肿瘤实验动物和细胞研究技术课件

ApproachesandTechniquesinResearchonTumorAcourseforPh.D.candidatesApproaches and Techniques 1肿瘤的实验动物和细胞研究技术肿瘤的实验动物和细胞研究技术Theanimalmodelandinvitroresearchoftumor肿瘤的实验动物和细胞研究技术The animal model2常用研究方式：常用研究方式：InVitro:体外研究，细胞、组织培养下进行InVivo:体内研究，人类疾病的动物模型ExVivo:细胞经体外实验处理后，再回输到体内体外处理：转染基因或改变环境(用一些因子)使其分化等常用研究方式：3体外研究(InVitro)原代培养肿瘤细胞原代培养肿瘤细胞:从肿瘤组织中分离得到的细胞在体外成功地进行从肿瘤组织中分离得到的细胞在体外成功地进行培养称为原代培养培养称为原代培养(primaryculture)肿瘤细胞系肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约原代培养肿瘤细胞能连续传代（约710天传代一次）天传代一次）半年以上半年以上,生长稳定生长稳定,并能保持肿瘤细胞的特性，并能保持肿瘤细胞的特性，称为肿瘤细胞系称为肿瘤细胞系(cellline)肿瘤细胞株肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cellstrain),细胞具有细胞具有相同的基因型和表型相同的基因型和表型(单克隆单克隆)体外研究(In4肿瘤细胞株的建立：肿瘤细胞株的建立：1、直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养建系和建株建系和建株;(从自发或诱发瘤从自发或诱发瘤)2、从人或动物的移植肿瘤、从人或动物的移植肿瘤(如人肿瘤裸鼠移植瘤如人肿瘤裸鼠移植瘤)组织分离组织分离培养建系及建株培养建系及建株;(从移植瘤从移植瘤)3、用化学或生物、用化学或生物(病毒病毒)方法在体外转化正常的人或动物的方法在体外转化正常的人或动物的细胞株而获得肿瘤细胞株。细胞株而获得肿瘤细胞株。(体外转化体外转化)肿瘤细胞株的建立：5肿瘤细胞株的鉴定肿瘤细胞株的鉴定：1.有关的原始资料有关的原始资料,包括供瘤病人的包括供瘤病人的姓名姓名、年龄年龄、性别性别、病历号病历号、临临床床诊诊断断（TNM）、活活检检病病理理诊诊断断,手手术术切切除除日日期期、最最后后病病理理诊诊断断等等2.形态学观察形态学观察:普普通通倒倒置置相相差差光光镜镜:活活细细胞胞的的形形态态,细细胞胞间间桥桥,分分泌泌颗颗粒粒,重重叠叠生生长长,Giemsa染色或染色或H.E.染色的光镜染色的光镜形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系:HeLa:高浓度血清高浓度血清长梭形长梭形;低浓度血清低浓度血清圆形细胞圆形细胞,排列如鹅卵石路面排列如鹅卵石路面;透射和扫描电镜透射和扫描电镜3D组织结构组织结构肿瘤细胞株的鉴定：63.核型及染色体观察核型及染色体观察:整倍体整倍体,异倍体异倍体,染色体畸变染色体畸变、标记染色体标记染色体,染色体分带分析染色体分带分析,相隔一定时间重复观察数次相隔一定时间重复观察数次4.生长特性生长特性:分裂指数分裂指数（3H-thymidine或或5-BrdU的的labelingindex）、）、生长曲线生长曲线、细胞群体倍增时间细胞群体倍增时间、集落形成或贴壁率（集落形成或贴壁率（platingefficiency）半固体培养介质中的集落形成率半固体培养介质中的集落形成率5.组织特性的鉴定组织特性的鉴定:免疫细胞化学方法免疫细胞化学方法 7上皮性肿瘤标志上皮性肿瘤标志:CK、上皮膜抗原（、上皮膜抗原（EMA）、）、癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）;淋巴瘤抗原标志淋巴瘤抗原标志:人白细胞分化抗原簇（人白细胞分化抗原簇（CD）,有有274个以上个以上,T淋巴细胞淋巴细胞:UCHL-1(CD45RO),B淋巴细胞淋巴细胞:L26（CD20）,软组织肿瘤标志：软组织肿瘤标志：波形蛋白（波形蛋白（Vm）肌源性：肌源性：结蛋白（结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白神经源性：神经源性：神经微丝（神经微丝（NF）、）、S-100蛋白、蛋白、Leu-7、神经元特异性烯醇化酶（神经元特异性烯醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白）、髓磷脂碱性蛋白(MBP)组织细胞源性：组织细胞源性：-1抗胰蛋白酶、抗胰蛋白酶、-1抗糜蛋白酶、抗糜蛋白酶、CD68血管源性：血管源性：八因子相关抗原、八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素、荆豆凝集素(UL)基膜源性：基膜源性：纤连蛋白（纤连蛋白（FN）和层粘连蛋白（）和层粘连蛋白（LN）体体外外培培养养时时肿肿瘤瘤细细胞胞株株有有可可能能会会失失去去原原本本表表达达的的某某些些组组织织抗抗原原,抗抗原原标标志志要要多选用几种抗体多选用几种抗体,以减少假阴性结果以减少假阴性结果;上皮性肿瘤标志:CK、上皮膜抗原（EMA）、癌胚抗原（86.其他特性：其他特性：(a)分泌激素和异位激素分泌激素和异位激素:绒毛膜癌绒毛膜癌HCG垂体瘤垂体瘤生长激素生长激素肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌ACTH人肺巨细胞癌细胞株（人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）促性腺激素促性腺激素肝癌肝癌HCG(b)肿瘤细胞的受体表达肿瘤细胞的受体表达:ERPRAR(c)酶及同工酶活性酶及同工酶活性:酶活性保持酶活性保持(HTC酪氨酸氨基转移酶酪氨酸氨基转移酶)、变化变化诱导剂诱导剂糖皮质激素、多肽激素糖皮质激素、多肽激素改变培养条件：改变培养条件：谷氨酸替代谷氨酰胺谷氨酸替代谷氨酰胺脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶活性活性增增7倍倍左右左右特异的同工酶谱：特异的同工酶谱：绒癌绒癌T3M-3表达胎盘性碱性磷酸酶表达胎盘性碱性磷酸酶 9(d)癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：高转移人卵巢细胞系高转移人卵巢细胞系HO-8910PM表达：表达：p53p16bcl-2nm-23CD44v6c-erbB-2EGFR等基因的蛋白产物等基因的蛋白产物不表达：不表达：Bax基因的蛋白产物基因的蛋白产物 107.