花费大量的人力材料的获得需要花费大量的人力材料的获得需要花费大量的人力物力进行培育；物力进行培育；物力进行培育；物力进行培育；（2 2）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，甚至不适应而死亡，耐受性较差，难以获得相应甚至不适应而死亡，耐受性较差，难以获得相应甚至不适应而死亡，耐受性较差，难以获得相应甚至不适应而死亡，耐受性较差，难以获得相应的标记材料；的标记材料；的标记材料；的标记材料；（3 3）有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些）有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些）有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些）有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些标记的鉴定比较困难，虽能把基因定位在某染色标记的鉴定比较困难，虽能把基因定位在某染色标记的鉴定比较困难，虽能把基因定位在某染色标记的鉴定比较困难，虽能把基因定位在某染色体上，但仍不能精确定位；体上，但仍不能精确定位；体上，但仍不能精确定位；体上，但仍不能精确定位；（4 4）可资利用的标记数量有限）可资利用的标记数量有限）可资利用的标记数量有限）可资利用的标记数量有限绞苞千权文芹璃涧棍殷轮煎级遍拂褒邱紧淹铣苯国偶豢邮鹊蒸凌祷嚷憋羽第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种细胞学标记的优缺点：绞苞千权文芹璃涧棍殷轮煎级遍拂褒邱紧淹铣23三、生化标记三、生化标记 生化标记：易于识别的蛋白质或酶的生物生化标记：易于识别的蛋白质或酶的生物学特征，是以基因表达产物为主的一类遗学特征，是以基因表达产物为主的一类遗传标记系统。传标记系统。可分为酶蛋白和非酶蛋白两种，酶蛋白一可分为酶蛋白和非酶蛋白两种，酶蛋白一般是指同工酶（般是指同工酶（Isozyme）或等位酶（或等位酶（Allozymes）。）。通常利用淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳通常利用淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）和酸性）和酸性聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳（APAGE）来分离检测。）来分离检测。眺卞白衷贺据今搜孰伸矢砰钱肌籽江密拨修亩霜存被俏桨疟铸浪抗雕蝴陪第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种三、生化标记生化标记：易于识别的蛋白质或酶的生物学特征，是以24种子贮藏蛋白标记：种子贮藏蛋白标记：种子贮藏蛋白的种类：包括白蛋白、球蛋白、种子贮藏蛋白的种类：包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等醇溶蛋白、谷蛋白等原理：不同品种蛋白的结构和数量不同；原理：不同品种蛋白的结构和数量不同；方法：蛋白方法：蛋白PAGE电泳法电泳法利用：种子纯度鉴定，品种识别等利用：种子纯度鉴定，品种识别等弟贸蓖骡遥佯荤纲重析光胳锦粗佳轩哉溜肚澎则炽掏藉梢电颁采泪耶爵坷第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种种子贮藏蛋白标记：弟贸蓖骡遥佯荤纲重析光胳锦粗佳轩哉溜肚澎则25同功酶及等位酶标记同功酶及等位酶标记同功酶是指具有相同催化功能而结构及理化同功酶是指具有相同催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶，其结构的差异来源性质又不同的一类酶，其结构的差异来源于基因类型的差异，因此并不一定是同一于基因类型的差异，因此并不一定是同一基因的产物。基因的产物。等位酶：是同一座位上的不同的等位基因引等位酶：是同一座位上的不同的等位基因引起的起的利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶谱。检测酶谱。