蛋白质组与临床蛋白质组学ppt课件

蛋白质组学Proteomics硕士生学位课程：蛋白质组与临床蛋白质组学1蛋白质组学Proteomics硕士生学位课程：蛋白质组与临n总学时数：36n教学目的和要求n1.掌握蛋白质组与蛋白质组学的基本概念，基本理论与基本方法。n2.熟悉蛋白质组研究的关键技术。n3.熟悉利用蛋白质组研究策略设计研究课题的基本思路。n4.培养开展临床蛋白质组学与疾病蛋白质组学研究的基础能力。蛋白质组与临床蛋白质组学2总学时数：36蛋白质组与临床蛋白质组学2按照课程的总体要求，将课程分为12个专题进行讲授：n1、蛋白质组与蛋白质组学n2、蛋白质组学研究中的样品制备与分离技术n3、生物质谱n4、蛋白质研究的其它方法（1）n5、蛋白质研究的其它方法（2）n6、临床蛋白质组学与疾病蛋白组学n7、药物蛋白质组学及其临床应用n8、血浆/血清蛋白质组学和体液蛋白质组学n9、亚细胞蛋白质组学及研究进展n10、心血管系统与消化系统疾病蛋白质组学n11、神经系统蛋白质组学n12、临床肿瘤蛋白质组学蛋白质组与临床蛋白质组学3按照课程的总体要求，将课程分为12个专题进行讲授：1、蛋白授课教师n第1讲:邱宗荫教授n第2讲:颜玉蓉副教授n第3讲:母昭德副教授n第4讲:周兰教授n第5讲:张雪梅教授n第6讲:冯涛教授n第7讲:张雪梅教授n第8讲:何於娟副教授n第9讲:颜玉蓉副教授n第10讲:冯涛教授n第11讲:周兰教授n第12讲:周兰教授蛋白质组与临床蛋白质组学4授课教师第1讲:邱宗荫教授第7讲:张雪梅教授蛋白质组参考教材与文献 n主要参考教材：n邱宗荫，尹一兵等编著，临床蛋白质组学临床蛋白质组学。科学出版社，2008.4。n其它参考教材：n1、R.J.Simpson.ProteinsandProteomics:A Laboratory Manual.（影印版）。科学出版社，2003。n2、R.J.Simpson.Purifying Proteins for Proteomics.（影印版）。科学出版社，2004。n3、夏其昌曾嵘等编著。蛋白质化学与蛋白质组学蛋白质化学与蛋白质组学。科学出版社，2004。n4、陈主初肖志强主编。疾病蛋白质组学疾病蛋白质组学。化学工业出版社，2006。蛋白质组与临床蛋白质组学5参考教材与文献主要参考教材：2、R.J.Simpson.主要参考杂志 n1、Proteomics(WILEY-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA,Weinheim)n2、Proteomics-Clinical Applications(WILEY-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA,Weinheim)n3、Electrophoresis(WILEY-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA,Weinheim)n4、Molecular&Cellular Proteomics（MCP）AmericanSocietyforBiochemistryandMolecularBiology(ASBMB)n5、Journal of Proteome Research(AmericanChemicalSociety)蛋白质组与临床蛋白质组学6主要参考杂志1、Proteomics(WILEY-VCH相关杂志nProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUnitedStateofAmerica(美国国家科学院院刊),简称PNAS.nJournaloftheNationalCancerInstitute(Journal of NCI)OxfordUniversityPress(OUP)andNationalCancerInstitute(美国国家癌症研究所,NCI)nJournalofBiologicalChemistry(JBC)(AmericanSocietyofBiochemistryandMolecularBiology,Inc.)蛋白质组与临床蛋白质组学7相关杂志ProceedingsoftheNationa授人以鱼，不如授人以渔。授人以鱼，三餐之需；授人以渔，终生之用。我们应该从这门课程中学习当今生命科学前沿领域的研究思想，观点和方法。蛋白质组与临床蛋白质组学8授人以鱼，不如授人以渔。授人以鱼，三餐之需；授人以渔，终生第1讲:蛋白质组与蛋白质组学Proteome and Proteomics重庆医科大学药学院邱宗荫蛋白质组与临床蛋白质组学9第1讲:蛋白质组与蛋白质组学ProteomeandP本次讲授的内容n、从基因组到蛋白质组n、蛋白质组与蛋白质组学的内涵n、关于蛋白质n、蛋白质组与基因组的差别n、蛋白质组学的研究策略蛋白质组与临床蛋白质组学10本次讲授的内容、从基因组到蛋白质组蛋白质组与临床蛋白质组学、从基因组到蛋白质组蛋白质组与临床蛋白质组学11、从基因组到蛋白质组蛋白质组与临床蛋白质组学11对人类文明产生重大影响的科学技术工程n曼哈顿计划n阿波罗计划n人类基因组计划蛋白质组与临床蛋白质组学12对人类文明产生重大影响的科学技术工程曼哈顿计划蛋白质组与临人类基因组计划在科学上的目的，是测定组成人类基因组的30亿个核苷酸的序列。从而奠定阐明人类所有基因的结构与功能，解读人类的遗传信息。蛋白质组与临床蛋白质组学6/30/202413人类基因组计划在科学上的目的，是测定组成人类基因组的30亿个TheHumanGenomenTheInternationalHumanGenomeConsortiumnInitial sequencing and analysis of the human genomenNature,409,February 15,860-921(2001)nVenteretal.