第二章生物制药工艺技术基础课件

第二章第二章生物制药工艺技术基础生物制药工艺技术基础第二章生物制药工艺技术基础1生化制药的六个阶段生化制药的六个阶段1.原料的选择和预处理原料的选择和预处理2.细胞的粉碎细胞的粉碎3.提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。艺过程。4.纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。过程。5.浓缩、干燥及保存浓缩、干燥及保存6.制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。生化制药的六个阶段2第一节第一节生物材料与生物活性物质生物材料与生物活性物质一、一、生物材料的来源生物材料的来源概述：概述：1.动动、植植物物、微微生生物物的的组组织织、器器官官、细细胞胞与与代代谢谢产产物物是是生生产产生物药物的生物资源；生物药物的生物资源；2.动动植植物物细细胞胞培培养养与与微微生生物物发发酵酵技技术术是是获获得得生生物物制制药药原原料料的的重要途径；重要途径；3.基因工程技术、细胞工程技术和酶工程技术是开发生物基因工程技术、细胞工程技术和酶工程技术是开发生物制药资源的新途径。制药资源的新途径。第一节生物材料与生物活性物质3第二章生物制药工艺技术基础课件4（一）（一）动物脏器动物脏器主主要要来来源源是是猪猪、牛牛、羊羊和和家家禽禽、鱼鱼类类等等的的脏脏器器，包包括括胰胰脏脏、脑、胃粘膜、肝脏、脾脏、小肠、脑垂体和心脏等。脑、胃粘膜、肝脏、脾脏、小肠、脑垂体和心脏等。1.胰胰脏脏位位于于胃胃的的后后方方，横横于于腹腹后后壁壁，是是动动物物体体内内不不可可替替代代的的实实质质性性腺腺体体之之一一。分分泌泌胰胰岛岛素素和和胰胰高高血血糖糖素素，调调节节糖糖的的代代谢谢；还还分分泌泌各各种种消消化化酶酶，如如胰胰蛋蛋白白酶酶、胰胰淀淀粉粉酶酶、胰胰脂脂肪肪酶酶。已已用用胰脏提取的生物药物有胰脏提取的生物药物有40多种。多种。2.脑脑脑脑组组织织富富含含脂脂质质，脑脑组组织织中中脂脂类类占占13.5%，蛋蛋白白质质占占8-10%，脂脂类类物物质质主主要要是是磷磷脂脂、肌肌醇醇磷磷脂脂、神神经经磷磷脂脂、脑脑苷苷脂脂、神经节苷脂和胆固醇，还有神经递质和多种神经肽。神经节苷脂和胆固醇，还有神经递质和多种神经肽。（一）动物脏器53.胃胃其其位位置置、形形态态因因人人而而异异，一一般般在在左左上上腹腹，瘦瘦长长型型的的人人常常为为垂垂直直的的长长胃胃。为为动动物物的的消消化化器器官官，主主要要分分泌泌消消化化液液，如如胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原蛋白酶等。胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原蛋白酶等。4.肝肝脏脏位位于于右右上上腹腹部部，是是机机体体内内最最大大的的实实质质性性腺腺体体，是是机机体体的的“生生化化反反应应器器”，含含有有复复杂杂的的酶酶系系。已已知知的的肝肝脏脏酶酶达达数数百百种种。用用肝肝脏脏可可制制备备肝肝注注射射液液、肝肝水水解解物物、肝肝细细胞胞生生长长因因子子、造血因子等。造血因子等。5.脾脾脏脏位位于于胃胃的的左左后后侧侧,左左侧侧9-11肋肋骨骨内内侧侧的的一一个个长长圆圆形形暗暗红红色色器器官官,是是体体内内最最大大的的周周围围淋淋巴巴器器官官、免免疫疫器器官官，已已用用于生产的药物有脾水解物、脾于生产的药物有脾水解物、脾RNA和脾转移因子。和脾转移因子。3.胃其位置、形态因人而异，一般在左上腹，瘦长型的人66.小小肠肠消消化化和和吸吸收收的的主主要要场场所所，小小肠肠的的长长度度在在成成人人平平均均是是5-7米，含有米，含有30多种胃肠道激素。多种胃肠道激素。7.脑脑垂垂体体悬悬垂垂于于脑脑的的底底部部，体体积积很很小小，总总重重量量不不到到1克克，但但结结构构复复杂杂，包包括括腺腺垂垂体体和和神神经经垂垂体体两两部部分分，分分泌泌的的激激素素种种类类多多，作用广泛，并能调节其他内分泌腺的活动。作用广泛，并能调节其他内分泌腺的活动。8.心脏心脏位于胸腔内，膈肌的上方，二肺之间，是一个厚壁的位于胸腔内，膈肌的上方，二肺之间，是一个厚壁的肌性有腔器官，具有节律性的收缩能力。心脏含有丰富的糖元、肌性有腔器官，具有节律性的收缩能力。心脏含有丰富的糖元、激素和酶类，用心脏为原料生产的药物主要有细胞色素激素和酶类，用心脏为原料生产的药物主要有细胞色素C、辅辅酶酶Q10和心血通注射液。和心血通注射液。6.小肠消化和吸收的主要场所，小肠的长度在成人平均是7（二二）血血液液、分分泌泌物物和和其其他代谢物他代谢物以以血血液液为为原原料料可可生生产产多多种种药药物物，如如凝凝血血酶酶、血血红红蛋蛋白白、SOD、干扰素等。干扰素等。其其他他，如如尿尿液液、胆胆汁汁、蛇蛇毒毒、蜂毒也是重要的生物材料。蜂毒也是重要的生物材料。（二）血液、分泌物和其他代谢物8（三）（三）海洋生物海洋生物海海洋洋生生物物约约占占全全球球生生物物的的一一半半，估估计计多多达达5亿亿种种，是是开开发发新药的重要宝库。新药的重要宝库。1.海海藻藻已已从从藻藻类类生生物物中中发发现现、提提取取了了一一些些抗抗肿肿瘤瘤、防防治治心心血管疾病、治疗慢性气管炎、驱虫、抗放射线物质等。血管疾病、治疗慢性气管炎、驱虫、抗放射线物质等。2.腔肠动物腔肠动物属于原始多细胞动物，已应用的不多，已提取属于原始多细胞动物，已应用的不多，已提取的有前列腺素类、萜类抗菌物质、抗癌物质。的有前列腺素类、萜类抗菌物质、抗癌物质。（三）海洋生物93.节节肢肢动动物物其其中中的的某某些些甲甲壳壳动动物物（包包括括虾虾、蟹蟹）可可供供药药用用，从从中中提提取取的的甲甲壳壳素素可可用用于于甲甲亢亢、肿肿瘤瘤、肝肝炎炎、肾肾炎炎和和糖糖尿尿病病等等的的辅辅助助治治疗疗，另另外外在在食食品品工工业业上上有有重重要要用用途途，如如用用于于废水处理、食品添加剂、减肥。废水处理、食品添加剂、减肥。4.软软体体动动物物包包括括螺螺、蚌蚌类类和和乌乌贼贼等等，已已从从其其中中提提取取出出一一些些具具有有抗抗病病毒毒、抗抗肿肿瘤瘤、抗抗菌菌、降降血血脂脂、止止血血、平平喘喘作作用用的的多糖、多肽、毒素等。多糖、多肽、毒素等。5.