细胞株交叉污染的检测：细胞株交叉污染的检测：细胞遗传学方法：细胞遗传学方法：染色体分析染色体分析特异的染色体标志探针作特异的染色体标志探针作FISHG带核型分析鉴别同种肿瘤细胞带核型分析鉴别同种肿瘤细胞Q带分析检测人带分析检测人Y染色体染色体免疫学方法：免疫学方法：HLA或动物的组织相容性抗原的测定或动物的组织相容性抗原的测定生化方法：生化方法：同工酶谱或其它生化指标同工酶谱或其它生化指标 7.细胞株交叉污染的检测：118.微生物污染的检测：微生物污染的检测：细菌：细菌：培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体真菌：真菌：培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子病毒：病毒：病毒核酸和蛋白产物病毒核酸和蛋白产物支原体：支原体：以核酸（以核酸（DNA）荧光染色即）荧光染色即H-stain(Hoechst33258，即二苯并咪唑染色即二苯并咪唑染色)较为常用较为常用,356nm光的激发下光的激发下可发出可发出458nm的强荧光的强荧光,12体外正常细胞恶性转化的鉴定体外正常细胞恶性转化的鉴定正常细胞体外恶性转化的鉴定指标正常细胞体外恶性转化的鉴定指标(14项指标项指标)（第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过）（第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过）核型分析出现非整倍体核型分析出现非整倍体能在软琼脂培养基中增殖并形成集落能在软琼脂培养基中增殖并形成集落异种动物接种能生成肿瘤异种动物接种能生成肿瘤端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高肿瘤实验动物和细胞研究技术课件13指标指标正常细胞正常细胞转化的纤维母细胞转化的纤维母细胞转化的上皮细胞转化的上皮细胞形态形态伸展良好伸展良好,折光较弱折光较弱;核质比小核质比小,梭形梭形,伸展较差伸展较差,折光较强折光较强;核质比大核质比大,与正常细胞之间差别不如纤维母细胞与正常细胞之间差别不如纤维母细胞胞质嗜碱性弱胞质嗜碱性弱;核仁较小较少核仁较小较少;胞质嗜碱性强胞质嗜碱性强,核仁较大较多核仁较大较多;多核巨细胞多核巨细胞大大;多形性较常见多形性较常见多核巨细胞较少多核巨细胞较少较多较多粘附性粘附性细胞间粘附性较强细胞间粘附性较强,紧贴瓶壁生长紧贴瓶壁生长粘附性差粘附性差,易脱落易脱落差别不明显差别不明显生长特性生长特性排列有方向性排列有方向性,单层生长单层生长,存在密度存在密度方向性消失方向性消失,多层重叠多层重叠,密度依赖性抑制消失密度依赖性抑制消失差别不明显差别不明显,某些细胞株呈重叠生长某些细胞株呈重叠生长依赖性抑制依赖性抑制对血清的依赖对血清的依赖较高较高较低较低差别不明显差别不明显扫描电镜观察扫描电镜观察微绒毛少微绒毛少微绒毛丰富微绒毛丰富微绒毛不稳定微绒毛不稳定,有时增多有时增多植物凝集素引起的凝集植物凝集素引起的凝集弱弱较弱较弱较强较强细胞表面的糖蛋白和糖脂细胞表面的糖蛋白和糖脂正常正常糖基化不完全糖基化不完全糖基化不完全糖基化不完全纤维连接蛋白纤维连接蛋白正常存在正常存在减少或消失减少或消失纤溶酶原激活酶纤溶酶原激活酶较低较低增高增高不稳定不稳定,某些株增高某些株增高胞质中微丝微管的排列胞质中微丝微管的排列规则规则紊乱紊乱不稳定不稳定胞质胞质cAMP浓度浓度较高较高较低较低核型核型二倍体二倍体非整倍体或假二倍体非整倍体或假二倍体非整倍体非整倍体琼脂培养琼脂培养不生长不生长生长生长生长生长接种异种易感动物接种异种易感动物不长肿瘤不长肿瘤长肿瘤长肿瘤长肿瘤长肿瘤指标 正常细胞 14世界各国的细胞库（世界各国的细胞库（cellbank）及索引）及索引美国美国美国典型培养细胞库美国典型培养细胞库（AmericanTypeCultureCollection,即即ATCC,Rockville,MD）人与动物细胞培养目录人与动物细胞培养目录（CatalogofHumanandOtherAnimalCellCultures,NavalBiosciencesLaboratory,CellCultureDepartment,NavalSupplyCenter,Oakland,CA)人基因突变细胞及老年细胞培养库人基因突变细胞及老年细胞培养库（HumanGeneticMutantCellCultureandAgeingCell,CultureRepositories,InstituteforMedicalResearch,Camden,NJ)欧洲欧洲真核细胞培养库真核细胞培养库(CulturedeCellulesEucaryotes,RepertoiredesUtilisateurs.,M.Adophe,D.Gourdji,A.Tixier-Vidal,R.Robineaux,InsermPublications,101RuedeTobiac,75654Paris,Cedex13医学病毒学系（医学病毒学系（DepartmentofMedicalVirology,InstitutedePasteur,Paris)欧洲动物细胞培养库欧洲动物细胞培养库（EuropeanCollectionforAnimalCellCultures,即即ECACC,PHLS/CAMR,Porton,Salisbury,England)欧欧洲洲人人类类基基因因突突变变细细胞胞库库(European Human GeneticMutant