(Celera)nThe Sequence of the Human GenomenScience,291,February 16,1304-1351(2001)蛋白质组与临床蛋白质组学14TheHumanGenomeTheInternatioGenespredictedinHumanGenomeIntlConsortiumCeleraknowngenes14,88217,764novelgenes16,89621,350Total31,77839,114蛋白质组与临床蛋白质组学15GenespredictedinHumanGeno人类基因数缩水再缩水n由于测序技术方法的不断发展，对基因组分析的误差也在逐渐缩小。人类基因组数量也从34万，缩水到了25000左右。n2007年，根据Broad研究所一一项发表在PNAS上的研究表明，人类基因目录如Ensembl、RefSeq和Vega包括了许多开放阅读框，它们是任意出现的而不是蛋白质编码区域。这些发现将人类基因组中的蛋白质编码基因数目减少到了20500个。n随着研究的进一步深入，这个数目还可能会有变化。而人类基因组中蛋白质编码基因数量之少，也是令人惊讶的。蛋白质组与临床蛋白质组学16人类基因数缩水再缩水由于测序技术方法的不断发展，对基因组分析人们认识生命过程分子机制的60年历程n1944Averyet.al.provideevidencethatDNAisthehereditarymaterialn1953Watson&CrickpublishthedoublehelicalstructureofDNAn1963Nirenbergelucidatesthegeneticcoden1964Perutzconnectsthe3-Dstructureofproteinstotheaminoacidsequencen1972-74DevelopmentofrecombinantDNAtechnologyn1975-85DevelopmentoftechniquesforrapidDNAsequencing蛋白质组与临床蛋白质组学17人们认识生命过程分子机制的60年历程1944Averypost-genome eran1990InitiationoftheHumanGenomeProjectn1995Firstcompletegenomepublished(流感嗜血杆菌基因组序列首次被破译，在此后不到两年的时间，近50个细菌的基因组序列已被完成)n1996AffymetrixpublishesaboutGeneChipn2001HumanGenomeProjectcompleted蛋白质组与临床蛋白质组学18post-genomeera1990InitiatioIn The News:“If 2000 was the year of the Genome,2001 will be the year of the Proteome”Nightly Business Report 12/27/00Time Magazine 7/3/00The Economist 12/9/00chemistry&engineering news 7/31/00Scientific American 7/00蛋白质组与临床蛋白质组学19InTheNews:“If2000wasthey1994年，澳大利亚科学家MarcWilkins提出蛋白质组概念。nThetermwascoinedbyMarcWilkinsin1994inthesymposium:2D Electrophoresis:from protein maps to genomesinSiena,Italy,andwassubsequentlypublishedin1995,whichwaspartofhisPhDthesis.Wilkinsusedittodescribetheentirecomplementofproteinsexpressedbyagenome,cell,tissueororganism.nWasingerVC,CordwellSJ,Cerpa-PoljakA,YanJX,GooleyAA,WilkinsMR,DuncanMW,HarrisR,WilliamsKL,Humphery-SmithI.(1995).Progress with gene-product mapping of the Mollicutes:Mycoplasma genitalium.Electrophoresis7(7):109094.蛋白质组与临床蛋白质组学201994年，澳大利亚科学家MarcWilkins提出蛋白质n2001年2月15日，英国自然周刊在发布人类基因组框架图时，同期登载了一条关于人类蛋白质组研究组织（Human Proteome Organization,HUPO）成立的消息，标题就叫“现在是蛋白质组了”。n人类蛋白质组组织（HUPO）是一个国际事务、学术和政府成员的联盟。HUPO成立后，欧洲、亚太地区相继成立了区域性蛋白质组研究组织。蛋白质组与临床蛋白质组学212001年2月15日，英国自然周刊在发布人类基因组框架图Nature,March 13,2003蛋白质组与临床蛋白质组学22Nature,MarchHUPO的工作重点为人类疾病与健康协调公共蛋白质组组织的活动鼓励有关人类蛋白质组和生物模型蛋白质组知识的广泛传播将各国和各地区的蛋白质组研究组织统一在一个国际性的组织之中蛋白质组与临床蛋白质组学23HUPO的工作重点为人类疾病与健康协调公共鼓励有关人类蛋白质 DNA Complete description of genes in an organism RNA Complete description of mRNA in a genome ProteinComplete description of proteinsexpressed by a genome Metabolites Complete description of metabolites expressed by a genomeCatalog of all