棘棘皮皮动动物物包包括括海海星星、海海胆胆、海海参参，关关于于海海胆胆的的研研究究很很多多，已提取到不少药物，还发现了在化工方面的应用。已提取到不少药物，还发现了在化工方面的应用。3.节肢动物其中的某些甲壳动物（包括虾、蟹）可供药用，从106.鱼类鱼类可制造多种药物，最常用的是鱼肝油。可制造多种药物，最常用的是鱼肝油。7.爬爬行行动动物物海海生生爬爬行行动动物物有有海海蛇蛇、海海龟龟等等，海海蛇蛇毒毒液液含含有多种酶类。有多种酶类。8.海洋哺乳动物海洋哺乳动物从鲸鱼、海豚，可以提取多种药物。从鲸鱼、海豚，可以提取多种药物。6.鱼类可制造多种药物，最常用的是鱼肝油。11（四）（四）植物植物药药用用植植物物品品种种繁繁多多，除除含含有有生生物物碱碱、强强心心苷苷、黄黄酮酮、皂皂苷苷、挥挥发发油油、树树脂脂、鞣鞣质质等等有有效效药药理理成成分分外外，还还含含有有氨氨基基酸酸、蛋蛋白白质质、酶酶、激激素素、糖糖类类、脂脂类类、维生素等生化成分。维生素等生化成分。如如天天花花粉粉蛋蛋白白、菠菠萝萝蛋蛋白白酶酶、木瓜蛋白酶、凝集素、多糖等。木瓜蛋白酶、凝集素、多糖等。（四）植物12药用植物中的主要药理成分：药用植物中的主要药理成分：1.生生物物碱碱，是是生生物物体体中中一一类类含含氮氮有有机机化化合合物物的的总总称称，它它们们有有类类似碱的性质，能和酸结合成盐。如麻黄碱、吗啡。似碱的性质，能和酸结合成盐。如麻黄碱、吗啡。2.强强心心苷苷，是是一一类类对对心心肌肌有有兴兴奋奋作作用用，具具有有强强心心生生理理活活性性的的成成分分，它它们们的的分分子子中中都都有有一一个个C17位位被被不不饱饱和和内内酯酯环环所所取取代代的的甾甾体体母母核核。如洋地黄毒苷。如洋地黄毒苷。3.黄黄酮酮，系系两两个个芳芳环环通通过过三三碳碳链链相相互互连连结结而而成成的的一一系系列列化化合合物物，大多数具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷。大多数具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷。银银杏杏中中含含银银杏杏素素、异异银银杏杏素素、白白果果素素等等都都是是黄黄酮酮类类，它它们们具具有有解痉、降压、扩张冠状血管等药理作用。解痉、降压、扩张冠状血管等药理作用。药用植物中的主要药理成分：1.生物碱，是生物体中一类含氮有机134.皂皂苷苷，是是一一类类比比较较复复杂杂的的化化合合物物，它它们们的的水水溶溶液液振振摇摇时时能能产产生生大大量量持持久久的的蜂蜂窝窝状状泡泡沫沫，与与肥肥皂皂相相似似，故故名名皂皂苷苷。它它们们有有减减低低液液体体表表面面张张力力的的作作用用，可可以以乳乳化化油油脂脂，用用做做去去垢垢剂。人参中含皂苷总量约剂。人参中含皂苷总量约4%。5.挥挥发发油油，是是具具香香味味和和挥挥发发性性、可可随随水水蒸蒸气气蒸蒸馏馏的的易易流流动动的的油油状状液液体体。它它们们多多数数具具有有多多方方面面的的药药理理作作用用，如如解解表表、发发汗汗、驱驱风风、镇镇痛痛、杀杀虫虫、抗抗菌菌。薄薄荷荷、茴茴香香、樟樟木木、桂桂皮皮都含有挥发油。都含有挥发油。6.树脂，树脂，常与挥发油、树胶、有机酸等混合存在，与挥发油常与挥发油、树胶、有机酸等混合存在，与挥发油共存的称油树脂，与树胶共存的称胶树脂，与芳香族酸共共存的称油树脂，与树胶共存的称胶树脂，与芳香族酸共存的称香树脂。药用的如松香、乳香、没药、安息香等存的称香树脂。药用的如松香、乳香、没药、安息香等.4.皂苷，是一类比较复杂的化合物，它们的水溶液振摇时能产生大147.鞣鞣质质，又又称称丹丹宁宁，鞣鞣酸酸，是是存存在在于于植植物物中中的的一一类类分分子子较较大大的的复复杂杂多多元元酚酚类类化化合合物物，可可与与蛋蛋白白质质结结合合成成不不溶溶于于水水的的沉沉淀淀，故故能能与与生生兽兽皮皮结结合合而而形形成成致致密密、柔柔顺顺、不不易易腐腐败败又又难难以以透透水水的的皮皮革革，所所以以称称为为鞣鞣质质。茶茶叶叶、柿柿子子中中含含有有丰丰富富的的鞣鞣质质。鞣鞣质质可可用用于于解解毒毒、抗抗菌菌、治治疗疗烧烧伤伤（使使创创面面收收敛敛、干燥、结痂）。干燥、结痂）。7.鞣质，又称丹宁，鞣酸，是存在于植物中的一类分子较大的复杂15（五）（五）微生物微生物微微生生物物资资源源非非常常丰丰富富，其其代代谢谢产产物物有有1300多多种种，已已大大量量生生产产的的才才近近100种种，微微生生物物酶酶有有几几千千种种，已已被被应应用用的的才才几几十十种种，可见其应用前景广阔。可见其应用前景广阔。1.细细菌菌常常用用细细菌菌发发酵酵法法生生产产乳乳酸酸（消消毒毒防防腐腐药药，用用于于空空气气消毒）、醋酸、丙酮、丁酸，它们在医药工业应用很广。消毒）、醋酸、丙酮、丁酸，它们在医药工业应用很广。利利用用细细菌菌生生产产氨氨基基酸酸、有有机机酸酸、糖糖类类、核核苷苷酸酸类类、维维生生素素、酶，发展潜力很大。酶，发展潜力很大。用用埃埃希希氏氏大大肠肠杆杆菌菌生生产产的的天天冬冬酰酰胺胺酶酶是是治治疗疗肿肿瘤瘤的的第第一一个个酶酶制剂。制剂。（五）微生物162.放放线线菌菌是是最最重重要要的的抗抗生生素素产产生生菌菌，已已有有的的1000多多种种抗抗生生素素产产自自放放线线菌菌；还还利利用用放放线线菌菌生生产产氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸类类、维生素、酶。维生素、酶。3.真真菌菌可可以以利利用用真真菌菌生生产产酶酶、有有机机酸酸、氨氨基基酸酸、核核酸酸、维维生生素素、促促生生素素、多多糖糖；还还可可以以直直接接利利用用真真菌菌本本身身作作为为药药物，如灵芝、银耳、冬虫夏草。物，如灵芝、银耳、冬虫夏草。4.酵母菌酵母菌可生产维生素、蛋白质、多肽和核酸等。可生产维生素、蛋白质、多肽和核酸等。2.放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有的1000多种17（六）（六）开发生物新资源开发生物新资源1.动植物细胞的大规模培养动植物细胞的大规模培养2.应应用用基基因因工工程程技技术术，生生产产各各种种生生物物活活性性物物质质，尤尤其其适适合于在自然界中含量低、活性高的一些微量物质的生产。合于在自然界中含量低、活性高的一些微量物质的生产。