植物遗传转化技术培训课件

植物植物遗传转化技化技术植物遗传转化植物遗传转化是指以植物器官、组织、细是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株的过程。表达的可育植株的过程。植物遗传转化植物遗传转化2植物遗传转化技术植物遗传转化方法植物遗传转化方法3植物遗传转化技术植物遗传转化常用的方法植物遗传转化常用的方法1 1、载载体体法法转转化化农农杆杆菌菌介介导导法法（TiTi质粒）质粒）22、非载体介导的遗传转化、非载体介导的遗传转化（1 1）基因枪法）基因枪法（2 2）超声波法）超声波法（3 3）脂质体法（又称融合法）脂质体法（又称融合法）（4 4）电转化）电转化（5 5）花粉管转化）花粉管转化4植物遗传转化技术将待转化的将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为为430 m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶片等，但进去的籽、叶片等，但进去的DNA片段整合效率极低。片段整合效率极低。1 基因枪转化法基因枪转化法5植物遗传转化技术将高浓度的质粒将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在质体悬浮液中，混合物在 200-600V/cm 的的电场中处理若干秒，然后将原生质体在组织电场中处理若干秒，然后将原生质体在组织培养基中生长，再生出整株植物。培养基中生长，再生出整株植物。2 电击法电击法6植物遗传转化技术 将外源将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。融合子，再生植物细胞壁。所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体再生出整株植物存在一个难题，即：原生质体再生出整株植物比较难。比较难。3 融合法融合法7植物遗传转化技术 外源外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。4 花粉管导入法花粉管导入法8植物遗传转化技术花粉管导入法的特点是花粉管导入法的特点是直接直接、简便简便。受体材料为植株整体受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，早期胚胎细胞，导入的导入的DNADNA分子整合效率较高。分子整合效率较高。9植物遗传转化技术 几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型菌细胞内的野生型Ti（Tumor-inducing）质）质粒介导的。粒介导的。5 农杆菌介导农杆菌介导10植物遗传转化技术植物遗传转化载体植物遗传转化载体11植物遗传转化技术作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能：作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能：1.1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去，并且它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基因组整合到宿主细胞的基因组DNADNA上；上；2.2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNADNA序列。序列。12植物遗传转化技术 人人们们很很早早就就发发现现双双子子叶叶植植物物常常发发生生一一种种冠冠瘿瘿瘤瘤病病，该该病病在在法法国国、东东欧欧和和意意大大利利的的葡葡萄萄和和果果树树上上曾曾大大面面积发生。积发生。1907年年首首先先发发现现这这种种冠冠瘿瘿瘤瘤病病是是由由根根癌癌农农杆杆菌菌引引发发的。的。农杆菌的农杆菌的TiTi质粒质粒13植物遗传转化技术电镜下的根癌农杆菌电镜下的根癌农杆菌冠瘿瘤冠瘿瘤14植物遗传转化技术1974年年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为），称为Ti质粒质粒。15植物遗传转化技术19771977年年ChiltonChilton等在研究农杆菌侵染后形成的等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细植物肿瘤细胞胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌TiTi质质粒的一个片段，称为粒的一个片段，称为T-DNAT-DNA（Transfer-DNATransfer-DNA）。实验表明，实验表明，T-DNAT-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发进一步研究发现，现，整合到植物基因组中的整合到植物基因组中的T-DNAT-DNA可以通过减数分裂稳定可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代。地传给植物的后代。TiTi质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。