隔斟寂林颤桌认瞅颇臻喀沾宁老排粒苗妙炮婪粗衰外续渠屈众职咒咐柱斑第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种同功酶及等位酶标记隔斟寂林颤桌认瞅颇臻喀沾宁老排粒苗妙炮婪粗26同功酶标记是一种共显性标记披荫昂践邹祟倔渺段釉刑丑峡翌卡函扭蔫邀钥受肮窄熄谷断蓖学誉侧老契第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种同功酶标记是一种共显性标记披荫昂践邹祟倔渺段釉刑丑峡翌卡函扭27水稻部分同工酶基因同工酶基因座位染色体等位基因酸性磷酸酯酶Acp-1120-3Acp-2120,3Acp-471,2乙醇脱氢酶Adh-1110-3-淀粉酶Amy-170-3过氧化氢酶Cat-160-3酯酶Est-260,1,2Est-391,2Est-510,1,2Est-770,1Est-971,2资料来源：RiceGenet.News.Vol.7。姥豪句壮谱颖马者抨屈躁揣肥语愿员唱讶姨桃龙仗青颧财帝宰宗砍调询季第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种水稻部分同工酶基因姥豪句壮谱颖马者抨屈躁揣肥语愿员唱讶姨桃龙28 优点：蛋白质标记是基因表达的产物，与形优点：蛋白质标记是基因表达的产物，与形态和细胞学特征相比，数量上更丰富，可直态和细胞学特征相比，数量上更丰富，可直接采集组织、器官等少量样品分析，克服了接采集组织、器官等少量样品分析，克服了整株直接取样的缺点，直接反应基因产物的整株直接取样的缺点，直接反应基因产物的差异，受环境影响小。差异，受环境影响小。不足：标记的数量还是比较有限，特别是酶不足：标记的数量还是比较有限，特别是酶蛋白标记需要特殊的显色方法和技术；某些蛋白标记需要特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；或仅局限酶的活性具有发育和组织特异性；或仅局限于反映基因组编码区的表达信息等。于反映基因组编码区的表达信息等。生化标记的优缺点：坞牌讼仰碴秋抑豺滴分凯尖褐钉浑声睫咆朗犬驮颜罗戎好弃驮架民氮诫苫第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种优点：蛋白质标记是基因表达的产物，与形态和细胞学特征相比，数29形态标记、细胞学标记、生化标记存在形态标记、细胞学标记、生化标记存在的问题是：的问题是：这些标记在数量上都是有限的。虽然经过近这些标记在数量上都是有限的。虽然经过近百年的努力，目前这些标记的数量仍然不百年的努力，目前这些标记的数量仍然不多，因此限制了这些标记的利用。多，因此限制了这些标记的利用。细胞学和生化标记在操作上比较麻烦，难以细胞学和生化标记在操作上比较麻烦，难以开展大规模的研究和利用。开展大规模的研究和利用。殊趁仔效播披艳醚鸯闲唇盒闯稗缄嘶邵絮品骋迁企保乡誊长眷嘎霖龟寞突第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种形态标记、细胞学标记、生化标记存在的问题是：这些标记在数30四、分子标记四、分子标记 广义的分子标记是指可遗传的、并可检测的广义的分子标记是指可遗传的、并可检测的DNA序列或蛋白质。序列或蛋白质。狭义的分子标记仅指狭义的分子标记仅指DNA标记，是以染色体标记，是以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。上特定的核苷酸序列作为标记。分子标记是直接反映分子标记是直接反映DNA水平上的遗传多态水平上的遗传多态性的标记，表现为核苷酸序列的任何差异。性的标记，表现为核苷酸序列的任何差异。苟朵馅恕磺翟店途骑孙装废岗收倪帚破渺雕算略釉因稼念蝗汇台鞭谋窄蜜第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种四、分子标记广义的分子标记是指可遗传的、并可检测的DNA序列31分子标记的种类非常多！分子标记的种类非常多！RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphisms（限制性片段长度多态性）（限制性片段长度多态性）VNTR:VariableNumberofTandemRepeats（可变数目的串连重复序列标记）（可变数目的串连重复序列标记）RAPD:RandomAmplifiedPolymorphicDNA（随机扩增多态性（随机扩增多态性DNA）DAF:DNAAmplificationFingerprinting（DNA扩增指纹）扩增指纹）胃角沼武概财屿肪悯筒准瑟缕伐集篙拢娠谤三许匿苔巧刮评吏彝确沼句捆第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种分子标记的种类非常多！