（六）开发生物新资源18二、二、生物活性物质的存在方式生物活性物质的存在方式（一）（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能生物活性物质的存在方式与其生物功能生生物物活活性性物物质质分分为为“胞胞内内”与与“胞胞外外”两两种种存存在在部部位。位。存存在在于于细细胞胞内内的的生生物物活活性性物物质质有有些些游游离离在在胞胞浆浆中中，有些结合于质膜或器膜上，或存在于细胞器内。有些结合于质膜或器膜上，或存在于细胞器内。对对于于胞胞内内物物质质的的提提取取要要先先破破碎碎细细胞胞；对对于于膜膜上上物物质质则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。二、生物活性物质的存在方式19（二）（二）生物分子间的作用力生物分子间的作用力生生物物分分子子间间主主要要是是通通过过一一些些非非共共价价键键，如如氢氢键键、盐盐键键、金金属属键键、范范德德华华力力、疏疏水水键键、碱碱基基堆堆积积力力所所维维系系，其键能较弱；其键能较弱；生生物物大大分分子子的的空空间间高高级级结结构构也也是是由由非非共共价价键键结结合合的的，因此分离时应十分小心，确保立体结构不受破坏。因此分离时应十分小心，确保立体结构不受破坏。通常在十分温和条件下操作。通常在十分温和条件下操作。（二）生物分子间的作用力20三、生物活性物质的存在特点三、生物活性物质的存在特点（一）生物材料组成的复杂性（一）生物材料组成的复杂性不同生物含有不同种类的活性物质。不同生物含有不同种类的活性物质。同同种种生生物物，由由于于细细胞胞的的类类型型、年年龄龄、分分化化程程度度的的不不同同都会改变活性物质的组成。都会改变活性物质的组成。如如：胸胸腺腺激激素素只只能能从从幼幼龄龄动动物物中中提提取取；绒绒毛毛膜膜促促性性腺腺激素激素(HCG)只能从孕妇尿中提取。只能从孕妇尿中提取。三、生物活性物质的存在特点21（二）（二）生物活性物质存在的特点生物活性物质存在的特点1.生物活性物质在生物体材料中含量较低、杂质含量很高。生物活性物质在生物体材料中含量较低、杂质含量很高。例例如如：胰胰岛岛素素在在胰胰脏脏中中的的含含量量约约为为万万分分之之二二，胆胆汁汁中中的的胆红素含量为万分之五至八。胆红素含量为万分之五至八。2.生生物物材材料料中中的的生生化化组组成成数数量量大大，种种类类多多，目目的的物物与与杂杂质质的理化性质接近，分离纯化困难。的理化性质接近，分离纯化困难。（二）生物活性物质存在的特点22四四、生物材料的准备生物材料的准备（一（一)生物材料的选取生物材料的选取选择原则：有效成分含量高，原料新鲜、无污染；选择原则：有效成分含量高，原料新鲜、无污染；来源丰富、易得；原料产地较近，价格低廉；原料来源丰富、易得；原料产地较近，价格低廉；原料中杂质含量少，便于分离纯化等。中杂质含量少，便于分离纯化等。1.有效成分的含量有效成分的含量(1)生物品种：催乳素以哺乳动物为材料生物品种：催乳素以哺乳动物为材料(2)合适的组织器官合适的组织器官：免疫球蛋白以血液为原料：免疫球蛋白以血液为原料(3)生物的生长期生物的生长期2.杂质情况杂质情况3.来源来源四、生物材料的准备23（二）（二）生物材料的采集、预处理与保存生物材料的采集、预处理与保存采集：采集：必须快速、及时速冻、低温保存。必须快速、及时速冻、低温保存。预处理：预处理：1、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。离等基本操作。便于贮存和运输。2、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，以便抑制微生物和酶的作用。以便抑制微生物和酶的作用。3、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，有利于贮存。脱脂，有利于贮存。保存方法：保存方法：有速冻、冻干、或浸存于丙酮与甘油中。有速冻、冻干、或浸存于丙酮与甘油中。（二）生物材料的采集、预处理与保存24第二节细胞破碎 在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，或在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。提取或吸附。动物脏器组织：动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎；常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织：植物肉质组织：常用磨碎法；常用磨碎法；微生物：微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等处理方法。处理方法。第二节细胞破碎在提取前先将大块251.1.机械法机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机。绞肉机、击碎机、刨片机。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。2.2.物理法物理法 A A、反复冻融法、反复冻融法：把待破碎的样品冷至把待破碎的样品冷至-20-20-15-15 ，使，使 之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物 细胞及细胞内的颗粒可以破碎。细胞及细胞内的颗粒可以破碎。B B、冷热交替法：、冷热交替法：将材料投入沸水中，在将材料投入沸水中，在9090左右维持数左右维持数 分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞 被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。1.机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞26C、超声波处理法：、超声波处理法：多用于微生物材料，处理的效果与多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用时，常用50100mg/L菌体浓度，在菌体浓度，在110KC频率下频率下处理处理1015min。操作时注意避免溶液中气泡的存在。