Cell Bank,Department of ClinicalGenetics,ErasmusUniversity,Rotterdam)日本日本癌细胞系库癌细胞系库(CollectionofCancerCelllines,NationalInstituteofHygenicSciences,Tokyo)普通细胞库普通细胞库(GeneralCellBank,InstituteofPhysicalandChemicalResearchofRIKEN,Saitama)FlowLaboratories;GIBCO 15特殊表型肿瘤细胞系（株）：特殊表型肿瘤细胞系（株）：高转移高转移人肝细胞性肝癌细胞株人肝细胞性肝癌细胞株MHCC97人黑色素瘤细胞株人黑色素瘤细胞株MV3、卵巢癌细胞株卵巢癌细胞株HO-8910PM、肺巨细胞癌细胞株肺巨细胞癌细胞株PGBE1高度耐药高度耐药人红白血病细胞株人红白血病细胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增对阿霉素的抗性增114.7倍倍分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子人肺小细胞癌细胞株人肺小细胞癌细胞株LU-165抗利尿激素抗利尿激素;人肺腺癌细胞株人肺腺癌细胞株LC-2/ad1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶人红白血病细胞株人红白血病细胞株K562高表达端粒酶高表达端粒酶肿瘤实验动物和细胞研究技术课件16体内研究体内研究(InVivo)肿瘤动物模型：肿瘤动物模型：自发性肿瘤自发性肿瘤诱发性肿瘤诱发性肿瘤移植性肿瘤移植性肿瘤.17一、自发性肿瘤一、自发性肿瘤种系种系：大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见Sinclair猪到一岁时有猪到一岁时有85%可发生恶性黑色素瘤可发生恶性黑色素瘤品系品系：C3H小鼠小鼠乳腺癌发病率为乳腺癌发病率为97%BALB/c乳腺癌发病率低乳腺癌发病率低AKR小鼠小鼠淋巴细胞性白血病发病率为淋巴细胞性白血病发病率为70%90%近交系近交系SJL/J小鼠小鼠淋巴瘤淋巴瘤(何杰金病何杰金病)自发率高达自发率高达91%缺点缺点：发病迟发病迟,发病时期不集中发病时期不集中,发病率也不稳定发病率也不稳定 一、自发性肿瘤18二、诱发性肿瘤二、诱发性肿瘤优点：优点：发生率、发病时间、发生部位及组织学类型均易控制发生率、发病时间、发生部位及组织学类型均易控制实验结果重复性相对较好实验结果重复性相对较好1.化学诱癌动物肿瘤模型化学诱癌动物肿瘤模型1775年英国医师年英国医师Pott扫烟囱扫烟囱阴囊癌阴囊癌1914年年,日本学者日本学者山极和市川山极和市川煤焦油煤焦油皮肤癌皮肤癌1934年年Yashida用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功我国从我国从1960年代开始进行化学诱癌动物模型的研究年代开始进行化学诱癌动物模型的研究1956年年亚硝胺亚硝胺和和1961年年黄曲霉毒素黄曲霉毒素的致癌作用相继被发现的致癌作用相继被发现 二、诱发性肿瘤19(1)化学致癌物化学致癌物诱发时间相对较短诱发时间相对较短有剂量有剂量-效应关系效应关系基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性，基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性，与生物大分子中富于电子的亲核残基相结合与生物大分子中富于电子的亲核残基相结合,影响硷基对的正常配位或大分子的结构与功能影响硷基对的正常配位或大分子的结构与功能正常细胞的癌变正常细胞的癌变.直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）肿瘤实验动物和细胞研究技术课件20常见化学致癌物常见化学致癌物:1)多环碳氢化合物多环碳氢化合物:25种以上种以上,以煤焦油的主要成分以煤焦油的主要成分3,4-苯并芘苯并芘和和3-甲基胆蒽的致癌性最强甲基胆蒽的致癌性最强2)氨基偶氮化合物氨基偶氮化合物:二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄(奶油黄奶油黄),3-甲基甲基-4,4-二甲基氨基偶氮苯二甲基氨基偶氮苯(3-Me-DAB)3)芳香胺类芳香胺类:苯胺印染工厂苯胺印染工厂吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出联苯胺联苯胺膀胱癌膀胱癌2-乙酰氨基芴乙酰氨基芴(2-AAF)4)亚硝胺类亚硝胺类:亚硝酸盐亚硝酸盐+二级胺二级胺亚硝胺类化合物亚硝胺类化合物强致癌物强致癌物致癌谱甚广致癌谱甚广不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官亲和性不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官亲和性对称衍生物如二烷基亚硝胺对称衍生物如二烷基亚硝胺肝癌肝癌不对称的亚硝胺不对称的亚硝胺食管癌食管癌 常见化学致癌物:215)霉菌毒素霉菌毒素:种类较多种类较多首推首推黄曲霉毒素黄曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉变的花生、存在于霉变的花生、玉米及谷物中玉米及谷物中,6)金属元素金属元素:砷、铬、镍砷、铬、镍、肺癌肺癌镉镉前列腺癌前列腺癌.