要基础。16植物遗传转化技术17植物遗传转化技术TiTi质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质；质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质；双股共价闭合的环状双股共价闭合的环状DNADNA分子；分子；T-DNAT-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表达；能够插入到植物基因组中并能稳定表达；长度长度150-200KB150-200KB；植物基因工程常用的载体。植物基因工程常用的载体。18植物遗传转化技术根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同分：碱种类不同分：章鱼碱型（章鱼碱型（octopineoctopine）胭脂碱型（胭脂碱型（nopalinenopaline）农杆碱型（农杆碱型（agropineagropine）琥珀碱型（琥珀碱型（agrocinoineagrocinoine）19植物遗传转化技术章鱼碱的遗传图胭脂碱的遗传图20植物遗传转化技术Ti质粒结构质粒结构T-DNAT-DNA区、毒性区区、毒性区(vir)(vir)、质粒复制起点、质粒复制起点(ori)(ori)、质粒、质粒结合转移位点结合转移位点(con)(con)、冠瘿碱分解位点、冠瘿碱分解位点(ocs or nos)(ocs or nos)TiTi质粒结构质粒结构21植物遗传转化技术左边界左边界LBLB右边界右边界RBRB生长素合成基因生长素合成基因细胞分裂素合成基因细胞分裂素合成基因冠瘿碱合成基因合成基因冠瘿碱合成基因合成基因VirVir基因基因复制起始位点复制起始位点ConCon区区OncOnc基因基因22植物遗传转化技术VirVir区（毒性区）：区（毒性区）：与与T-DNAT-DNA区彼此相邻，约占区彼此相邻，约占TiTi质粒质粒总长度的总长度的1/31/3；该区段上的基因与该区段上的基因与T-DNAT-DNA从细菌转移到植物细胞的遗从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性；传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性；VirVir区段总长度约区段总长度约35kb35kb，由，由7 7个互补群组成；个互补群组成；毒性区中各位点的表达情况分为两种：毒性区中各位点的表达情况分为两种：组成性表达组成性表达植物诱导性表达植物诱导性表达23植物遗传转化技术VirVir基因的功能基因的功能：n诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上 VirAVirA蛋白蛋白；n产物诱导产物诱导T-DNAT-DNA形成单股形成单股DNADNA片段片段-VirDVirD蛋白蛋白；n将将T-DNAT-DNA转入植物细胞，整合到寄主基因组中转入植物细胞，整合到寄主基因组中-VirDVirD、E E蛋白蛋白；nT-DNAT-DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠瘿基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠瘿碱。碱。24植物遗传转化技术T-DNAT-DNA（Transfer DNATransfer DNA）是农杆菌侵入植物细胞时从是农杆菌侵入植物细胞时从TiTi质粒上转移到质粒上转移到植物细胞的一段植物细胞的一段DNADNA；T-DNAT-DNA两端个有一段两端个有一段25bp25bp的同向重复序列，是的同向重复序列，是T-DNAT-DNA的边缘区。的边缘区。LBLB；RBRB在同一条单链的在同一条单链的LBLB和和RBRB内各形成一个缺口，内各形成一个缺口，单链单链T-DNAT-DNA进入植物细胞进入植物细胞25植物遗传转化技术损伤的植物根部会分泌损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的质粒上的vir基因基因以及以及根瘤菌染色体上的根瘤菌染色体上的一个一个操纵子操纵子表达。表达。vir基因产基因产物将物将Ti质粒上的质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产色体上的操纵子表达产物则与单链物则与单链T-DNA结合结合形成复合物，后者转化形成复合物，后者转化植物根部细胞。植物根部细胞。Ti 质粒致瘤的分子机制质粒致瘤的分子机制26植物遗传转化技术T-DNA的染色体的染色体整合机制整合机制27植物遗传转化技术T-DNA的染色体整的染色体整合机制合机制28植物遗传转化技术目的基因目的基因中间表达载体中间表达载体改良的改良的TiTi质粒质粒转化载体系统转化载体系统一元载体系统一元载体系统双元载体系统双元载体系统TiTi质粒质粒天然天然TiTi质粒存在的缺陷质粒存在的缺陷中间表达载体的特性中间表达载体的特性卸甲载体卸甲载体构构 建建29植物遗传转化技术存在缺陷存在缺陷TiTi质粒分子量过大，一般在质粒分子量过大，一般在160160240kb240kb，在基因工，在基因工程中难以操作；程中难以操作；很难找到单一的酶切位点；很难找到单一的酶切位点；生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物；和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物；TiTi质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能在质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能在大肠杆菌中复制。