protein-DNA,protein-RNA,and protein-protein interactionsGenome Genomics Transcriptome TranscriptomicsProteome Proteomics Metabolome MetabolomicsInteractome System BiologyGlobalTargetedGlobalTargeted Global TargetedFunctional genomics or “phenomics”蛋白质组与临床蛋白质组学24DNARNA蛋白质组与临床蛋白质组学25蛋白质组与临床蛋白质组学25、蛋白质组与蛋白质组学的内涵蛋白质组与临床蛋白质组学26、蛋白质组与蛋白质组学的内涵蛋白质组与临床蛋白质组学26蛋白质组n蛋白质组的英文是PROTEOME，它来源于PROTEins和genOME两个词的组合，意思是Proteins expressed by a genome，即由基因组表达的蛋白质。n随后，学者们对蛋白质组学的含义作了进一步的阐述，认为“proteome”代表一个完整生物或生物体不同细胞组合中的全部蛋白质。n因此，目前认为蛋白质组的内涵是一个细胞、一类组织或一种生物的基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组与临床蛋白质组学27蛋白质组蛋白质组的英文是PROTEOME，它来源于PROTE蛋白质组学n蛋白质组学（Proteomics）旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的存在方式（修饰形式），研究其结构、功能、定量和相互作用等。蛋白质组与临床蛋白质组学28蛋白质组学蛋白质组学（Proteomics）旨在阐明生物体ProteomicsnProteomicscanbedefinedasthequalitativeandquantitativecomparisonofproteomesunderdifferentconditionstofurtherunravelbiologicalprocesses.n“Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.”(StanleyFields.ProteomicsinGenomeland.Science16February2001291:1221-1224)蛋白质组与临床蛋白质组学29ProteomicsProteomicscanbede从认识生命的科学理论体系看，蛋白质组学属于系统生物学的范畴。n在过去的半个多世纪里，生物学和医学的研究主要是基于分析方法或还原方法（reductionapproach）来探求生命现象的本质。其基本的研究思路是建立在将生物系统分解，或还原成各个组成部分的基础上。人们按照这种还原主义的研究策略已经获得了大量和重要的关于生物学“部件”的认识，特别是对于单个基因和蛋白质的结构和功能有了越来越深入的了解。n但是，还原主义研究策略的固有缺陷是难以从整体上了解生命系统的协同行为，更谈不上去了解生命系统协同行为的变化如何导致人类疾病的发生、发展，以及生命现象纷繁复杂的变化。蛋白质组与临床蛋白质组学30从认识生命的科学理论体系看，蛋白质组学属于系统生物学的范畴 系统生物学(System/SystemsBiology)n系统生物学将生命过程作为一种大系统，而不是作为孤立的很多部分来进行定性和定量研究。它借助和发展多学科交叉的新的技术策略和方法，研究生命系统中所有组成成分的系统行为、相互联系以及动力学特性，进而揭示生命系统的基本规律与调控手段。n以生物系统内的所有组成部分及其相互关系为对象，通过大规模动力学分析，用数学方法抽象出生物系统的设计原理和运行规律。蛋白质组与临床蛋白质组学31系统生物学(System/Systems将当前生物科学知识全面系统地联系在一起组建超级数据库网络-对盲人摸象认识论的革命n盲人摸象这个谚语是对“只见树木、不见森林”认识论的讽刺。遗憾的是，我们都曾经受到过这种认识论的影响。n随着对大象表观基因组、基因组、转录组，蛋白质组以及糖组越来越精确的分析，人们越来越多地了解到事物的整体属性及其本质。n但即便如此，我们仍需要知道各部分是怎样协调运作从而组成一个完整的大象的。整体由部分构成图片来源：Wildlife Stock Pictures蛋白质组与临床蛋白质组学32将当前生物科学知识全面系统地联系在一起组建超级数据库网络-MiningproteomesToidentifyasmanycomponentsoftheproteomeaspossibleMappingofproteomesofvariousorganismsandtissuesComparisonofproteinexpressionlevelsforthedetectionofdiseasebiomarkersDepartment of Genomics&ProteomicsDepartment of Genetics&BiochemistryStanleyFields.ProteomicsinGenomeland.Science 16February2001291:1221-1224蛋白质组与临床蛋白质组学33MiningproteomesToidentifyas、关于蛋白质Proteinsarepolyamides,theirmonomericunitsarecomprisedof20different-aminoacids蛋白质组与临床蛋白质组学34、关于蛋白质ProteinsarepolyamidesProteinsnmainbuildingblocksandfunctionalmoleculesofthecelln20%ofcellweight(water:70%)nfourlevelsofstructuren310nm蛋白质组与临床蛋白质组学35ProteinsmainbuildingblocksaFunctionofProteinsnEnzymatic