操作时注意避免溶液中气泡的存在。D、加压破碎法：、加压破碎法：加气压或水压，达加气压或水压，达0.5934.32MPa(210350kgf/cm2)的压力时，的压力时，可使可使90%以上细胞被以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。C、超声波处理法：多用于微生物材料，处理的效果与273.化学法化学法：用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂、表面活性剂处理细胞。用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂、表面活性剂处理细胞。4.生化法生化法：A.自溶法：自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4，微生物，微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。止外界细菌的污染。*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。比较少用。3.化学法：4.生化法：284.生化法生化法：A.自溶法：自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4，微生物，微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。止外界细菌的污染。*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。比较少用。4.生化法：29 B.溶菌酶处理法：溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。多用于微生物。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造酶。多用于微生物。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用时，采用pH8.0的的0.1mol/LTris-0.01mol/LEDTA制成制成2亿个亿个/mL的细胞悬液，然后加的细胞悬液，然后加入入100g1mg的溶的溶菌酶，在菌酶，在37oC保温保温10min，细菌胞壁即被破坏。，细菌胞壁即被破坏。B.溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。30一、提取方法1.用酸、碱、盐水溶液提取用用于于提提取取各各种种水水溶溶性性、盐盐溶溶性性的的生生化化物物质质，这这类类溶溶剂剂提提供供了了一定的离子强度、一定的离子强度、pH值及相当的缓冲能力。值及相当的缓冲能力。某某些些与与细细胞胞结结构构结结合合牢牢固固的的生生物物大大分分子子，在在提提取取时时采采用用高高浓浓度度盐盐溶溶液液（如如4mol/L盐盐酸酸胍胍，8mol/L脲脲或或其其他他变变性性剂剂，这这种种方法称方法称“盐解盐解”）。）。第三节第三节生物活性物质的提取生物活性物质的提取一、提取方法第三节生物活性物质的提取312.用表面活性剂提取表表面面活活性性剂剂分分子子兼兼有有亲亲水水与与疏疏水水基基团团，在在分分布布于于水水-油油界面时有分散、乳化和增溶作用。界面时有分散、乳化和增溶作用。表表面面活活性性剂剂可可分分为为阴阴离离子子型型、阳阳离离子子型型、中中性性与与非非离离子子型。型。离离子子型型表表面面活活性性剂剂作作用用强强，但但易易引引起起蛋蛋白白质质等等生生物物大大分分子的变性；子的变性；非非离离子子型型表表面面活活性性剂剂变变性性作作用用小小，适适合合于于用用水水、盐盐系系统统无法提取的蛋白质或酶的提取。无法提取的蛋白质或酶的提取。阴阴离离子子表表面面活活性性剂剂SDS可可以以破破坏坏核核酸酸与与蛋蛋白白质质的的离离子子键键合，对核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。合，对核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。2.用表面活性剂提取32表表面面活活性性剂剂的的亲亲油油、亲亲水水性性能能的的强强弱弱，通通常常以以亲亲水水亲亲油油平平衡值（衡值（H.L.B）表示：表示：H.L.B=亲水基的亲水性亲水基的亲水性/亲油基的亲油性亲油基的亲油性生物提取常用的表面活性剂，其生物提取常用的表面活性剂，其H.L.B多在多在10-20之间。之间。经经表表面面活活性性剂剂处处理理后后，它它的的存存在在对对酶酶蛋蛋白白等等的的进进一一步步纯纯化化带带来来一一定定困困难难，如如盐盐析析时时很很难难使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀，因因此此需需先先除除去去。离离子子型型表表面面活活性性剂剂可可用用离离子子交交换换层层析析法法除除去去；非非离离子子型型表表面面活活性性剂剂可可用用亲亲脂脂性性葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶层层析析法法除除去去；其其他他表面活性剂可用分子筛层析法除去。表面活性剂可用分子筛层析法除去。表面活性剂的亲油、亲水性能的强弱，通常以亲水亲油平衡值（H.333.有机溶剂提取（1）固固-液液提提取取，常常用用于于水水不不溶溶性性的的脂脂类类、脂脂蛋蛋白白、膜膜蛋蛋白白结结合合酶酶等等的的提提取取。包包括括单单一一溶溶剂剂分分离离法法、多多种种溶溶剂剂组组合合分离法。分离法。常用的有机溶剂：极性溶剂，甲醇、乙醇、丙酮、丁醇。常用的有机溶剂：极性溶剂，甲醇、乙醇、丙酮、丁醇。非极性溶剂，乙醚、氯仿、苯。非极性溶剂，乙醚、氯仿、苯。选用有机溶剂，一般采用选用有机溶剂，一般采用“相似相溶相似相溶”原则。原则。采采用用有有机机溶溶剂剂，既既能能抑抑制制微微生生物物的的生生长长和和某某些些酶酶的的作作用用，防防止止目目的的物物降降解解失失活活，也也能能阻阻止止大大量量无无关关蛋蛋白白质质的的溶溶出，有利于进一步纯化。出，有利于进一步纯化。3.