大肠杆菌中复制。TiTi质粒上还存在一些对于质粒上还存在一些对于T-DNAT-DNA转移不起任何作用的转移不起任何作用的基因。基因。30植物遗传转化技术1、除去除去T-DNA上的生长素（上的生长素（tms）和分裂素（）和分裂素（tmr）生）生物合成基因物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；生长为整株植物；2、除去除去T-DNA上的有机碱生物合成基因上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；的生长；3、除去、除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短缩短载体的长度载体的长度；4、安装大肠杆菌复制子安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；以利于克隆操作；5、安装植物细胞的筛选标记安装植物细胞的筛选标记，如，如 neor 基因，使用植物基因，使用植物基因的启动子和基因的启动子和polyA化信号序列；化信号序列；6、安装多聚人工接头安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。以利于外源基因的克隆。Ti 质粒的改造质粒的改造31植物遗传转化技术TiTi质粒的改造质粒的改造-去除致瘤基因去除致瘤基因OncOnc由于影响植株再生的直接原因是由于影响植株再生的直接原因是T-DNAT-DNA中的中的OncOnc基因基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，即的质粒，即“卸甲卸甲”、“解除解除”、“缴械缴械”其其“武武装装”的的TiTi载体，记为载体，记为Onc-Onc-，构建的，构建的Onc-Onc-载体叫载体叫“卸卸甲载体甲载体”。卸甲载体：卸甲载体：构建无毒的构建无毒的TiTi质粒载体质粒载体例：例：pGV3850:pGV3850:是从胭脂碱是从胭脂碱TiTi质粒质粒PTIC58PTIC58衍生而来的衍生而来的32植物遗传转化技术TiTi质粒的其他部分质粒的其他部分右边界右边界（RB）胭脂合成酶基因（胭脂合成酶基因（NosNos)pBR322（含含AMPr）左边界左边界（LB）卸甲载体卸甲载体33植物遗传转化技术中间表达载体中间表达载体中间载体：中间载体：带有带有重组重组T-DNAT-DNA的的大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒的衍生载体的衍生载体称为称为”中间载体中间载体”原理：原理：大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性转移的特性 目的：目的：把预先进行亚克隆、切除、插入或置把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的换的T-DNAT-DNA引入引入TiTi质粒中质粒中。34植物遗传转化技术中间表达载体：中间表达载体：是由是由中间载体中间载体（含选择标记含选择标记）加上能在植物细胞中表达的加上能在植物细胞中表达的启动子启动子及及目的基目的基因因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构成。成。嵌合基因（嵌合基因（chimeric genechimeric gene）就是来自两种或两种以上生物的启动子、就是来自两种或两种以上生物的启动子、结构基因、终止子连接在一起构成基因。结构基因、终止子连接在一起构成基因。35植物遗传转化技术中间表达载体中间表达载体-启动子及调控序列启动子及调控序列TiTiTiTi质粒质粒质粒质粒 NosNosNosNos、OcsOcsOcsOcs等基因具有与真核生物启动子类似等基因具有与真核生物启动子类似等基因具有与真核生物启动子类似等基因具有与真核生物启动子类似的的的的TATATATATATATATA盒和盒和盒和盒和CAATCAATCAATCAAT盒，均能在植物细胞中表达，并盒，均能在植物细胞中表达，并盒，均能在植物细胞中表达，并盒，均能在植物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以基因的启动子，其中以基因的启动子，其中以基因的启动子，其中以NosNosNosNos启动子（启动子（启动子（启动子（pNospNospNospNos）最常用。）最常用。）最常用。）最常用。CaMVCaMVCaMVCaMV的的的的35s35s35s35s启动子启动子启动子启动子 花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒DNADNADNADNA的的的的CaMVCaMVCaMVCaMV的的的的35s35s35s35s启动子能使嵌启动子能使嵌启动子能使嵌启动子能使嵌合的外源基因在植物细胞中表达。