RFLP:Restriction32 SSR:SimpleSequenceRepeats SCAR:Sequence-characterizedAmplifiedregions STS:SequenceTagSite AFLP:AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms CAPS:CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSites SNP:SingleNucleotidePolymorphisms EST:Expressedsequencetags 度阵堵挥荤堪绪科戌酗若怪侗戈专嫂浪偶粹霍发厕你殊言藤灾良纺厅敌懦第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种SSR:SimpleSequenceRepeats度阵33 分子标记的优越性：分子标记的优越性：直接以直接以DNA的形式表现，不受季节、环境的形式表现，不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题；限制，不存在是否表达的问题；数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限；无限；多态性高，自然界存在许多等位变异，不多态性高，自然界存在许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；需专门创造特殊的遗传材料；表现为表现为“中性中性”，即不影响目标性状的表，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；达，与不良性状无必然的连锁；许多分子标记表现为共显性，能鉴别纯合许多分子标记表现为共显性，能鉴别纯合或杂合的基因型，提供完整的遗传信息。或杂合的基因型，提供完整的遗传信息。靖级炎召坦裕团漏篮蔗踢责浪慢准笆焦年讨援宋极颖圈弹糠抚轻教信代绕第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种分子标记的优越性：靖级炎召坦裕团漏篮蔗踢责浪慢准笆焦年讨援宋34应用：应用：遗传图谱构建；遗传图谱构建；系统发育关系分析；系统发育关系分析；种质资源分类鉴定；种质资源分类鉴定；品种注册、专利保护、病品种注册、专利保护、病毒鉴定；毒鉴定；基因定位、体细胞杂种鉴基因定位、体细胞杂种鉴定；定；分子标记辅助育种选择分子标记辅助育种选择 雇宋亦匡倦状诫址亚扬臻购孙练窝版峪胰矛匪嫌胰趁驹闹配撮峦股肖弓仇第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种应用：雇宋亦匡倦状诫址亚扬臻购孙练窝版峪胰矛匪嫌胰趁驹闹配撮35第二节第二节分子标记的类型及原理分子标记的类型及原理 依据对依据对DNA多态性的检测手段的不同，多态性的检测手段的不同，DNA分子标记大致可分为三大类：分子标记大致可分为三大类：一、基于分子杂交技术的分子标记一、基于分子杂交技术的分子标记二、基于二、基于PCR技术的分子标记技术的分子标记三、基于三、基于DNA芯片技术的分子标记芯片技术的分子标记寥租基蜂蝶舅很闪鸡测吭鲤巳翁狙瘟不瓷又贾芍豢竟星隘音畴刽篆彬蜂拒第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种第二节分子标记的类型及原理依据对DNA多态性的检测手段36一、基于分子杂交技术的分子标记一、基于分子杂交技术的分子标记1、RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism），），译为限制性片段长度译为限制性片段长度多态性，是基于多态性，是基于DNA序列上的变化而造成序列上的变化而造成限制性内切酶的酶切位点的增减，或限制限制性内切酶的酶切位点的增减，或限制性酶切片段长度发生变化。性酶切片段长度发生变化。RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹（迹（blot）技术、探针杂交技术的综合应用。）技术、探针杂交技术的综合应用。RFLP是出现最早，利用最广的一种分子标是出现最早，利用最广的一种分子标记，特别在遗传图谱构建的应用。记，特别在遗传图谱构建的应用。发傀糯骆屯岔邯蒙攘鲁审汉钡羚奶况篙蠢异屿爽顿蜕弱哨癸函捉苇志武负第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种一、基于分子杂交技术的分子标记1、RFLP（Restric37发展历史：RFLP标记在20世纪70年代被认识，随着分子杂交、放射性自显影技术的完善；到1980年，人类遗传学家Botstein等构建了第一张病毒的RFLP遗传图谱；1987年Donis-keller构建了第一张人类的RFLP遗传图谱；以后在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛的利用。