有机溶剂提取34（2）液）液-液萃取液萃取概概念念：利利用用溶溶质质在在两两个个互互不不混混溶溶的的溶溶剂剂中中溶溶解解度度的的差差异异，将将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响因素：影响因素：目的物在两相的分配比（分配系数目的物在两相的分配比（分配系数K）；）；有机溶剂的用量。有机溶剂的用量。K增大，提取效率增大。增大，提取效率增大。K值较小时，可以适当增加有机溶剂的用量，采用多次值较小时，可以适当增加有机溶剂的用量，采用多次提取。提取。（2）液-液萃取35溶剂萃取的注意事项：1.pH值值，酸性物质在酸性条件下萃取；，酸性物质在酸性条件下萃取；碱性物质在碱性条件下萃取；碱性物质在碱性条件下萃取；氨基酸等两性电解质，则采用在等电点进行提取。氨基酸等两性电解质，则采用在等电点进行提取。2.盐盐析析，在在提提取取液液中中加加入入适适量量中中性性盐盐，促促使使生生化化物物质质转转入入有有机机相相，从从而而提提高高萃萃取取率率。并并且且，盐盐析析作作用用能能减减少少有有机机溶溶剂剂在在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。3.温温度度，室室温温或或低低温温下下操操作作。因因为为温温度度升升高高，既既使使生生物物材材料料不稳定，又易使有机溶剂挥发。不稳定，又易使有机溶剂挥发。4.乳化乳化，乳化层出现使有机相与水相分层困难。，乳化层出现使有机相与水相分层困难。消消除除乳乳化化的的方方法法包包括括过过滤滤、离离心心、轻轻轻轻搅搅动动、改改变变两两相相的的比比例例、加加热热、加加电电解解质质（NaCl,NaOH,HCl）、加加吸吸附附剂剂（CaCO3）。溶剂萃取的注意事项：36液液-液萃取时，溶剂的选择：液萃取时，溶剂的选择：l具有较高选择性，即具有较高选择性，即K值较大。值较大。l在萃取后，溶质与溶剂容易分离与回收。在萃取后，溶质与溶剂容易分离与回收。l两种溶剂的密度相差较大，以减少乳化作用。两种溶剂的密度相差较大，以减少乳化作用。l无毒，不易燃烧，价廉。无毒，不易燃烧，价廉。37超临界萃取超临界萃取优点：节节能能，可可使使用用生生理理惰惰性性溶溶剂剂在在低低温温下下分分离离组组分分，有有利利于生物材料活性的保持，于生物材料活性的保持，原理：在在某某一一温温度度和和压压力力时时，气气体体和和液液体体的的物物理理特特性性趋趋于于相相同同，两两相相变变为为一一相相，此此时时就就称称为为临临界界点点。物物质质的的临临界界点点常常数数包包括括：临临界界温温度度、临临界界压压力力和和临临界界密密度度。对对于于CO2而而言言，分分别别为为31.1、7.3Mpa和和0.47g/mL。当当温温度度和和压压力力高高于于上上述述值值时时，物物质质处处于于液液体体和和气气体体的的中中间间状状态态，在在这这种种状状态态下下的的流流体体称为超临界流体。超临界流体最常用的萃取剂是称为超临界流体。超临界流体最常用的萃取剂是CO2。超临界萃取38超临界流体的特性：它它们们的的物物理理特特性性和和传传质质特特性性介介于于液液体体和和气气体体之之间间，适适于于作作为为萃萃取取溶溶剂剂。超超临临界界流流体体具具有有与与液液体体同同样样的的凝凝集集力力，溶溶解解力力。超超临临界界流流体体的的密密度度比比气气体体大大得得多多，与与液液体体较较为为接接近近，因因此此超超临临界界流流体体萃萃取取具具有有很很高高的的萃萃取取速速度度。随随着着温温度度和和压压力力的的连连续续变变化化，超超临临界界流流体体对对物物质质的的萃萃取取具具有有选选择择性性。萃萃取取后后易易分分离离，其其扩扩散散系系数数接接近近于于气气体体，是是通通常常液液体体的的近近百百倍倍。超超临临界界流流体体的的粘粘度度大大大大低低于于液液体体的的粘度，有利于物质的扩散，节能效果明显。粘度，有利于物质的扩散，节能效果明显。超临界流体的萃取过程：分为萃取阶段和分离阶段。分为萃取阶段和分离阶段。超临界流体的特性：它们的物理特性和传质特性介于液体和气体之间39二、提取效率任任何何提提取取的的提提取取效效率率都都不不可可能能达达到到100%，无无论论采采用用什什么么提提取取方方法法，在在生生物物材材料料中中总总要要残残留留部部分分目目的的物物，残残留留量量的的多多少少取取决决于于所所选选择择的的溶溶剂剂系系统统的的种种类类、用用量量、提提取取次次数数及及操作条件，它们的数量关系可以操作条件，它们的数量关系可以“残留量公式残留量公式”表示如下：表示如下：式中，式中，X0为目的物总量为目的物总量,g；K为目的物在固相为目的物在固相/液相的分配系数；液相的分配系数；L为溶剂体积为溶剂体积,ml；W为生物材料重量为生物材料重量,g；n为提取次数。为提取次数。二、提取效率40由上式可见：由上式可见：1.对对于于所所选选的的溶溶剂剂系系统统而而言言，目目的的物物在在材材料料中中的的分分配配系系数数愈大，提取后的残留物质就愈多。愈大，提取后的残留物质就愈多。2.所用的溶剂愈多，残留量愈少。所用的溶剂愈多，残留量愈少。3.提取次数愈多，残留量愈少。提取次数愈多，残留量愈少。实实际际工工作作中中，溶溶剂剂的的用用量量与与提提取取次次数数有有一一定定的的限限制制，一一般生产上多用般生产上多用2-3次提取，溶剂用量为生物材料的次提取，溶剂用量为生物材料的2-5倍。倍。由上式可见：41三、影响提取效率的因素1.温温度度大大多多数数不不耐耐热热的的生生物物活活性性物物质质一一般般在在0-10进进行行提提取取。某某些些较较耐耐热热的的生生化化成成分分，如如多多糖糖类类，可于，可于5090加热提取。加热提取。2.酸酸碱碱度度多多数数生生化化物物质质在在中中性性条条件件下下较较稳稳定定，所所以以提提取取用用的的溶溶剂剂系系统统一一般般pH值值控控制制在在4-9范范围围内内，并且注意避免在目的物的等电点附近进行提取。并且注意避免在目的物的等电点附近进行提取。三、影响提取效率的因素423.盐盐浓浓度度盐盐离离子子的的存存在在能能减减弱弱生生物物分分子子间间离离子子键键及及氢氢键键的作用力，稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。的作用力，稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。