合的外源基因在植物细胞中表达。合的外源基因在植物细胞中表达。合的外源基因在植物细胞中表达。36植物遗传转化技术为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的新物种。新物种。新物种。新物种。目的基因目的基因37植物遗传转化技术中间表达载体中间表达载体-选择标记选择标记供植物转化体的选择标记：供植物转化体的选择标记：新霉素磷酸转移酶基因新霉素磷酸转移酶基因(npt)卡那霉素抗性基因卡那霉素抗性基因(kanr)潮霉素潮霉素B磷酸转移酶基因，可抗潮霉素磷酸转移酶基因，可抗潮霉素(hygr)氨苄青霉素抗性氨苄青霉素抗性(Ampr)四环素抗性四环素抗性(Tcr)庆大霉素抗性庆大霉素抗性(Genr)38植物遗传转化技术CatCat（氯霉素乙酰移酶基因）（氯霉素乙酰移酶基因）CatCat也也是是应应用用得得较较多多的的一一种种报报告告基基因因。它它来来自自细细菌菌转转座座子子Tn9Tn9的的氯氯霉霉素素乙乙酰酰转转移移酶酶基基因因的的结构基因。结构基因。39植物遗传转化技术40植物遗传转化技术植物遗传转化载体系统转化载体系统转化载体系统一元载体转化系统一元载体转化系统双元载体转化系统双元载体转化系统41植物遗传转化技术一元载体转化系统 这类载体是中间表达载体与改造后的受体这类载体是中间表达载体与改造后的受体TiTi质质粒之间，通过粒之间，通过同源重组同源重组所产生的一种复合型载体。所产生的一种复合型载体。一元载体系统目前主要有两种载体：一元载体系统目前主要有两种载体：一元载体系统目前主要有两种载体：一元载体系统目前主要有两种载体：共整合载体共整合载体共整合载体共整合载体拼接未端载体拼接未端载体拼接未端载体拼接未端载体（split-end vector,SEVsplit-end vector,SEV）42植物遗传转化技术一元载体转化系统一元载体转化系统-共整合载体共整合载体 共整合载体的特点是：共整合载体的特点是：共整合载体的特点是：共整合载体的特点是：中间表达载体与受体中间表达载体与受体中间表达载体与受体中间表达载体与受体TiTiTiTi卸甲载体，通过同源重卸甲载体，通过同源重卸甲载体，通过同源重卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；组共整合而构建；组共整合而构建；组共整合而构建；中间表达载体与受体中间表达载体与受体中间表达载体与受体中间表达载体与受体TiTiTiTi质粒之间同源序列是质粒之间同源序列是质粒之间同源序列是质粒之间同源序列是pBR322pBR322pBR322pBR32243植物遗传转化技术Ti质粒的其他部分右边界（RB）胭脂合成酶基因（Nos)pBR322（含AMPr）左边界（LB）pBR322 vector目的基因重组载体卸甲载体外源基因插入外源基因插入pGV3850pGV3850的过程的过程中间载体共整合载体44植物遗传转化技术一元载体转化系统一元载体转化系统-拼接末端载体拼接末端载体 拼接末端载体（拼接末端载体（sp1it-end vecter,SEV）19851985年建立的，因它的两个年建立的，因它的两个LIHLIH序列在同源序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。重组前分别处于不同质粒上而得名。目的基因LIHnos基因MCSnptTR-DNASper/Strr中间载体pMON200pMON20045植物遗传转化技术转基因整合到植物基因组中TL-DNA部分序列LIHpTiB6S3Kanr同源重组卸甲载体中间载体pMON20046植物遗传转化技术一元载体转化系统一元载体转化系统-pGV3850pGV3850与与SEVSEV比较比较 共同点共同点共同点共同点:两者都是通过受体两者都是通过受体两者都是通过受体两者都是通过受体TiTiTiTi质粒与中间载体同源重组质粒与中间载体同源重组质粒与中间载体同源重组质粒与中间载体同源重组而形成，故同属于一元载体系统。而形成，故同属于一元载体系统。而形成，故同属于一元载体系统。而形成，故同属于一元载体系统。不同点：不同点：不同点：不同点：受体受体受体受体TiTiTiTi质粒与中间载体的结构不同。质粒与中间载体的结构不同。质粒与中间载体的结构不同。质粒与中间载体的结构不同。同源序列不同。同源序列不同。同源序列不同。同源序列不同。SEVSEVSEVSEV是更有效的共整合载体。是更有效的共整合载体。是更有效的共整合载体。是更有效的共整合载体。47植物遗传转化技术共整合转化程序48植物遗传转化技术一元载体转化系统一元载体转化系统-特点特点由两个质粒（由两个质粒（由两个质粒（由两个质粒（E.coliE.coli质粒和质粒和质粒和质粒和TiTi质粒）重组而成，质粒）重组而成，质粒）重组而成，质粒）重组而成，分子量较大；分子量较大；分子量较大；分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低；相对较低；相对较低；相对较低；必须用必须用必须用必须用SouthernSouthern杂交或杂交或杂交或杂交或PCRPCR对大的共整合体质粒对大的共整合体质粒对大的共整合体质粒对大的共整合体质粒进行检测；进行检测；进行检测；进行检测；构建时比较困难。