(2)影响化学致癌的因素影响化学致癌的因素肿瘤实验动物和细胞研究技术课件221)动物方面动物方面品系品系:诱发肝癌时：诱发肝癌时：F-344大鼠对大鼠对DEN和和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高的敏感性要比其它品系的大鼠高诱发皮肤肿瘤：诱发皮肤肿瘤：BALB/c和和SENCAR品系小鼠对品系小鼠对DMNU、DENU的敏感性的敏感性大大高于大大高于Swiss品系小品系小鼠鼠性别性别:2AAF诱发肝癌：诱发肝癌：小鼠小鼠60%发生肝癌发生肝癌,小鼠不敏感小鼠不敏感.F-344大鼠大鼠,比比更敏感更敏感年龄年龄:一般而言一般而言,动物年龄越小动物年龄越小,对化学致癌物越敏感对化学致癌物越敏感,敏感性：敏感性：胎鼠胎鼠新生鼠新生鼠成年鼠成年鼠肿瘤实验动物和细胞研究技术课件232)化学致癌物方面化学致癌物方面剂量阈值剂量阈值:启动因子（启动因子（initiator）不表现明显的剂量阈值）不表现明显的剂量阈值促癌因子（促癌因子（promotor）则有剂量阈值）则有剂量阈值一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用,因此仍可表现有剂量阈值因此仍可表现有剂量阈值如如3-Me-DAB(60ppm)致癌强度致癌强度:诱发大鼠肝癌总剂量诱发大鼠肝癌总剂量:DAB为为1000mg3-Me-DAB为为600mg,2-AAF为为250mg,DMN只需只需100mg;肿瘤实验动物和细胞研究技术课件24诱癌潜伏期诱癌潜伏期:诱发肝癌：诱发肝癌：AFB1需时约需时约1年年,3-Me-DAB与与2-AAF约半年左右约半年左右,DEN一般只需一般只需3个月个月;诱癌靶器官诱癌靶器官:诱癌谱：相对专一，如诱癌谱：相对专一，如3-Me-DAB一般只引起肝癌一般只引起肝癌,较广，如亚硝胺类可诱发多器官肿瘤较广，如亚硝胺类可诱发多器官肿瘤;化学致癌物的相互作用化学致癌物的相互作用:多数多数协同作用而加速致癌协同作用而加速致癌,少数少数会产生拮抗作用会产生拮抗作用.有的化学物质单独使用时本身不致癌有的化学物质单独使用时本身不致癌,但可增强致癌物作用（促癌物）但可增强致癌物作用（促癌物）肿瘤实验动物和细胞研究技术课件25 3)3)诱癌方案（诱癌方案（carcinogenicregimen）和方法）和方法半年后半年后12周后周后喂正常饲料喂正常饲料(代表代表1周周)喂含喂含0.06%3Me-DAB的饲料的饲料喂含喂含0.02%2-AAF的饲料的饲料部分肝切除部分肝切除 半年后12周后喂正常饲料(代表1周)喂含0.06%326苯并蒽苯并蒽(Benzanthracene)直接涂擦皮肤直接涂擦皮肤注射至皮下注射至皮下产生皮肤癌产生皮肤癌产生纤维肉瘤产生纤维肉瘤苯并蒽(Benzanthracene)直接涂擦皮肤注射至皮下27非基因毒致癌物非基因毒致癌物(non-genotoxiccarcinogen)美国公布的美国公布的301种化合物中种化合物中,162种可致鼠类肿瘤种可致鼠类肿瘤其中其中36%不引起细胞不引起细胞DNA的改变的改变44%不引起细胞突变不引起细胞突变致癌机制？致癌机制？促进细胞增殖？促进细胞增殖？抑制细胞凋亡？抑制细胞凋亡？其它未知？其它未知？肿瘤实验动物和细胞研究技术课件282生物因子诱发动物肿瘤模型生物因子诱发动物肿瘤模型(1)病毒诱发动物肿瘤模型病毒诱发动物肿瘤模型1908年年Ellermann和和Bang白血病鸡的无细胞滤液诱发鸡白血病获成功白血病鸡的无细胞滤液诱发鸡白血病获成功白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、肾癌白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、肾癌等等,与与病毒感染病毒感染有关有关1)DNA病毒病毒多瘤病毒多瘤病毒(PyV)疱疹病毒疱疹病毒(herpesvirussylvilagas)2)RNA病毒病毒急性急性RNA肿瘤病毒：肿瘤病毒：潜伏期较短潜伏期较短(34周周),大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、个别小鼠白血病病毒个别小鼠白血病病毒(如如Abl-MuLV)都属于本组都属于本组.该组病毒基因组结构常有缺陷该组病毒基因组结构常有缺陷,需辅助病毒协助才能复制需辅助病毒协助才能复制慢性慢性RNA肿瘤病毒：肿瘤病毒：潜伏期较长潜伏期较长(412月月)，大部分动物白血病病毒属于本组，大部分动物白血病病毒属于本组肿瘤实验动物和细胞研究技术课件29（2）其它生物因子诱发的动物肿瘤模型）其它生物因子诱发的动物肿瘤模型幽幽门螺杆菌感染门螺杆菌感染SPF级的级的BALB/c小鼠小鼠,22月以后月以后,38%的实验小鼠胃有淋巴滤泡增生的实验小鼠胃有淋巴滤泡增生,25%的小鼠胃出现形态类似人胃粘膜相关淋巴瘤的病变的小鼠胃出现形态类似人胃粘膜相关淋巴瘤的病变（B细胞淋巴瘤）细胞淋巴瘤）303.转基因动物肿瘤模型转基因动物肿瘤模型Stewart等获得等获得13个个MMTV-LTR/myc融合基因的转基因小鼠系融合基因的转基因小鼠系,其中两株其中两株c-myc启动子启动子为为MMTV-LTR启动子中启动子中糖皮质激素受体糖皮质激素受体反应元件反应元件所取代所取代,在在早期妊娠时即发生自发性乳腺癌早期妊娠时即发生自发性乳腺癌。Chisari等等HHBV的的S基因、病毒增强子和基因、病毒增强子和X基因基因转基因小鼠转基因小鼠,HBsAg的积聚的积聚引起内质网明显扩张引起内质网明显扩张,出现出现肝细胞毛玻璃样改变肝细胞毛玻璃样改变,100%小鼠发生小鼠发生肝脏肿瘤肝脏肿瘤X基因和病毒增强子的质粒基因和病毒增强子的质粒X基因转基因小鼠基因转基因小鼠,21月龄时月龄时,两个品系转基因小鼠两个品系转基因小鼠肝肿瘤肝肿瘤发生率分别为发生率分别为75%82.8%3.转基因动物肿瘤模型31三、移植性肿瘤三、移植性肿瘤可移植瘤株可移植瘤株：将一种动物肿瘤移植到同系同种或异种动物将一种动物肿瘤移植到同系同种或异种动物,经传经传代（代（20代）代）,组织形态特征逐渐稳定，即成为同组织形态特征逐渐稳定，即成为同种种或异种动物的可移植瘤株。或异种动物的可移植瘤株。移植瘤来源：移植瘤来源：动物自发性肿瘤或诱发性肿瘤动物自发性肿瘤或诱发性肿瘤我国用我国用615近交系小鼠的自发瘤近交系小鼠的自发瘤建立了：建立了：肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株用用诱发瘤诱发瘤建立了：建立了：小鼠宫颈癌（小鼠宫颈癌（U27及及U14）小鼠前胃癌（小鼠前胃癌（Fc）肝细胞癌等移植瘤株。肝细胞癌等移植瘤株。