proteins(catalystsforsuchfunctionsasdigestion)nStructural proteinse.g.collagenandelastin(connectivetissue)nContractile proteinse.g.myosin(musclemovement)nTransport proteinse.g.hemoglobinmolecules(oxygentransport)nStorage proteinse.g.casein(majorsourceofaaforbabymammals)nHormonal proteinse.g.insulin(regulatessugarconc.intheblood)nReceptor proteins(buildintothemembraneofnervecells)nDefensive proteins(antibodiestoprotectagainstdiseases)蛋白质组与临床蛋白质组学36FunctionofProteinsEnzymaticnRiscommonlyoneof20differentsidechainsnAtpH7boththeaminoandcarboxylgroupsareionizedaminogroupalphacarboncarboxylgroupside chaingroupAminoAcid氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位蛋白质组与临床蛋白质组学37Riscommonlyoneof20differFamiliesofAminoAcidsnThecommonaminoacidsaregroupedaccordingtowhethertheirsidechainsare:nacidic D,EnbasicK,R,Hnuncharged polarN,Q,S,T,YnnonpolarG,A,V,L,I,P,F,M,W,CnHydrophilicaminoacids(unchargedpolar)areusuallyontheoutsideofaproteinwhereasnonpolarresiduesclusterontheinsideofproteinnBasicoracidicaminoacidsareverypolarandaregenerallyfoundontheoutsideofproteinmolecules蛋白质组与临床蛋白质组学38FamiliesofAminoAcidsThecomPeptideBondsnAminoacidsarejoinedtogetherbyanamidelinkagecalledapeptidebond.nThetwobondsoneithersideoftherigidplanarpeptideunitexhibitahighdegreerotationpeptidebondsrotation occurs here蛋白质组与临床蛋白质组学39PeptideBondsAminoacidsarejProteinsaremoleculesthatcontainoneormorepolypeptidechainsnPolymerscontaining:n2aminoacidresiduesarecalleddipeptidesn3-/-tripeptidesn3-10-/-oligopeptidesnMany-/-polypeptides蛋白质组与临床蛋白质组学40Proteinsaremoleculesthatco蛋白质的分子结构有四个层次1234序列构型活性调节Mathewsetal(2000)Biochemistry(3e)p.195蛋白质组与临床蛋白质组学41蛋白质的分子结构有四个层次1234序列MathewsetAlpha-helixBeta-sheetPrimary structureSecondary structureTertiary structureQuaternary structure蛋白质组与临床蛋白质组学42Alpha-helixBeta-sheetPrimarys3D Structure of ProteinAlpha-helixBeta-sheetLoop and TurnTurn or coil蛋白质组与临床蛋白质组学433DStructureofProteinAlpha-hHemeGroupsinHemoglobin蛋白质组与临床蛋白质组学44HemeGroupsinHemoglobin蛋白质组与PositivelyChargedcanyon蛋白质组与临床蛋白质组学45Positively蛋白质组与临床蛋白质组学45蛋白质的物理化学特性(一)n1.蛋白质的大小与形状蛋白质分子量变化范围很广，从几千到几十万，大多数蛋白质的平均分子量约为4万5万，更大的蛋白质通常由多个亚基组成。n2.蛋白质的构象不需要共价键的变化，就能使立体结构改变的立体结构现象称为构象（conformation）。蛋白质的构象取决于其一二三四级结构。某些蛋白质的构象还受结合辅基的影响。蛋白质组与临床蛋白质组学46蛋白质的物理化学特性(一)蛋白质的物理化学特性(二)n3.蛋白质的电荷n通常每个蛋白质含有一个氨基末端和一个羧基末端，往往还有带电荷的氨基酸侧链。因此，蛋白质在溶液中呈现酸-碱效应。n当pH为某一数值时，蛋白质所带正电荷和负电荷数相等，分子净电荷为零，此pH即为蛋白质的等电点（pI）。