构建时比较困难。构建时比较困难。构建时比较困难。49植物遗传转化技术双元载体转化系统双元载体转化系统-概念概念 是指由两个分别含是指由两个分别含是指由两个分别含是指由两个分别含T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA和和和和VirVirVirVir区的相容性突变区的相容性突变区的相容性突变区的相容性突变TiTiTiTi质质质质粒构成的双质粒系统粒构成的双质粒系统粒构成的双质粒系统粒构成的双质粒系统,又因为其又因为其又因为其又因为其T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA与与与与VirVirVirVir基因在两基因在两基因在两基因在两个独立的质粒上，通过反式激活个独立的质粒上，通过反式激活个独立的质粒上，通过反式激活个独立的质粒上，通过反式激活T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA转移转移转移转移,故称之故称之故称之故称之为反式载体（为反式载体（为反式载体（为反式载体（trans vectertrans vectertrans vectertrans vecter）。）。）。）。主要包括两个载体（主要包括两个载体（主要包括两个载体（主要包括两个载体（TiTiTiTi质粒）质粒）质粒）质粒）穿梭载体穿梭载体穿梭载体穿梭载体（微型（微型（微型（微型TiTiTiTi质粒）质粒）质粒）质粒）卸甲载体卸甲载体卸甲载体卸甲载体（辅助（辅助（辅助（辅助TiTiTiTi质粒）质粒）质粒）质粒）50植物遗传转化技术双元载体转化系统双元载体转化系统 基于基于T-DNAT-DNA转移机制的两种特点：转移机制的两种特点：对对T-DNAT-DNA转移和整合到植物染色体中起顺式作转移和整合到植物染色体中起顺式作用的仅仅是其末端用的仅仅是其末端2424个重复序列。个重复序列。能引起能引起T-DNAT-DNA转移和整合的毒性区转移和整合的毒性区(vir)(vir)基因基因产物起反式作用，即产物起反式作用，即VirVir基因不必与基因不必与T-DNAT-DNA末末端重复序列位于同一质粒上，可由另一种质端重复序列位于同一质粒上，可由另一种质粒提供。粒提供。51植物遗传转化技术双元载体转化系统双元载体转化系统-穿梭载体穿梭载体穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)(shuttle vector)是指含有两个亲缘是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制，又能在真制的。例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体。核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列标记基因，还有真核生物的自主复制序列(ARS)(ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基扩增克隆的基因因,在酵母菌中用于基因表达分析在酵母菌中用于基因表达分析.52植物遗传转化技术双元载体转化系统双元载体转化系统-穿梭载体穿梭载体LBRB35SNptOCSLacZODAmprpTiCH5穿梭载体穿梭载体穿梭载体穿梭载体-微型微型微型微型TiTiTiTi质粒质粒质粒质粒53植物遗传转化技术双元载体转化系统双元载体转化系统-卸甲载体卸甲载体 含有含有VirVir区段的区段的TiTi质粒称为辅助质粒称为辅助TiTi质粒，其质粒，其主要作用是提供主要作用是提供VirVir基因功能，激活处于反式基因功能，激活处于反式位置上的位置上的T-DNAT-DNA转移。转移。virpAL440454植物遗传转化技术将外源基因克隆在大肠杆菌将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；区内；重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含区不含T-DNA区的区的Ti辅助质粒；辅助质粒；以上述重组农杆菌感染植物细胞。以上述重组农杆菌感染植物细胞。二元整合转化程序二元整合转化程序55植物遗传转化技术帮助质粒农杆菌农杆菌感染植物接合转移接合转移进入植物细胞核整合，表达VirE.coli穿梭载体左右外源基因Vir左右外源基因左右外源基因双元载体系统转化过程56植物遗传转化技术一元载体系统和双元载体系统的比较一元载体系统和双元载体系统的比较一、双元载体不需要共整合过程：一、双元载体不需要共整合过程：系统中的两个质粒不必含有同源序列，构建系统中的两个质粒不必含有同源序列，构建的操作步骤比较简单。插入载体的外源基因的操作步骤比较简单。插入载体的外源基因变异小。变异小。57植物遗传转化技术一元载体系统和双元载体系统的比较一元载体系统和双元载体系统的比较二、穿梭质粒二、穿梭质粒 具有具有E.coliE.coli质粒的复制位点，能在农杆菌质粒的复制位点，能在农杆菌的寄主中复制，使其质粒的拷贝数增加的寄主中复制，使其质粒的拷贝数增加1010100100倍倍 分子量小（分子量小（10kb10kb），可以直接进行体外遗传），可以直接进行体外遗传操作。操作。