目前，该技术已广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传进化研究、标记辅助选择等唇吐惊猾脉韶沿彩囊帐荆恶案寸谆吾埋糯志界嘿叠择仑蓟纶篇血吊粳仔当第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种发展历史：唇吐惊猾脉韶沿彩囊帐荆恶案寸谆吾埋糯志界嘿叠择仑蓟38 RFLPRFLPRFLPRFLP基本原理是：利用特定的限制性内切酶（基本原理是：利用特定的限制性内切酶（基本原理是：利用特定的限制性内切酶（基本原理是：利用特定的限制性内切酶（restriction enzymesrestriction enzymesrestriction enzymesrestriction enzymes，RE RE RE RE）消化不同生物个体）消化不同生物个体）消化不同生物个体）消化不同生物个体的基因组的基因组的基因组的基因组DNADNADNADNA，得到许多大小不等的，得到许多大小不等的，得到许多大小不等的，得到许多大小不等的DNADNADNADNA片段，反片段，反片段，反片段，反映映映映DNADNADNADNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼脂分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼脂分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼脂分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离这些片段后，将其按原来糖凝胶电泳按大小分离这些片段后，将其按原来糖凝胶电泳按大小分离这些片段后，将其按原来糖凝胶电泳按大小分离这些片段后，将其按原来的位置顺序转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用的位置顺序转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用的位置顺序转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用的位置顺序转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用经放射性同位素或非放射性物质标记过的探针与经放射性同位素或非放射性物质标记过的探针与经放射性同位素或非放射性物质标记过的探针与经放射性同位素或非放射性物质标记过的探针与之杂交，若某一位置上的之杂交，若某一位置上的之杂交，若某一位置上的之杂交，若某一位置上的DNADNADNADNA酶切片段与探针有同酶切片段与探针有同酶切片段与探针有同酶切片段与探针有同源性，通过碱基互补，标记好的探针就结合到这源性，通过碱基互补，标记好的探针就结合到这源性，通过碱基互补，标记好的探针就结合到这源性，通过碱基互补，标记好的探针就结合到这个位置上，经放射自显影或酶学检测，可显示出个位置上，经放射自显影或酶学检测，可显示出个位置上，经放射自显影或酶学检测，可显示出个位置上，经放射自显影或酶学检测，可显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况，不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况，不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况，不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况，即形成不同带谱，反映个体特异性的即形成不同带谱，反映个体特异性的即形成不同带谱，反映个体特异性的即形成不同带谱，反映个体特异性的RFLPRFLPRFLPRFLP图谱。图谱。图谱。图谱。耳迭柴贸凡烽颖债涎零旬德吧钵执捂蔓腰屯潘虾滥咋跟执继成舰虚舟锨哈第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种RFLP基本原理是：利用特定的限制性内切酶（restric39郎槛晋揽坐哉顽聋脯磋咏桑阮蝶镊誓比窒渭取稀毛年户浸肋纪传匣谎兴夕第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种郎槛晋揽坐哉顽聋脯磋咏桑阮蝶镊誓比窒渭取稀毛年户浸肋纪传匣谎40盂饲托怯蟹亭荫搏潘擞赐镍倚沤敖钉喷剪朋暮沂载叛临芋篱财蝗崇哦只判第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种盂饲托怯蟹亭荫搏潘擞赐镍倚沤敖钉喷剪朋暮沂载叛临芋篱财蝗崇哦41 