n当pHpI时，蛋白质分子带负电荷；当pH200knowntypesnPresentonatleast80%ofeukaryoticproteinsnFoundinallspeciesnLocatedatspecificsequencemotifs(sequons)nOftentransientnUsuallypresentatsubstoichiometriclevelsnOftenacttogether蛋白质组与临床蛋白质组学68GeneralCharacteristicsAre2Thisschematicfigureshowsthelocationandroleofaselectionofsomeofthemostimportantofmorethan200typesofpost-translationalmodification(PTM).Phosphorylation cascades are involved in many signalling pathwaysPlasma membraneproteins can carryN-glycansThe histone codecontrols many nuclear processesNuclear and cytoplasmicproteins can carry O-glycansVarious modification regulate microtubule functionPlasma-membrane proteinscan be linked to the membrane by a GPI anchorPolyubiquitylationcan induce proteindegradationAc,acetyl group;GPI,glycosylphosphatidylinositol;Me,methyl group;P,phosphoryl group;Ub,ubiquitin.蛋白质组与临床蛋白质组学69Thisschematicfigureshowsth蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共价结合的过程。蛋白质组与临床蛋白质组学70蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共Glycosylation：Carbohydrates added to basic protein structureFolded protein structure(schematic)葡萄糖（Glc）甘露糖（Man）半乳糖（Gal）N-乙酰葡糖胺（GlcNAC）唾液酸，泛指的（Sia）蛋白质组与临床蛋白质组学71Glycosylation：Carbohydratesad泛素与泛素化n以色列科学家阿龙切哈诺沃(AaronCiechanover,1947-)、阿夫拉姆赫什科（AvramHershko,1937-）和美国科学家欧文罗斯（IrwinRose,1926-）因在“泛素调节的蛋白质降解”方面的出色研究而获得2004年诺贝尔化学奖。n这三位科学家发现，一种被称为泛素的多肽在需要能量的蛋白质降解过程中扮演着重要角色。这种多肽由76个氨基酸组成，它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。它就像标签一样，被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的“垃圾处理厂”，在那里被降解。蛋白质组与临床蛋白质组学72泛素与泛素化以色列科学家阿龙切哈诺沃(AaronCiec泛素与泛素化n泛素泛素:泛素（Ubiquitin）是由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链,因其广泛分布于各类细胞而得名。n泛素化泛素化:泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解，泛素的这种标记作用是非底物特异性的。泛素化是细胞维持对那些受组成型调节和环境刺激产生的蛋白质水平的基本调节方式。n泛素泛素-蛋白酶体途径蛋白酶体途径:是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与调节细胞周期进程，细胞增生与分化，以及信号传导等多种细胞生理过程，因此细胞内蛋白质泛素化降解是蛋白质重要的转录后修饰方式之一。蛋白质组与临床蛋白质组学73泛素与泛素化泛素:泛素（Ubiquitin）是由76个氨基Ubiquitin:Proteinsareusuallytaggedforselectivedestructioninproteolyticcomplexescalledproteasomesbycovalentattachmentofubiquitin,asmall,compact,highlyconservedprotein.Anisopeptidebondlinkstheterminal carboxylofubiquitintothe-aminogroupofalysine residueofacondemnedprotein.蛋白质组与临床蛋白质组学74Ubiquitin:AnisopeptidebondlUbiquitin Isopeptide BondTargetproteinTarget lysinee e-amino groupUbcarboxyterminus蛋白质组与临床蛋白质组学75UbiquitinIsopeptideBondTargeUbiquitination蛋白质组与临床蛋白质组学76Ubiquitination蛋白质组与临床蛋白质组学76n大量研究证实，这种泛素调节的蛋白质降解过程在生物体中的作用非常重要。通常有30新合成的蛋白质通过泛素化被销毁。因此，可以认为，泛素化是一个把关的过程，如果它把关不严，就会使一些不合格的蛋白质蒙混过关；如果把关过严，又会使合格的蛋白质供不应求。这都容易使生物体出现一系列问题。比如，P53蛋白质可以抑制细胞发生癌变，但如果对P53蛋白质的生产把关不严，就会导致人体抑制细胞癌变的能力下降，诱发癌症。n泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。这些研究对进一步揭示生物的奥秘，以及探索一些疾病的发生机理和治疗手段具有重要意义。