转移到农杆菌比较容易（转化效率高），转移到农杆菌比较容易（转化效率高），而且构建的频率较高而且构建的频率较高。58植物遗传转化技术一元载体系统和双元载体系统的比较一元载体系统和双元载体系统的比较 三、一元载体稳定性较好三、一元载体稳定性较好共整合载体构建成功后，工程菌的稳定性较共整合载体构建成功后，工程菌的稳定性较好，双元载体稳定性较差，容易丢失。好，双元载体稳定性较差，容易丢失。59植物遗传转化技术载体构建中常用的报告基因载体构建中常用的报告基因 报告基因的作用报告基因的作用报告基因的作用报告基因的作用对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞作进对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞作进对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞作进对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞作进一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体；一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体；一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体；一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体；是在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否是在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否是在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否是在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到表达；表达；表达；表达；被用于启动子表达特性的评估和亚细胞区间的研究被用于启动子表达特性的评估和亚细胞区间的研究被用于启动子表达特性的评估和亚细胞区间的研究被用于启动子表达特性的评估和亚细胞区间的研究分析等。分析等。分析等。分析等。61植物遗传转化技术载体构建中常用的报告基因载体构建中常用的报告基因必须具备以下五个条件：必须具备以下五个条件：必须具备以下五个条件：必须具备以下五个条件：已被克隆和全序列已测定；已被克隆和全序列已测定；已被克隆和全序列已测定；已被克隆和全序列已测定；编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；基因较小，可构成嵌合基因；基因较小，可构成嵌合基因；基因较小，可构成嵌合基因；基因较小，可构成嵌合基因；能在转化体中得到充分表达；能在转化体中得到充分表达；能在转化体中得到充分表达；能在转化体中得到充分表达；检测容易，并且能定量分析；检测容易，并且能定量分析；检测容易，并且能定量分析；检测容易，并且能定量分析；62植物遗传转化技术 冠瘿碱冠瘿碱opineopine基因基因 NosNos和和OcsOcs基因不在细菌中表达，故它们在基因不在细菌中表达，故它们在植物组织中的出现，通常是转化已发生的很植物组织中的出现，通常是转化已发生的很好证据。好证据。优点：优点：检测和分析非常快、简单和廉价检测和分析非常快、简单和廉价缺点：缺点：受伤的植物组织有时能产生冠瘿碱受伤的植物组织有时能产生冠瘿碱63植物遗传转化技术TiTi质粒来自细菌（原核）系统，为何其基因能在质粒来自细菌（原核）系统，为何其基因能在真核生物中表达？真核生物中表达？证据一证据一.T-DNA.T-DNA的基因不含有内含子，几乎每个基的基因不含有内含子，几乎每个基因的翻译起始位点都是因的翻译起始位点都是AUGAUG；证据二证据二.无论是胭脂碱合成酶基因无论是胭脂碱合成酶基因nosnos还是章鱼碱还是章鱼碱合成酶基因合成酶基因ocsocs的的55末端都具有真核特有的末端都具有真核特有的TATA-box,CAA-TboxTATA-box,CAA-Tbox；证据三证据三.T-DNAT-DNA产生的产生的mRNAmRNA均是典型的植物均是典型的植物mRNAmRNA分分子。子。64植物遗传转化技术植物遗传转化实验操作过程植物遗传转化实验操作过程65植物遗传转化技术农杆菌的活化农杆菌的活化66植物遗传转化技术挑单克隆挑单克隆67植物遗传转化技术摇床培养摇床培养68植物遗传转化技术测测ODOD60060069植物遗传转化技术收集细胞收集细胞70植物遗传转化技术用液体用液体LBLB培养基重悬细胞培养基重悬细胞71植物遗传转化技术将预培养的外植体放入菌液中共培养将预培养的外植体放入菌液中共培养72植物遗传转化技术100rpm,30min73植物遗传转化技术取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液74植物遗传转化技术共培养共培养75植物遗传转化技术在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽成转化芽76植物遗传转化技术生根，形成转化植株生根，形成转化植株77植物遗传转化技术