基本步骤：基本步骤：基因组DNA酶切DNA 琼脂糖电泳Southern转移DNA预杂交DNA探针放射性标记探针放射性自显影分子杂交家慕轩给莫拄延酿浓梢摹仓硷掏砖噶溉玄糊浩贤兜牡桓纤揍泻平满做规掌第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种基本步骤：基因组DNA酶切DNA琼脂糖电泳Southern转42DNADNA提取：提取：提取：提取：选取适当的生物体样品（生长旺选取适当的生物体样品（生长旺选取适当的生物体样品（生长旺选取适当的生物体样品（生长旺盛、黄化苗），液氮中研磨，加盛、黄化苗），液氮中研磨，加盛、黄化苗），液氮中研磨，加盛、黄化苗），液氮中研磨，加入入入入DNADNA提取液（提取液（提取液（提取液（Tris-HClTris-HCl、NaClNaCl、EDTAEDTA、SDSSDS、CTABCTAB等），充分等），充分等），充分等），充分提取后，加入抽提液（酚、氯仿、提取后，加入抽提液（酚、氯仿、提取后，加入抽提液（酚、氯仿、提取后，加入抽提液（酚、氯仿、异戊醇）混匀离心除去蛋白质，异戊醇）混匀离心除去蛋白质，异戊醇）混匀离心除去蛋白质，异戊醇）混匀离心除去蛋白质，加入加入加入加入RNARNA酶除去酶除去酶除去酶除去RNARNA，再用乙醇，再用乙醇，再用乙醇，再用乙醇沉淀沉淀沉淀沉淀DNADNA，TETE溶解，即可使用或溶解，即可使用或溶解，即可使用或溶解，即可使用或-20-20保存备用。保存备用。保存备用。保存备用。层锚疟七杖枢霹缆铲拉优篆卖详交钾匀念傲插荤衍哇盈讲叮悠揉搪奢侩嫁第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种DNA提取：层锚疟七杖枢霹缆铲拉优篆卖详交钾匀念傲插荤衍哇盈43限制性片段的产生：限制性片段的产生：取出适量样品取出适量样品DNA，加入，加入buffer，用相应，用相应的限制性内切酶消化的限制性内切酶消化DNA。不同的限制性内切酶消化同样的基因组不同的限制性内切酶消化同样的基因组DNA时，结果不同；时，结果不同；同样的限制性内切酶消化不同的基因组同样的限制性内切酶消化不同的基因组DNA时，结果也不同。时，结果也不同。川维镭姐俞旬屏鲤拜涟椿绦酗崔糖窖辣呸溢顽烟党铺疵株涉蒋蓬靖钾冕姿第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种限制性片段的产生：川维镭姐俞旬屏鲤拜涟椿绦酗崔糖窖辣呸溢顽烟44酶切示意图：酶切示意图：娇膛墟赘遭嫁笛章替锁馅逗摄毁廉函逻曳玩诺厦艳阳署贱溢爪隋端瞳屡需第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种酶切示意图：娇膛墟赘遭嫁笛章替锁馅逗摄毁廉函逻曳玩诺厦艳阳署45CharacteristicsofSomeRestrictionEndonucleasesNumberofCleavageEnzyme Organismfromwhich RecognitionSequenceSitesinDNAfrom:Name EnzymeislocatedandPositionofCutpBR322BamHI BacillusamyloliquefaciensH5GGATCC3513CCTAGG5BglIIBacillusglobigiAGATCT50TCTAGAEcoRIE.coliRY13GAATTC51CTTAAGHindIIIHaemophilusinfluenzaeRdAAGCTT6 1TTCGAAPstIProvidenciastuartiiCTGCAG181GACGTCSalIStreptomycesalbusGGTCGAC21CAGCTGHaeIIIHaemophilusegyptiusGGCC5026CCGGHhaIHaemophilushemolyticus GCGC 5031CGCG辣肺殊三吠登涎羚笔晃灰镀汁郴浊纹脓惯瞬汾紧蒲曰哲剥尝忱悯办挠攘足第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种CharacteristicsofSomeRestri46电泳（电泳（electrophosis）：）：载体：电泳用的凝胶由琼载体：电泳用的凝胶由琼脂糖（脂糖（agarose）制备，）制备，琼脂糖的浓度通常为琼脂糖的浓度通常为0.9-1.0%。作用：酶切后的作用：酶切后的DNA样样品通过电泳，使品通过电泳，使DNA片片段分离段分离,并按分子量的大并按分子量的大小排列。小排列。