三、移植性肿瘤32近交系动物的应用近交系动物的应用：1962年年,苏格兰医师苏格兰医师Dssacson和和Cattanach发现（裸小鼠）发现（裸小鼠）*移植性人肿瘤裸鼠模型广泛应用移植性人肿瘤裸鼠模型广泛应用1、免疫缺陷动物、免疫缺陷动物(1)T细胞免疫功能缺陷动物细胞免疫功能缺陷动物裸小鼠裸小鼠：*先天性先天性胸腺发育不良胸腺发育不良(妊娠妊娠1415天可见少量胸腺天可见少量胸腺痕迹痕迹,并非全无胸腺并非全无胸腺)*胸腺依赖性胸腺依赖性T细胞细胞明显减少或缺乏明显减少或缺乏,*B细胞细胞仍然存在仍然存在,但功能低下但功能低下,免疫球蛋白以免疫球蛋白以IgM为主为主,*NK细胞细胞有较强活力。有较强活力。纯合子的裸大鼠纯合子的裸大鼠：基因符号：基因符号rnu。特征与裸小鼠相似。特征与裸小鼠相似无胸腺大鼠无胸腺大鼠 近交系动物的应用：33(2)B细胞免疫功能缺陷动物细胞免疫功能缺陷动物B细胞细胞功能衰退功能衰退,血浆血浆IgM、IgG低下低下,T细胞功能尚属正常细胞功能尚属正常CBA/N系小鼠系小鼠Arabian和和Quarter马马(3)联合免疫缺陷及其它免疫缺陷动物联合免疫缺陷及其它免疫缺陷动物CBA/NNU小鼠小鼠T、B淋巴细胞淋巴细胞功能均缺陷功能均缺陷;严重联合免疫缺陷小鼠（严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）：突变基因：突变基因scid位于第位于第16对染色体对染色体纯合子小鼠纯合子小鼠T、B淋巴细胞淋巴细胞极度低下极度低下,NK细胞和抗原传递细胞功能尚正常细胞和抗原传递细胞功能尚正常先天性联合免疫缺陷型小鼠：先天性联合免疫缺陷型小鼠：NK细胞、细胞、T、B细胞细胞功能联合缺陷裸小鼠：功能联合缺陷裸小鼠：缺点：缺点：*需在需在germ-free或或SPF条件下饲养，较苛刻条件下饲养，较苛刻*平均寿命仅平均寿命仅1430d。肿瘤实验动物和细胞研究技术课件342、人肿瘤免疫缺陷动物模型、人肿瘤免疫缺陷动物模型移植成功率移植成功率:取决于取决于移植方法移植方法：人癌组织直接移植的成功率平均为人癌组织直接移植的成功率平均为30%人癌细胞株为人癌细胞株为6070%肿瘤本身肿瘤本身：成功率最高成功率最高结肠癌、胃癌、黑色素瘤结肠癌、胃癌、黑色素瘤;其次其次胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、宫颈癌、食管癌等胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、宫颈癌、食管癌等;较低较低前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网织系统肿瘤和白血病前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网织系统肿瘤和白血病裸小鼠品系裸小鼠品系：人前列腺癌人前列腺癌BALB/c成功率仅成功率仅2%（3/150）NMRI裸小鼠可达裸小鼠可达35%（6/16）其它其它：接种部位接种部位宿主遗传背景宿主遗传背景年龄和建康状况等年龄和建康状况等2、人肿瘤免疫缺陷动物模型35(1)人组织裸鼠人组织裸鼠诱癌诱癌模型模型诱发鼻咽癌诱发鼻咽癌青少年慢性鼻咽增殖体炎青少年慢性鼻咽增殖体炎鼻咽活检鼻咽活检或或刮除组织刮除组织移植于移植于NC系裸小鼠系裸小鼠二亚硝基哌嗪二亚硝基哌嗪（NDP）为致癌剂）为致癌剂鼻咽上皮增生鼻咽上皮增生巴豆油巴豆油A因子因子（TPA）为促癌剂）为促癌剂乳头状增生、不典型增生乳头状增生、不典型增生原位癌原位癌诱发肺癌诱发肺癌裸鼠体内人类气管、支气管培养成功也为用人材料诱发肺癌的实验奠定了基础裸鼠体内人类气管、支气管培养成功也为用人材料诱发肺癌的实验奠定了基础肿瘤实验动物和细胞研究技术课件36(2)人肿瘤裸鼠移植模型人肿瘤裸鼠移植模型*1969年丹麦的年丹麦的Ryggard人结肠癌移植于裸小鼠人结肠癌移植于裸小鼠*100余种人类恶性肿瘤裸小鼠移植模型：余种人类恶性肿瘤裸小鼠移植模型：癌肿癌肿肝、肺、胃、结肠、食管、胰腺、乳腺、肝、肺、胃、结肠、食管、胰腺、乳腺、前列腺、鼻咽、前列腺、鼻咽、淋巴造血系统肿瘤淋巴造血系统肿瘤软组织肿瘤软组织肿瘤其它其它黑色素瘤、视网膜母细胞瘤黑色素瘤、视网膜母细胞瘤*1978年年Festing首次进行裸大鼠人癌异种移植首次进行裸大鼠人癌异种移植*1983年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型LTNR与与LTMR2两株两株(2)人肿瘤裸鼠移植模型37(3)人肿瘤转移裸鼠模型人肿瘤转移裸鼠模型我国始于我国始于80年代中期年代中期肺癌肺癌、肝癌肝癌转移及转移及胃癌肝转移胃癌肝转移和和淋巴道转移淋巴道转移等等1)人肺癌高转移裸小鼠模型人肺癌高转移裸小鼠模型吴秉铨等将吴秉铨等将6株人肺癌细胞系移植株人肺癌细胞系移植BALB/cA,nu/nu/JCLB裸小鼠裸小鼠其中一株肺巨细胞癌细胞系移植建成高转移模型其中一株肺巨细胞癌细胞系移植建成高转移模型,定名为定名为PG带瘤带瘤存活存活30天以上裸小鼠天以上裸小鼠中中淋巴结转移淋巴结转移(29/30)肺转移肺转移(26/30)传传17代后代后,瘤组织瘤组织再移植裸小鼠再移植裸小鼠(存活存活30天天)淋巴结转移淋巴结转移(12/12)肺转移肺转移(9/12)转移率达转移率达100%2)人肝癌高转移裸小鼠模型人肝癌高转移裸小鼠模型孙肪宪孙肪宪,汤钊猷等用汤钊猷等用30例人肝癌组织直接移植于例人肝癌组织直接移植于46周龄的周龄的BALB/cA,nu/nu裸小鼠裸小鼠,移植移植部位部位在小鼠在小鼠肝实质肝实质内或内或肝包膜下肝包膜下其中一例其中一例39岁男性岁男性(巨块型肝细胞癌伴肝内播散和淋巴结转移巨块型肝细胞癌伴肝内播散和淋巴结转移)其移植瘤育成其移植瘤育成人肝癌高转移裸鼠模型人肝癌高转移裸鼠模型,定名为定名为LCI-D-20鼠间连续传代鼠间连续传代(16代代)成功率成功率100%,间期为间期为20天天肺、淋巴结及肝内转移肺、淋巴结及肝内转移(72/72),腹腔种植转移腹腔种植转移(50/72),转移率达转移率达100%(3)人肿瘤转移裸鼠模型383)其它其它胃癌肝转移胃癌肝转移杨善民等用杨善民等用人低分化人低分化胃粘液腺癌胃粘液腺癌细胞系细胞系MGC80-3在在BALB/c裸小鼠建成