泛素化过程(死亡之吻)蛋白质组与临床蛋白质组学77大量研究证实，这种泛素调节的蛋白质降解过程在生物体中的作用非Phosphorylationn磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的,至少有30%的蛋白被磷酸化修饰。n磷酸化的作用位点为蛋白上的Ser,Thr,Tyr残基。在磷酸化调节过程中酶，细胞的形态和功能都发生改变。n可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等。蛋白质组与临床蛋白质组学78Phosphorylation磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将Acetylation乙酰化也是细胞内蛋白质翻译后修饰的一种重要形式。组蛋白等许多蛋白都可以发生乙酰化。蛋白质组与临床蛋白质组学79Acetylation乙酰化也是细胞内蛋白质翻译后修饰的一种Palmitoylation棕榈酰化,十六(烷)酰化)蛋白质棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质共价修饰的一种重要形式,对象主要是胞质蛋白质。对蛋白质功能产生多重影响。蛋白质组与临床蛋白质组学80Palmitoylation棕榈酰化,十六(烷)酰化)蛋白磷酸化棕榈酰化糖基化损伤损伤泛素化泛素化Approximately 200 different types of posttranslational modifications have been reported.Thelifecycleofaprotein蛋白质组与临床蛋白质组学81磷酸化棕榈酰化糖基化损伤损伤泛素化泛素化ApproximatFactoren die bijdragen aan de complexiteit van het proteoomaantalgenen6,20019,00032,000Alternatieve splicing-/+aantal verschillendedomeinen3001,0001,800multi-domeineiwitten+Post-translational Modifications+Fosforylering,Glycosylering,Acetylering,Carboxylering,Sulfatering,Proteolytische,Klieving,Myristoylering,ADP-ribosylering,UbiquitineringProteome complexity蛋白质组与临床蛋白质组学82Factorendiebijdragenaande30 000多个基因多个基因120 000种可能的种可能的mRNA24 000 000种可能的蛋白质同型异构体种可能的蛋白质同型异构体(protein isoforms)预计有预计有2 000 000种行使功能的蛋白质种行使功能的蛋白质46种可变剪切形式种可变剪切形式200种的翻译后修饰种的翻译后修饰(PTM)方式方式预计的基因组与蛋白质组的数量关系 蛋白质组与临床蛋白质组学8330000多个基因120000种可能的mRNA2400蛋白质组与基因组的重要差别之二：时空性n在测定基因组的DNA序列时不需要考虑时空的影响。在蛋白质组的研究中，时间和空间的影响都是不可忽略的。n1.在个体发育的不同阶段或细胞的不同活动时期，细胞内产生的蛋白质种类是不一样的。n2.不同蛋白质的寿命也不一样。有些蛋白质在合成后成为细胞的结构成分，相当稳定；而有些蛋白质在产生后被用来进行某种细胞活动，比如基因转录的调控，工作一旦完成就被迅速降解。蛋白质组与临床蛋白质组学84蛋白质组与基因组的重要差别之二：时空性在测定基因组的DNAn3.不同的蛋白质通常分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关。要想真正了解蛋白质的功能，通常还需要知道蛋白质所处的空间位置。n4.更为重要的是，许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，它们在细胞里常常通过在不同亚细胞环境里的运动发挥作用。例如细胞周期的调控过程、细胞的信号转导和转录调控，都依赖于蛋白质空间位置的变化和运动。n因此，在进行蛋白质组分析时，需要把时间和空间作在进行蛋白质组分析时，需要把时间和空间作为重要的参数。为重要的参数。蛋白质组与临床蛋白质组学853.不同的蛋白质通常分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空蛋白质组与临床蛋白质组学86蛋白质组与临床蛋白质组学86n蛋白质间主要以相互作用的形式参与生命活动。也许可以说，不与其不与其他蛋白质发生作用的他蛋白质发生作用的“孤立蛋白质孤立蛋白质”根本就不存在根本就不存在。n蛋白质之间的相互作用大致有三类n一、与生命活动相关的蛋白质相互作用网络；n二、结构型或功能型蛋白质复合体的形成，包括：多亚基蛋白质、多成分的蛋白质复合物等；n三、控制着重要细胞内活动的、瞬时的蛋白质相互作用。蛋白质组与基因组的重要差别之三：相互作用蛋白质组与临床蛋白质组学87蛋白质间主要以相互作用的形式参与生命活动。也许可以说，不与其Anne-Claude Gavin,et al.Nature,2002,Vol.415,p141-147Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexesTheproteincomplexnetwork,andgroupingofconnectedcomplexes.作者提出,真核生物蛋白质组是一个多蛋白复合体网络.图中不同的彩色代表不同的多蛋白复合体,如:细胞周期;信号传导;转录;DNA保持;染色体结构;蛋白质和RNA运输;RNA代谢;蛋白质合成;能量代谢;膜生物合成等.