盐盐溶溶：一一些些不不溶溶于于纯纯水水的的球球蛋蛋白白在在稀稀盐盐中中能能增增加加溶溶解解度度，这这是是由由于于盐盐离离子子作作用用于于生生物物大大分分子子表表面面，增增加加了了表表面面电电荷荷，使使之之极极性性增增加加，水水合合作作用用增增强强，促促使使形形成成稳稳定定的的双双电电层层，此现象称为此现象称为“盐溶盐溶”作用。作用。常用的稀盐提取液：常用的稀盐提取液：NaCl溶液溶液(0.1-0.15mol/L)；磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（0.02-0.05mol/L)；焦磷酸钠缓冲液（焦磷酸钠缓冲液（0.02-0.05mol/L)；醋酸盐缓冲液（醋酸盐缓冲液（0.10-0.15mol/L)；柠檬酸缓冲液（柠檬酸缓冲液（0.02-0.05mol/L)。3.盐浓度盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的43四、提取方法的选择关关键键：针针对对生生物物材材料料和和目目的的物物的的性性质质选选择择合合适适的的溶溶剂剂系系统统与与提取条件。提取条件。重重点点了了解解目目的的物物与与主主要要杂杂质质在在溶溶解解度度方方面面的的差差异异以以及及它它们们的的稳定性。稳定性。在在提提取取过过程程中中，尽尽量量增增加加目目的的物物的的溶溶出出度度，尽尽可可能能减减少少杂杂质质的的溶溶出出度度，同同时时重重视视生生物物材材料料及及目目的的物物在在提提取取过过程程中中的的活活性性变化。变化。四、提取方法的选择44活性物质的保护措施1.采用缓冲系统采用缓冲系统2.添加保护剂添加保护剂防止活性基团受破坏防止活性基团受破坏3.抑制水解酶的作用抑制水解酶的作用4.其其他他保保护护措措施施避避免免紫紫外外光光、强强烈烈搅搅拌拌、过过酸酸、过过碱碱或或高温高温活性物质的保护措施45第四节第四节生化物质的分离纯化方法生化物质的分离纯化方法一、一、生物制药中分离、制备方法的特点生物制药中分离、制备方法的特点1.生物材料组成复杂生物材料组成复杂无固定操作方法可循；无固定操作方法可循；2.含量极微含量极微分离操作步骤多，不易获得高收率；分离操作步骤多，不易获得高收率；3.活活性性成成分分离离开开生生物物体体后后，易易变变性性，破破坏坏分分离离进进程程必必须须十分小心；十分小心；4.分离几乎都在溶液中进行分离几乎都在溶液中进行按经验进行，严格控制；按经验进行，严格控制；5.分分离离多多采采用用温温和和的的“多多阶阶式式”方方式式进进行行，即即“逐逐级级分分离离”。操作时间长，手续繁琐。操作时间长，手续繁琐。6.生物产品最后均一性的评估，要采用多种方法。生物产品最后均一性的评估，要采用多种方法。第四节生化物质的分离纯化方法46二、二、生物制药中分离制备方法的基本原理生物制药中分离制备方法的基本原理1.根根据据分分子子形形状状和和大大小小不不同同进进行行分分离离，如如差差速速离离心心、超超离离心、膜分离、超滤、凝胶过滤；心、膜分离、超滤、凝胶过滤；2.根根据据分分子子电电离离性性质质（带带电电性性）的的差差异异，如如离离子子交交换换、电电泳、等电聚焦；泳、等电聚焦；3.根根据据分分子子极极性性大大小小及及溶溶解解度度不不同同，如如溶溶剂剂提提取取法法、逆逆流流分分配配、分分配配层层析析、盐盐析析、等等电电点点沉沉淀淀、有有机机溶溶剂剂分分级级沉沉淀淀；4.根据物质吸附性质的不同，如选择性吸附与吸附层析；根据物质吸附性质的不同，如选择性吸附与吸附层析；5.根据配体特异性，如亲和层析。根据配体特异性，如亲和层析。二、生物制药中分离制备方法的基本原理47三、三、生物制药中常用的分离纯化方法生物制药中常用的分离纯化方法1.盐析法；盐析法；2.有机溶剂沉淀法；有机溶剂沉淀法；3.等电点沉淀法；等电点沉淀法；4.膜分离法；膜分离法；5.离子交换层析；离子交换层析；6.凝胶层析；凝胶层析；7.亲和层析。亲和层析。三、生物制药中常用的分离纯化方法481 1、盐析法、盐析法 利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度随着盐浓度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度随着盐浓度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同蛋白升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐析作用。质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐析作用。优点优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。缺点缺点：分级分离能力不高。分级分离能力不高。常用的中性盐常用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠。1、盐析法49盐析时应注意的几个问题：盐析时应注意的几个问题：（1 1）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。（2 2）pH pH 值的选择：蛋白质在值的选择：蛋白质在pIpI时的溶解度最小。因此，时的溶解度最小。因此，进行盐析时的进行盐析时的pHpH，要选择在被分离蛋白质的，要选择在被分离蛋白质的pIpI附近。附近。（3 3）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其他沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其他蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选择适当的蛋白质蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选择适当的蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。浓度，可避免共沉的干扰。盐析时应注意的几个问题：50（4 4）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。常在常在0-4 0-4 范围内迅速操作。范围内迅速操作。如尿激酶。如尿激酶。