移植瘤后裸小鼠建成移植瘤后再用再用移植瘤单细胞悬液移植瘤单细胞悬液接种于裸小鼠接种于裸小鼠脾包膜脾包膜下下肝内胃癌转移肝内胃癌转移率达率达60%用用CCl4处理裸小鼠处理裸小鼠,肝内胃癌转移率可达肝内胃癌转移率可达100%,其它脏器则未见转移其它脏器则未见转移淋巴结转移淋巴结转移李斯德等将人李斯德等将人小细胞癌小细胞癌NCI-H128细胞系接种裸小鼠细胞系接种裸小鼠腹股沟、腋窝和颌下淋巴结出现转移腹股沟、腋窝和颌下淋巴结出现转移淋巴结转移率淋巴结转移率达达100%393应用应用肿瘤的生物学特性肿瘤的生物学特性浸润转移浸润转移临床治疗临床治疗基因治疗基因治疗导向治疗导向治疗药敏测定法药敏测定法（SRC）实验可评价率为实验可评价率为93%新抗癌药物开发筛选新抗癌药物开发筛选肿瘤实验动物和细胞研究技术课件40肿瘤实验动物和细胞研究技术课件41MolecularOncologySomeMolecularMethodologyinTumorResearch 42一、基因变异的诊断一、基因变异的诊断基因表达异常基因表达异常肿瘤肿瘤基因突变：转位，重排基因突变：转位，重排Southernblot，PCR点突变点突变DGGE硷基缺失硷基缺失CDGESSCP基因丢失：基因丢失：SSCPMicrosatellitesanalysisDGGE=DenaturingGradientGelElectrophoresisCDGE=ConstantDenaturingGelElectrophoresisSSCP=SingleStrandConformationPolymorphism一、基因变异的诊断DGGE=Denaturing Gradi43PCR-SSCP:year1989,OritaMGenePCRHomozygoteHetrozygoteHeating(50)for10min+formamideNondenaturingPAGE(300V,5h,silverstaining)PCR-SSCP:year 1989,Orita M 44PCR-SSCP灵敏度高，一个硷基的改变可在电泳速度上反映出来灵敏度高，一个硷基的改变可在电泳速度上反映出来但但DNA片段的大小与灵敏度有关片段的大小与灵敏度有关100-300bp突变检出率突变检出率97%300-500bp检出率检出率67%以以200bp左右为佳左右为佳PCR-SSCP45PCR-SSCP的主要步骤：的主要步骤：1.DNA模板制备（从石蜡组织中提取）模板制备（从石蜡组织中提取）脱蜡：少许石蜡组织放入脱蜡：少许石蜡组织放入Eppendorf管管+1ml二甲苯二甲苯65，5分钟分钟离心，离心，5分钟，弃上清分钟，弃上清重复一次重复一次1mlEtOH,振摇后离心振摇后离心5分钟，弃上清分钟，弃上清1mlEtOH(70%),振摇后离心振摇后离心5分钟，弃上清分钟，弃上清真空离心真空离心5分钟，使干燥分钟，使干燥PCR-SSCP的主要步骤：46消化：消化：180m mlpH8.0TE+20m mlbuffer+10m mlproteinaseK(20mg/ml)55,3-5h加加50m mlChelex-100(25%水溶液水溶液)55,1h100,10minspin,3min提纯提纯DNA：上清上清+200m mlphenol,剧烈振摇剧烈振摇离心，离心，3min上清上清+phenol/choroform,振摇振摇离心，离心，3min水相水相+25m mlNaOAc3M,1m mlglycogen,750m mlEtOH(pure)-20,overnightspin15min,at4pelletswashedwithEtOH70%spin,pelletsresuspendedin100-200m mlTE,pH8消化：180ml pH8.0 TE+20ml buff472.RunPCR注意：注意：PCR产物最好在产物最好在200bp左右左右琼脂糖电泳条带清晰琼脂糖电泳条带清晰3.PCR产物产物run非变性非变性PAGE制胶（制胶（36%MDE胶，胶，or6%polyacrylamide）稀释样品（稀释样品（1m mlPCR产物产物+4m ml去离子水）去离子水）alkalinedenature,(+1m mlNaOH,4m ml去离子水）去离子水）50水浴水浴10min后后+stopsolution2m ml)12m ml/well20恒温，恒温，300伏恒压下电泳伏恒压下电泳5hAlkalinestocksolution:0.5MNaOH+10mMEDTAStopsolution:1mlformamide(99%pure)+20m ml0.5MEDTA(pH8.0)+50m ml1%bromophenol+25m ml1%xylenecyanol2.Run PCRAlkaline stock solut484.胶染色胶染色PAGE胶作记号（左下角切去小胶作记号（左下角切去小）入）入10%醋酸固定醋酸固定20min胶用去离子水洗三次，每次胶用去离子水洗三次，每次2min胶入硝酸银溶液反应胶入硝酸银溶液反应30min胶用去离子水洗一次，约半分钟胶用去离子水洗一次，约半分钟胶入还原液还原显色（时间依需要而定）胶入还原液还原显色（时间依需要而定）胶入胶入10%醋酸终止反应，约醋酸终止反应，约5分钟分钟胶在胶在80下真空干燥下真空干燥2小时小时4.胶染色49P53基因基因exon5突变（突变（PCR-SSCP）NTLNTLP53基因exon5突变（PCR-SSCP）50PCR-SSCP的应用：的应用：1.经经PCR-SSCP确定确定DNA片段有突变，该片段经测序可确片段有突变，该片段经测序可确定突变的形式和定位，可避免因测序或定突变的形式和定位，可避免因测序或PCR反应出现的碱反应出现的碱基配对差错造成的假阳性基配对差错造成的假阳性2.在无非特异性电泳条带情况下，可以初步确定有无基因的在无非特异性电泳条带情况下，可以初步确定有无基因的杂合性丢失（杂合性丢失（LossofHetrozygote,LOH)PCR-SSCP的应用：51二、检测基因的丢失和扩增二、检测基因的丢失和扩增比较基因组杂交比较基因组杂交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合优点：优点：1.