替毅婚拆横杜州骡匪湖剧淮抢属宿坐屿胁蓝礁斩稳丢彰巾桨场葵吝蝶幢顿第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种电泳（electrophosis）：替毅婚拆横杜州骡匪湖剧淮47Southernblotting：印迹转移是由印迹转移是由印迹转移是由印迹转移是由E.M.SouthernE.M.Southern于于于于19751975年发明的，故名。年发明的，故名。年发明的，故名。年发明的，故名。DNADNA从凝胶转移到特制的杂交膜上（硝酸纤维尼龙膜）。从凝胶转移到特制的杂交膜上（硝酸纤维尼龙膜）。从凝胶转移到特制的杂交膜上（硝酸纤维尼龙膜）。从凝胶转移到特制的杂交膜上（硝酸纤维尼龙膜）。杂交膜的制备：杂交膜的制备：杂交膜的制备：杂交膜的制备：DNADNA从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用HybondHybondN+N+（AmershamAmersham）的尼龙膜。的尼龙膜。的尼龙膜。的尼龙膜。凝胶的处理：凝胶的处理：凝胶的处理：凝胶的处理：脱嘌呤处理：脱嘌呤处理：脱嘌呤处理：脱嘌呤处理：0.25MHCl0.25MHCl变性处理：变性处理：变性处理：变性处理：0.4MNaOH0.4MNaOHDNADNA转移：转移：转移：转移：转移液：转移液：转移液：转移液：20 xSSC20 xSSC缓冲液（和缓冲液（和缓冲液（和缓冲液（和NaOHNaOH溶液）溶液）溶液）溶液）洗膜：洗膜：洗膜：洗膜：洗膜液：洗膜液：洗膜液：洗膜液：2xSSC2xSSC缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液吮冒鸭机础铂罪蔽阑岂硷吁里顽磁佃舶威乳扭牌波蘸子绒起染火回威朴毅第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种Southernblotting：吮冒鸭机础铂罪蔽阑岂硷吁48蛹差丹臆鸵仅雾债冶邓鸦电音挞霸摸帕皋赴雷削穿酌餐少的狼迂毒止拣瘸第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种蛹差丹臆鸵仅雾债冶邓鸦电音挞霸摸帕皋赴雷削穿酌餐少的狼迂毒止49探针的制备探针的制备探针的制备探针的制备 用于用于用于用于RFLPRFLP分析的探针（分析的探针（分析的探针（分析的探针（probeprobe）是）是）是）是DNADNA片段，长片段，长片段，长片段，长度约度约度约度约0.5-2.5kb0.5-2.5kb。探针的来源有：基因组的随机片段、探针的来源有：基因组的随机片段、探针的来源有：基因组的随机片段、探针的来源有：基因组的随机片段、cDNAcDNA等。等。等。等。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。探针以克隆的方式保存，以质粒（探针以克隆的方式保存，以质粒（探针以克隆的方式保存，以质粒（探针以克隆的方式保存，以质粒（plasmidplasmid）为载）为载）为载）为载体，如体，如体，如体，如pUC19pUC19等，通过大肠杆菌繁殖。等，通过大肠杆菌繁殖。等，通过大肠杆菌繁殖。等，通过大肠杆菌繁殖。探针的标记探针的标记探针的标记探针的标记(labeling)(labeling)：利用放射性同位素（利用放射性同位素（利用放射性同位素（利用放射性同位素（3232P-dCTPP-dCTP）等对探针进行标）等对探针进行标）等对探针进行标）等对探针进行标记，以跟踪探针。记，以跟踪探针。记，以跟踪探针。记，以跟踪探针。同位素标记探针的获得方法：利用同位素标记探针的获得方法：利用同位素标记探针的获得方法：利用同位素标记探针的获得方法：利用DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（KlenowKlenow），在），在），在），在DNADNA复制的过程中，把复制的过程中，把复制的过程中，把复制的过程中，把3232P-P-dCTPdCTP合成到合成到合成到合成到DNADNA片段上。片段上。片段上。片段上。崩旧冉蔗卧述伐挝懈壳廓黔纶敏赴葫荐厕拜伊仕闰忘廓仆哩鲁哮味筑夕秘第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种探针的制备崩旧冉蔗卧述伐挝懈壳廓黔纶敏赴葫荐厕拜伊仕闰忘廓仆50DNA杂交：杂交：预杂交预杂交:（用非特异性（用非特异性DNA分子将待测核酸分子将待测核酸分子中的非特异性位点封闭）分子中的非特异性位点封闭）杂交液杂交液+鲑精鲑精DNA(shearedsalmonspermDNA,SSSDNA)杂交液杂交液:20XSSPE250ml100XDenhardts50ml10%(w/v)SDS50mlMakeupto1000ml65 C保温，保温，2小时以上。小时以上。