蛋白质组与临床蛋白质组学88Anne-ClaudeGavin,etal.Natun英国、德国及丹麦科学家近日研究表明，人类和果蝇等简单有机体的巨大差别不在于基因数，而在于他们体内蛋白质相互作用（proteininteractions）的数量。研究人员将人体内蛋白质相互作用的总数称作“人类相互作用组”（humaninteractome），意在与人类基因组相比较。n在最新的研究中，英国伦敦帝国理工学院生命科学系的MichaelStumpf和同事设计了一种新颖的数学工具，结合相关数据能够估计出一个有机体蛋白质相互作用网络的尺寸。n结果显示，人体内蛋白质相互作用的数量大约为65万，是果蝇的10倍，是单细胞酵母等的20倍。这与之前基因数的比较结果相差巨大人类的基因数与果蝇的基因数相比，二者相差不到2倍。nStumpf说：“仅仅了解人类基因组肯定不足以解释我们与其它物种的差别。我们的研究表明，蛋白质相互作用应该是一把开启生物体之间差别程度原因之锁的钥匙。”人体内蛋白质相互作用的数量MichaelP.H.Stumpf,et al.Estimatingthesizeofthehumaninteractome.PNAS,2008,105:6959-6964蛋白质组与临床蛋白质组学89英国、德国及丹麦科学家近日研究表明，人类和果蝇等简单有机体的蛋白质相互作用的网络图谱n德国海德堡的科学家ErichE.Wanker等为系统检测人类蛋白质间相互作用，选择了4456个诱饵蛋白和5632个猎物蛋白，采用酵母双杂交方法进行研究。结果，在1705种蛋白质间之间确定了3186种新的相互作用关系。采用免疫共沉淀和Pull-down技术验证了这一结果。通过拓扑学等评价，至少确认了401种蛋白质间有911种相互作用联系。n进一步研究这些蛋白质间相互作用与人类疾病的关系，发现了至少两个新的与Axin-1相互作用的蛋白质ANP32A和CRMP1能够调节Wnt信号通路，从而影响发育，肿瘤等。虽然这仅仅筛选了这两个新蛋白，但可以肯定的是，这一研究成果中包含有大量的重要信息有待更深入地发掘。Erich E.Wanker et al.A Human Protein-Protein Interaction Network:A Resource for Annotating the Proteome.Cell,2005(122):957968 蛋白质组与临床蛋白质组学90蛋白质相互作用的网络图谱德国海德堡的科学家ErichE.蛋白质相互作用的重要意义n200种蛋白质及2000种组合结构进行解析后，发现其中三分之一的蛋白质相互组合会导致疾病，容易导致疾病的蛋白质和其它蛋白质结合以后也将变得十分活跃，致使发病和病情恶化。n绝大多数疾病都是由10万种以上的特定蛋白质相互作用所致。n蛋白质蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。蛋白质组与临床蛋白质组学91蛋白质相互作用的重要意义200种蛋白质及2000种组合结构进可以说，蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础n蛋白质-蛋白质相互作用控制着生命的各个过程，决定着几乎所有的生物功能，是整个生命结构和生命活动的基础和重要特征之一。n细胞各种重要的生理过程，包括信号的转导、细胞对外界环境及内环境变化的反应等，都是以蛋白质间相互作用为纽带，并形成网络。n高等动物基因组已有的研究结果也表明，调节生物体复杂性的不是基因数量的增加，而是基于更为复杂的蛋白质蛋白质间发生的相互作用。n蛋白质之间的相互作用不限于过去认识到的连锁反应或级联反应，它是一个复杂交错和具有精密调控的反应网络，n因此，要了解细胞的功能，必须从孤立情况下和与别的蛋白质相互作用情况下这两个层面来认识蛋白质的功能。相对来说，基因之间并不发生这种直接的相互作用。蛋白质组与临床蛋白质组学92可以说，蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的Proteomics-The Study of the ProteomeGenomicsSequencemRNAProteinProductFunctionalproteinTranscriptionalcontrolTranslationalcontrolPost-translationalcontrolmRNA stabilitymRNA secondary structureprotein processingprotein modificationprotein stabilityprotein complex formation(Levels of Control)Information:Critical to Understanding Disease Mechanisms35,000Genes1,000,000Proteins蛋白质组与临床蛋白质组学93Proteomics-TheStudyoftheP、蛋白质组学的研究策略与研究模式蛋白质组与临床蛋白质组学94、蛋白质组学的研究策略与研究模式蛋白质组与临床蛋白质组学9提取的样品蛋白质或多肽提取的样品蛋白质或多肽Bottom Up策略策略 Top Down 策略策略 蛋白质分离蛋白质分离高分辨高分辨MS/MS质谱鉴定质谱鉴定,序列分析序列分析双向电泳分离双向电泳分离电泳策略电泳策略酶解得到肽混合物酶解得到肽混合物质谱测定肽质量指纹谱质谱测定肽质量指纹谱（MALDI-MS,ESI-MS)利用质谱分析数据利用质谱分析数据,以分析软件通过互联网上的蛋白质数据库搜索目标蛋白质以分析软件通过互联网上的蛋白质数据库搜索目标蛋白质 Shotgun策略策略酶解得到肽混合物酶解得到肽混合物多维色谱分离多维色谱分离MS/MS质谱鉴定质谱鉴定,序列分析序列分析MS分析分析m/z 谱谱比较分析比较分析蛋白质功能分析蛋白质功能分析(western