新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可进行进行CGH研究研究2.被测样品只需数被测样品只需数m mg甚至不到甚至不到1m mg的的DNA二、检测基因的丢失和扩增52R/G低度扩增高度扩增丢失不同荧光（红不同荧光（红/绿）绿）标记基因组标记基因组DNA片段片段（500-2000bp）人人Cot-1DNA对正常人染色体进行原位分子杂交被测DNA参照DNA退火及预杂交退火及预杂交R/G 低度扩增 高度扩增 丢53石蜡包埋材料提取的石蜡包埋材料提取的DNA质量较差，可用变性引物对所提质量较差，可用变性引物对所提取的基因组取的基因组DNA进行整体扩增进行整体扩增DegenerationOligonucleotidePrimedPCR(DOP-PCR)Firststep:Primer:5CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3(DOP)酶：消除酶：消除35外切酶活性的外切酶活性的T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶条件：宽松条件（条件：宽松条件（Lowstringency)30/5min37/2min96/2minfor5cycles石蜡包埋材料提取的DNA质量较差，可用变性引物对所提取的基因54Secondstep:Template:theproductofthefirststeprunningPrimer:DOP酶：酶：Taq聚合酶聚合酶条件：条件：95/5min后进入循环后进入循环94/1min56/1min72/2minfor35cycles72/5min用用DOP-PCR只需石蜡包埋材料只需石蜡包埋材料DNA50pg(相当于相当于5-10个细个细胞）即可进行胞）即可进行CGH分析，而常规方法需至少分析，而常规方法需至少200个细胞，两个细胞，两者者CGH的图形（的图形（profile)是相同的是相同的切片染色切片染色不能用不能用HE，而用甲基绿，而用甲基绿Second step:55CGH的应用：的应用：1.为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤细胞染色体某一位置上肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增加，序列拷贝数增加，往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增扩增肿瘤细胞染色体某一位置上肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减少序列拷贝数减少或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑癌或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑癌基因丢失基因丢失CGH发现发现MYCN，MET与胃癌相关与胃癌相关CGH的应用：562.区分良恶性病变，临床上估计预后区分良恶性病变，临床上估计预后16例前列腺癌例前列腺癌CGH显示染色体异常占显示染色体异常占81%5例良性前列腺增生全部阴性例良性前列腺增生全部阴性67肝细胞癌肝细胞癌CGH显示显示:1q,8q,20q,17q4q,8p,13q,16q12例癌周肝硬化组织：阴性例癌周肝硬化组织：阴性53例淋巴结阴性乳腺癌：例淋巴结阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，预后差异常，预后差区分良恶性病变，临床上估计预后57三、检测细胞基因表达谱的差异三、检测细胞基因表达谱的差异消减杂交消减杂交抑制消减杂交抑制消减杂交cDNA代表性差异分析代表性差异分析SAGEDNAmicroarraymRNA差异显示（差异显示（mRNAdifferentialdisplay)RT-PCR+测序电泳，经典，可重复性测序电泳，经典，可重复性可展示可展示10000-15000种种mRNA的表达的表达三、检测细胞基因表达谱的差异58实质是实质是RT-PCR引物设计很有特点引物设计很有特点锚定引物：锚定引物：12个个T可结合可结合mRNA的的polyA上上T12MNM=A，G，CN=A，G，C，T据排列组合，一种据排列组合，一种T12MN可与可与1/12的的mRNA结合结合随机引物：可在与随机引物：可在与polyA末端不同距离的多个位置上结合末端不同距离的多个位置上结合差异显示的产物是长度不一的差异显示的产物是长度不一的cDNA片段的混合物片段的混合物实质是RT-PCR59差异显示的技术路线差异显示的技术路线提取高质量的总提取高质量的总RNA，DNA酶处理酶处理用锚定引物用锚定引物T12MN进行逆转录进行逆转录用相同的用相同的T12MN引物及随机引物进行引物及随机引物进行PCR扩增扩增（同时用同位素对（同时用同位素对PCR产物进行标记）产物进行标记）测序胶电泳分离测序胶电泳分离PCR产物产物切下差异表达的条带，用相同引物进行二次切下差异表达的条带，用相同引物进行二次PCR扩增扩增PCR产物制成探针产物制成探针Northernblot验证验证差异显示的技术路线60*相对较敏感：相对较敏感：200个细胞的总个细胞的总RNA足够进行差异分析足够进行差异分析*低丰度低丰度mRNA的显示不理想的显示不理想对策：对策：（1）先通过消减杂交使差异片刻富集）先通过消减杂交使差异片刻富集（2）二轮）二轮PCR扩增（巢式扩增（巢式PCR），第二轮的引物），第二轮的引物在在3端多端多2个碱基，使与之匹配的模板减少，个碱基，使与之匹配的模板减少，模板间竞争减少，有利于低丰度模板间竞争减少，有利于低丰度mRNA扩增扩增*相对较敏感：200个细胞的总RNA足够进行差异分析61*降低假阳性：降低假阳性：使用不同浓度的模板进行平行反应，或重复实验以排除使用不同浓度的模板进行平行反应，或重复实验以排除由于模板质量或数量引起的假阳性；由于模板质量或数量引起的假阳性；严格设定对照，如用缺省逆转录酶或严格设定对照，如用缺省逆转录酶或RNA酶降解酶降解RNA作作为阴性对照来排除为阴性对照来排除DNA污染；污染；进行差异片段的初筛，把所有的差异片段点在尼龙膜上，进行差异片段的初筛，把所有的差异片段点在尼龙膜上，然后将研究对象然后将研究对象RNA逆转录，掺入同位素制成探针，与此逆转录，掺入同位素制成探针，与此尼龙膜杂交（即反向点杂交），只有那些尼龙膜杂交（即反向点杂交），只有那些“此有彼无此有彼无”的的片段才进入下一阶段的研究。