（5 5）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析，时间一般较才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析，时间一般较长，应常换透析液，注意防止污染。长，应常换透析液，注意防止污染。（4）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对51 2 2、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质的沉淀与溶解，差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，使其与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，使其溶解度变小，同时，还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白溶解度变小，同时，还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。质沉淀析出。52几种溶剂的介电常数几种溶剂的介电常数溶剂名称溶剂名称 20 时的介电常数时的介电常数 溶剂名称溶剂名称 20 时的介电常数时的介电常数 乙醚乙醚 4.33 甲醇甲醇 33 丙酮丙酮 21.4 水水 80 乙醇乙醇 24 2.5 mol/L甘氨酸水溶液甘氨酸水溶液 137介电常数与静电力的关系：介电常数与静电力的关系：F=Q1Q2/Kr2 式中：式中：K介电常数。指带相反电荷的微粒之间的静电引力。介电常数。指带相反电荷的微粒之间的静电引力。F相距为相距为r的的2个带电量分别为个带电量分别为Q1、Q2点电荷相互作用的静电引力。点电荷相互作用的静电引力。经验经验：如如30-40%乙醇沉淀的物质，改用丙酮时，其体积分数可减少乙醇沉淀的物质，改用丙酮时，其体积分数可减少10%左右。左右。即可用即可用 2030%的丙酮；的丙酮；而而70-80%乙醇沉淀的物质，可用乙醇沉淀的物质，可用5060%的丙酮的丙酮即可。即可。注：水有较高的介电常数，具有很好的溶剂性能，是一种广谱溶剂。有机溶剂注：水有较高的介电常数，具有很好的溶剂性能，是一种广谱溶剂。有机溶剂法比盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，易干燥，但对有些生物活性物质能引起法比盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，易干燥，但对有些生物活性物质能引起失活和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。失活和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。几种溶剂的介电常数53有机沉淀法应注意的问题有机沉淀法应注意的问题：（1 1）控制工艺过程的温度：整个操作过程应在低温下进）控制工艺过程的温度：整个操作过程应在低温下进行，而且最好是同一温度。行，而且最好是同一温度。（2 2）防止溶剂局部浓度过高：加入有机溶剂时搅拌要均）防止溶剂局部浓度过高：加入有机溶剂时搅拌要均匀，速度要适当，避免局部浓度过高，引起沉淀物的破坏、匀，速度要适当，避免局部浓度过高，引起沉淀物的破坏、变性或失活。变性或失活。（3 3）及时处理沉淀物：沉淀物经过滤或离心后，要立即）及时处理沉淀物：沉淀物经过滤或离心后，要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。（4）pHpH的选择：在待沉淀蛋白质的的选择：在待沉淀蛋白质的pIpI附近。附近。（5 5）有机溶剂是酶和蛋白质的变性因素，尤其是对敏感）有机溶剂是酶和蛋白质的变性因素，尤其是对敏感酶类。酶类。有机沉淀法应注意的问题：543 3、等电点沉淀法、等电点沉淀法 利用蛋白质在等电点时的溶解度最低，而各种蛋白质又利用蛋白质在等电点时的溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点的特性进行分离的工艺过程。具有不同的等电点的特性进行分离的工艺过程。由于各种蛋白质在等电点时，仍有一定的溶解度而沉淀由于各种蛋白质在等电点时，仍有一定的溶解度而沉淀不完全，多数蛋白质的等电点又都十分接近，所以单独使用不完全，多数蛋白质的等电点又都十分接近，所以单独使用效果不理想，分辨力差，多用于提取后除杂蛋白。实际生产效果不理想，分辨力差，多用于提取后除杂蛋白。实际生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。3、等电点沉淀法554 4、膜分离法、膜分离法 膜分离技术包括膜分离技术包括超滤超滤、反渗透析反渗透析、电渗析、电渗析、微孔过滤微孔过滤、气体渗析和气体渗析和超精密过滤超精密过滤。（1 1）超滤：）超滤：根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分。在液压的驱动下，能通过超滤膜的分离粒子的进行筛分。在液压的驱动下，能通过超滤膜的分离粒子的范围，一般在范围，一般在0.0010.01m0.0010.01m。即利用一种特制的膜对溶。即利用一种特制的膜对溶液中的各种溶质分子进行选择性过滤。液中的各种溶质分子进行选择性过滤。优点优点：成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持药物：成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持药物活性、回收率高。适用于酶和蛋白质药物的分离、浓缩、活性、回收率高。适用于酶和蛋白质药物的分离、浓缩、脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原。脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原。