blot、免疫组织化学、激光共聚焦显微技术、分免疫组织化学、激光共聚焦显微技术、分子生物学技术子生物学技术)蛋白质组与临床蛋白质组学95提取的样品蛋白质或多肽BottomUp策略TopDow蛋白质组与临床蛋白质组学96蛋白质组与临床蛋白质组学96Top-downversusbottom-upproteomicsnTop-downnAdvantagesnCompleteproteinsequenceaccessnPTMlocationnNoproteindigestionrequirednDisadvantagesnMSequipmentsareexpensivetopurchaseandoperatenDoesnotworkwellforlargeproteins(50kDa)nLimitationincouplingwithonlineseparationsnProteinfragmentationpoorlyunderstoodnBottom-upnAdvantagesnMorematuretechniquenCanbefullyautomatednFeasibleforcomplicatedsamplesnQuantificationnDisadvantagesnPartialsequencecoveragenLossofinformationofPTMsnLossofinformationaboutlow-abundanceproteins蛋白质组与临床蛋白质组学97Top-downversusbottom-upprot蛋白质组学通常分为4种研究模式n1、完全蛋白质组学，是检测特定细胞或组织内所有蛋白质组成、定位、理化参数等；n2、功能蛋白质学，研究与某一功能相关的所有蛋白质；n3、修饰蛋白质组学，研究蛋白质修饰，如甲基化、磷酸化、泛素化等；n4、比较蛋白质组学（差异蛋白质组学），通过比较分析不同状态下细胞或组织蛋白质表达图谱，着重研究不同生物体在不同时刻或状态下蛋白质表达的变化情况，发现与特定生理病理状态密切相关的差异表达蛋白，从而阐明特定生理病理状态产生的本质规律。PandeyA,MannM.Proteomicstostudygenesandgenomes.Nature,2000,405(6788):837-846.蛋白质组与临床蛋白质组学98蛋白质组学通常分为4种研究模式1、完全蛋白质组学，是检测特定蛋白质组与临床蛋白质组学99蛋白质组与临床蛋白质组学99比较蛋白质组学n比较蛋白质组学（ComparativeProteomics）针对不同空间、不同时间上动态变化着的蛋白质组的整体进行比较，分析不同蛋白质组之间在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异，可以发现与病变相关的特异蛋白质。nComparativeProteomics：Studytheproteomicchangesindifferentstatesbyidentifyingdifferentiallyexpressedproteinsandtheirmodification蛋白质组与临床蛋白质组学100比较蛋白质组学比较蛋白质组学（ComparativeProComparativeProteomicsPurposes：TherapeutictargetdiscoveryDiagnostic/prognosticmarkerdevelopmentMechanisticstudy空间上的差异时间上的差异蛋白质组与临床蛋白质组学101ComparativeProteomicsPurposesNDNDND01000994.5245.9228.9186.9175.1171.3159.044.069.9893.41056.11326.71923.42100.66002200624.3769.8994.51501.91759.86002200attttaaaatattcctatttaaaaaaaatgaaattaMKLgatccatcaaaatgtgttcaagtttcaatctctggtttaaaacaaataaatactcagcttacttgtaatggtgaaccttgtaatactccaacagttacaccaacaacaccaactggaccattaaaatttaattataaattagataatgtacactattatcaatatagagttacagtaacaRV-ADDQFRVEDFSINFYYALALKSYD EPCNTPTVTPTTPTGPLKFNYKLD比较蛋白质组学的研究模式starting tissuesample points2-DE map differentially expressed spotspeptide MS and MS-MSproteinsequencemetabolicdrugtargetsNDMassspectrometry蛋白质组与临床蛋白质组学102NDNDND01000994.5245.9228.9186.比较蛋白质组学研究具有的优势：n1、在技术上有更高的可实现性，目前的研究技术还难以把细胞内所有的蛋白质展现出来；n2、可以反映蛋白质的动态本质；n3、具有广泛和明确的应用前景，如疾病生物标记物的研究等。蛋白质组与临床蛋白质组学103比较蛋白质组学研究具有的优势：1、在技术上有更高的可实现性，目前蛋白质组研究中的主流技术Proteome Separationn1DEn2DEnMulti-dimensionalHPLCBio mass SpectrometrynMALDITOFMSnESIMSnHybridMS/MSBioinformatics nDatabasesnToolsandSoftwares蛋白质组与临床蛋白质组学104目前蛋白质组研究中的主流技术ProteomeSeparat二维电泳图谱所传达的信息n蛋白质的分布范围(偏酸性或偏碱性)n表达蛋白质的可能个数(凝胶点的数目)n蛋白质的的大概相对分子量n蛋白质的的大概相对等电点n蛋白质相对表达丰度(点的灰度值)n但是，通过二维电泳分离不能得到完整的功能蛋白质，得到的是构成蛋白质的各个亚基。