片段才进入下一阶段的研究。*降低假阳性：62差异表达分析的应用差异表达分析的应用*肿瘤与瘤旁组织或正常组织的基因表达差异表达分析肿瘤与瘤旁组织或正常组织的基因表达差异表达分析*不同生物学特性的肿瘤（高、低转移表型）基因表达不同生物学特性的肿瘤（高、低转移表型）基因表达差异分析差异分析*细胞经某种细胞因子处理后进行基因表达差异分析，细胞经某种细胞因子处理后进行基因表达差异分析，研究该细胞因子作用的下游分子研究该细胞因子作用的下游分子差异表达分析的应用63四、蛋白组学及生物芯片四、蛋白组学及生物芯片蛋白组学（蛋白组学（proteomics)Y-轴等电电泳或固态轴等电电泳或固态pH2-Dgelelectrophoresis梯度电泳梯度电泳X-轴轴SDS-PAGE银染或荧光染色，找出差异点，挖胶银染或荧光染色，找出差异点，挖胶质谱分析，微量氨基酸测序质谱分析，微量氨基酸测序BLAST确定是已知还是未知的基因，克隆该基因确定是已知还是未知的基因，克隆该基因四、蛋白组学及生物芯片64生物芯片（生物芯片（biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段（寡核苷酸、片段（寡核苷酸、cDNA、基因组、基因组DNA、RNA）或多）或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物（玻肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量改变。靶分子的数量改变。生物芯片（biochip)65生物芯片：生物芯片：基因芯片基因芯片蛋白质芯片蛋白质芯片细胞芯片细胞芯片组织芯片组织芯片基因芯片基因芯片(Affymetrix专利）专利）寡核苷酸芯片，寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因组芯片芯片，基因组芯片DNAmicroarray:阵密度很高的玻片基质或胶膜基质阵密度很高的玻片基质或胶膜基质的的DNA微阵列微阵列DNAmacroarray:阵密度较低的尼龙膜阵密度较低的尼龙膜DNA微阵列微阵列生物芯片：66五、五、肿瘤基因甲基化水平的检测肿瘤基因甲基化水平的检测MethylationofDNA:甲基化程度与该基因表达呈负相关甲基化程度与该基因表达呈负相关甲基化可通过直接或间接作用影响基因表达甲基化可通过直接或间接作用影响基因表达直接作用：基因构型改变，影响转录因子与直接作用：基因构型改变，影响转录因子与DNA特定特定部位结合；部位结合；间接作用：调控序列甲基化，可与间接作用：调控序列甲基化，可与methylGC-bindingprotein结合，阻止转录因子与基因形成转结合，阻止转录因子与基因形成转录复合物录复合物五、肿瘤基因甲基化水平的检测67甲基化检测方法甲基化检测方法HpaII+MspI酶切法HpaII-CCGG-MspI-CCmGG-通过电泳分析酶切片段即可知甲基化状态甲基化检测方法Hpa II+Msp I 酶切法685-氮胞苷掺入法：氮胞苷掺入法：5-氮胞苷胞嘧啶第五位氮胞苷胞嘧啶第五位C原子被原子被N原子替代，胞嘧啶无法甲原子替代，胞嘧啶无法甲基化基化基因低甲基化（可传代）基因低甲基化（可传代）经经5-氮胞苷处理的细胞，失活的基因可被重新激活氮胞苷处理的细胞，失活的基因可被重新激活 5-氮胞苷掺入法：69Xiong和和Laird用用“COBRA”，即，即“结合应用酸结合应用酸式亚硫酸盐的内切酶分析式亚硫酸盐的内切酶分析”（combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA）来检测启动子中含）来检测启动子中含有有CpG的基因的甲基化水平。的基因的甲基化水平。COBRA原理：原理：酸式亚硫酸钠酸式亚硫酸钠（CT）或）或（mCC）与与CpG甲基化甲基化有关的内切酶位点的序列发生转变有关的内切酶位点的序列发生转变 Xiong和 Laird用“COBRA”，即“结合应用酸70CGCGmCGmCGCGCGCGCGTGTGCGCGTGTGTGTGBisulfiteBstU1CGCGmCGmCGCGCGCGCGTGTGCGCGTGTG71注意：注意：也有例外也有例外有些基因虽有甲基化但仍可转录，相反有些基因有些基因虽有甲基化但仍可转录，相反有些基因虽处于低甲基化状态，但没有转录活性。虽处于低甲基化状态，但没有转录活性。注意：72Thank you for attending73SuggestedtopicsbefocusedoninthediscussioncourseWhatwillyouaddtothelistoftheapproachesandtechniquesthatIhavepresented,ifyouhave,pleasegivesomedetails.WhatisyourPh.D.researchproposal?Whatkindsofmethodsandtechniquesyouintendtouseinyourresearch?Whataretheproblemsyoumayencounterandhowtosolvethem?HowmuchdoyouknowaboutRNAitechnique?Willyougiveussomepoints.Suggested topics be focused on74Seeyounextweek!See you next week!75RNAitechniqueTwotypesof21ntRNAstriggerposttranscriptionalgenesilencingincells:smallinterferingRNAs(siRNA)microRNAs(miRNAs)DicerDouble-strandedRNAprecursorsiRNAormiRNADic