4、膜分离法56（2 2）反渗透：）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压力的情况下，使溶液中的溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶透压力的情况下，使溶液中的溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻截在膜前。这一过程类似于渗透物阻截在膜前。这一过程类似于渗透,但方向相反，即溶剂从高但方向相反，即溶剂从高浓度一侧传递到浓度低的一侧，故称反渗透。浓度一侧传递到浓度低的一侧，故称反渗透。特点：能耗少，体积小，适应大规模生产。特点：能耗少，体积小，适应大规模生产。（3 3）微孔滤膜：）微孔滤膜：由高分子材料制成的薄膜过滤介质，可以过滤由高分子材料制成的薄膜过滤介质，可以过滤一般介质不能截留的细菌和微粒。膜的孔径在一般介质不能截留的细菌和微粒。膜的孔径在0.2-10 m0.2-10 m。（4 4）超精密过滤：）超精密过滤：以聚乙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性以聚乙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜与微孔滤膜之间。为能在超滤膜与微孔滤膜之间。为0.010.010.2 m0.2 m。用于水的精制、。用于水的精制、循环水的净化、除悬浮固体粒子以及糖液、酶液的精制。循环水的净化、除悬浮固体粒子以及糖液、酶液的精制。（2）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压575 5、离子交换层析、离子交换层析 采用不溶性高分子化合物作为离子交换剂，分离纯化各采用不溶性高分子化合物作为离子交换剂，分离纯化各种生化物质。种生化物质。基本原理：基本原理：离子交换树脂在水中能溶胀，溶胀后，其分子中离子交换树脂在水中能溶胀，溶胀后，其分子中的极性基团（活性基团），具有可扩散的离子，能与溶液中的极性基团（活性基团），具有可扩散的离子，能与溶液中的离子起交换作用；非极性基团作为树脂的骨架，使树脂不的离子起交换作用；非极性基团作为树脂的骨架，使树脂不溶于水并具有网状结构，为离子交换的进行及溶液和树脂的溶于水并具有网状结构，为离子交换的进行及溶液和树脂的分离创造了条件。离子交换层析包括吸附、吸收、穿透、扩分离创造了条件。离子交换层析包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和力等物理化学过程。散、离子交换、离子亲和力等物理化学过程。5、离子交换层析58树脂种类和理化性能：树脂种类和理化性能：（1 1）强酸性阳离子交换树脂：功能团为磺酸基，）强酸性阳离子交换树脂：功能团为磺酸基，pHpH一般一般没有限制。没有限制。（2 2）弱酸性阳离子交换树脂：功能团为羧基、酚基。在）弱酸性阳离子交换树脂：功能团为羧基、酚基。在酸性溶液中不发生交换，酸性溶液中不发生交换，pHpH愈大交换能力愈强。愈大交换能力愈强。（3 3）强碱性阴离子交换树脂：功能团为三甲基季胺基团。）强碱性阴离子交换树脂：功能团为三甲基季胺基团。pHpH没有限制。没有限制。（4 4）弱碱性阴离子交换树脂：功能团为伯胺基、仲胺基、）弱碱性阴离子交换树脂：功能团为伯胺基、仲胺基、叔胺基。叔胺基。pHpH愈低交换能力愈大。愈低交换能力愈大。树脂种类和理化性能：59影响交换速度的因素：影响交换速度的因素：（1 1）树脂颗粒的大小：颗粒小，表面积大，能促进内部）树脂颗粒的大小：颗粒小，表面积大，能促进内部和外部扩散。和外部扩散。（2 2）搅拌和流速：加快搅拌速度或加大液体流速，都能）搅拌和流速：加快搅拌速度或加大液体流速，都能减少树脂外液膜的厚度，从而使液相扩散速度增加。减少树脂外液膜的厚度，从而使液相扩散速度增加。（3 3）离子浓度：交换速度随离子浓度的上升而增加，达）离子浓度：交换速度随离子浓度的上升而增加，达到一定浓度后交换速度不再升高。到一定浓度后交换速度不再升高。（4）离子的水化半径：水化半径小的易被吸附。）离子的水化半径：水化半径小的易被吸附。（5 5）树脂酸碱性的强弱和溶液的）树脂酸碱性的强弱和溶液的pHpH：（6）交联度大小：交联度愈小，树脂愈易膨胀，交换速）交联度大小：交联度愈小，树脂愈易膨胀，交换速度愈快。但交联度小的树脂选择性较差。度愈快。但交联度小的树脂选择性较差。（7）有机溶剂的影响：当有有机溶剂存在时，会降低树）有机溶剂的影响：当有有机溶剂存在时，会降低树脂对有机离子的选择性，而容易吸附无机离子。脂对有机离子的选择性，而容易吸附无机离子。影响交换速度的因素：606 6、凝胶层析、凝胶层析 指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时，因指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时，因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。优点优点：设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分离条件缓和，不使活性物质失活变性，凝胶可重复使用，无离条件缓和，不使活性物质失活变性，凝胶可重复使用，无需再生处理。需再生处理。缺点缺点：分离速度慢。分离速度慢。广泛用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等药物。广泛用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等药物。6、凝胶层析61几种常用的凝胶：几种常用的凝胶：（1）葡聚糖凝胶：基本骨架是）葡聚糖凝胶：基本骨架是1-6糖苷键。由葡聚糖和甘油糖苷键。由葡聚糖和甘油以醚桥形式交联而成的网状结构。最著名的商品为以醚桥形式交联而成的网状结构。最著名的商品为Sephadex葡聚糖凝胶，珠状颗粒物，化学性质稳定，不溶于水、弱酸、葡聚糖凝胶，珠状颗粒物，化学性质稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液。低温时，在碱和盐溶液。低温时，在0.1mol/L盐酸中保持盐酸中保持1-2h不改变性不改变性质；室温时，在质；室温时，在0.01mol/L盐酸中放置半年也不改变；在盐酸中放置半年也不改变；在0.25mol/L的氢氧化钠中，的氢氧化