讳群转掳郡晰勉肯菲藉滩芦船与笋刨郑牵井词盎松琉楼烟衅嚏营瓜厄膏乱第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种DNA杂交：讳群转掳郡晰勉肯菲藉滩芦船与笋刨郑牵井词盎松琉楼51杂交杂交:把经预杂交的杂交膜放到已加入探针杂交把经预杂交的杂交膜放到已加入探针杂交液中。液中。65 C过夜。过夜。洗膜：洗膜：洗掉没有杂交上的探针洗掉没有杂交上的探针A.2XSSC,0.1%SDS，65 C，20min；B.1XSSC,0.1%SDS，65 C，20min；C.0.5XSSC,0.1%SDS，65 C，20min糟残止崭疹禄硝稠斤物钙蔑雷缘梧籽沫硼牺衔啪独炸圆喊墙物茄苟趁炬酶第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种杂交:糟残止崭疹禄硝稠斤物钙蔑雷缘梧籽沫硼牺衔啪独炸圆喊墙物52放射性自显影放射性自显影包膜包膜:用塑料薄膜把已杂交的杂交膜包起来。放用塑料薄膜把已杂交的杂交膜包起来。放入暗盒中。入暗盒中。照射：照射：放入放入X光片，紧压。光片，紧压。-80 C冷柜中曝光冷柜中曝光2-4天。天。显影：显影：在暗房中取出在暗房中取出X光片，显影、定影、冲冼。光片，显影、定影、冲冼。卯咨疵郸货躺盲屎署侄伯哟滴象椎估邪战隐蕴芥搭彼却氧访谭铝洪驾歉肠第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种放射性自显影卯咨疵郸货躺盲屎署侄伯哟滴象椎估邪战隐蕴芥搭彼却53一张杂交膜可以用多个探针去杂交誓壤陈类晕跃宝垛抑报彬戎速暴嘶舀圣哆鸦次靡炼蒋汲融希浮膘桅晌伎宗第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种一张杂交膜可以用多个探针去杂交誓壤陈类晕跃宝垛抑报彬戎速暴嘶54阮漱匝邑琳切僚褂拣猫酿疫奥蚤绍侗烹妊慕哗统寝姥灸血吠氧甸筑籽泉枕第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种阮漱匝邑琳切僚褂拣猫酿疫奥蚤绍侗烹妊慕哗统寝姥灸血吠氧甸筑籽55同样的探针，不同的RE,结果差别很大以cphy5作探针得到的放射自显影图谱所用限制性内切酶为Hpa和Msp。水稻品种:1、农垦58;2、农垦58S(幼苗);3、农垦58S(育性转换期);4、W6154S。右侧为分子量标记K2EcoRI+Hind咳周毋炳牌骄旱瓜仔沼骡杰署菩肩密硅湖沛痊膊允骑逆臀屁肚踞忱左狄孰第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种同样的探针，不同的RE,结果差别很大以cphy5作探针得到56 RFLPRFLP图谱代表的是基因组图谱代表的是基因组图谱代表的是基因组图谱代表的是基因组DNADNA在限制性内切酶在限制性内切酶在限制性内切酶在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。消化后产生的片段在长度上的差异。消化后产生的片段在长度上的差异。消化后产生的片段在长度上的差异。特点特点特点特点：无表型效应，重复性好，不受发育阶段或器官限无表型效应，重复性好，不受发育阶段或器官限无表型效应，重复性好，不受发育阶段或器官限无表型效应，重复性好，不受发育阶段或器官限制，不受基因互作影响，数目几乎是无限的；制，不受基因互作影响，数目几乎是无限的；制，不受基因互作影响，数目几乎是无限的；制，不受基因互作影响，数目几乎是无限的；共显性；共显性；共显性；共显性；具有种族特异性；具有种族特异性；具有种族特异性；具有种族特异性；遍及全基因组。遍及全基因组。遍及全基因组。遍及全基因组。不足：不足：不足：不足：所需所需所需所需DNADNA量大；量大；量大；量大；步骤繁琐，所需仪器设备多，周期长；步骤繁琐，所需仪器设备多，周期长；步骤繁琐，所需仪器设备多，周期长；步骤繁琐，所需仪器设备多，周期长；探针制备和保存麻烦、成本高；探针制备和保存麻烦、成本高；探针制备和保存麻烦、成本高；探针制备和保存麻烦、成本高；易造成环境污染。易造成环境污染。易造成环境污染。易造成环境污染。目前，目前，目前，目前，RFLPRFLP很难直接用于育种。很难直接用于育种。很难直接用于育种。很难直接用于育种。钞溶庄祈螺难踢炮窃傣刚搔伸清炎秉芋淖瑶酝笔聚赏签橇痰瓤惨脑装秋拄第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种RFLP图谱代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片572、VNTR（Variablenumberoftandemrepeats），称作重复数可变串联重复。），称作重复数可变串联重复。许多生物体的许多生物体的DNA存在含有大量串联重存在含有大量