生物化学核酸化学医学知识课件

资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1869 1869年Miescher博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物,并在所有细胞的核里都找到了此物质,故命名核质核质(Nuclein)。一、核酸研究简史一、核酸研究简史 1879 1879年Kossel经过10年的努力,搞清楚核质中有四种不同的组成部分:A,T,C和G。1889 1889年Altman建议将核质改名为“核酸核酸”,并且已经认识到“核质”乃“核酸”与蛋白质的复合体。1869年Miescher博士论文工作中测定淋巴细胞1资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1909 1909年Levene发现酵母的核酸含有核糖。1930 1930年Levene发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖即脱氧核糖,得出了一个错误概念:植物核酸含核糖,动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚RNA和DNA的区别。Levene还提出了核酸的“磷酸-核糖(碱基)-磷酸”的骨架结构,解决了DNA分子的线性问题,还在1935年提出“四核苷酸”学说,认为这四种核苷酸的聚合体是构成核酸的基本单位。1909年Levene发现酵母的核酸含有核糖。2资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1944 1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，证明DNA是遗传物质。1952 1952年Hershey&Chase的噬菌体感染实验进一步证明DNA是遗传物质。1944年Avery重做1928年Griffith的3资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1950 1950年Chargaff,E和Hotchkiss,R.D.采用纸层析法仔细分析了DNA的组成成分,得知A=T,G=C,A+G=C+T 1953 1953年Watson,Crick根据DNA的X射线图谱的研究结果,提出了DNA的双螺旋模型(Double helix)。几星期后提出了半保留式复制模型。19571957年Meselson Stahl用密度梯度超离心法,证实半保留复制假说。1958 1958年Kornberg得到高纯度的DNA polymerase,这种酶需要一个模板DNA。1960 1960年Cairns拍摄了复制中的细菌DNA的电镜照片。1970 1970年发现第一个DNA限制性内切酶。1972 1972年建立DNA重组技术。1978 1978年建立DNA的双脱氧测序法。1990 1990年开始实施人类基因组计划。2003 2003年人类基因组计划宣告完成测序任务。1950年Chargaff,E和Hotchkiss,4资料仅供参考,不当之处，请联系改正。二、核酸的生物功能(一)DNA是主要的遗传物质 1928年Griffith的细菌转化实验二、核酸的生物功能 1928年Griffith的细菌转化实验5资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1944 1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，证明DNA是遗传物质。但人们对此持怀疑态度，理由是：（1）因认为蛋白相对分子质量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA相对分子质量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。1944年Avery重做1928年Griffith的6资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1952年Hershey and Chase的实验进一步证明DNA是遗传物质1952年Hershey and Chase的实验进一步证明7资料仅供参考,不当之处，请联系改正。物种基因组基因数目物种基因组基因数目MS2噬菌体3.6kb4裂殖非洲粟酒酵20Mbp6,000Q噬菌体4.2kb3盘基网柄菌47Mbp7,000SV405.2kbp8秀丽隐杆线虫100Mbp19,100X1745.4kbp9拟南芥70Mbp25,500TMV6.4kb4水稻(籼稻)74.8Mbp46,02255,615HIV9.3kb10黑腹果蝇165Mbp13,000腺病毒235.9kbp11河豚鱼400Mbp70,000噬菌体48.5kbp50担尼鱼1.9Gbp70,000T4噬菌体169kbp300非洲爪蟾2.9Gbp70,000大肠杆菌4.64Mbp4,288小鼠3.3Gbp70,000酿酒酵母13.5Mbp5,885人3.3Gbp31,000(二)DNA和基因组1.DNA和基因组 DNA分子中最小的功能单位称作基因，为RNA或蛋白质编码的基因称结构基因，只有调节功能，不转录生成RNA的称调节基因，某生物体所含的全部基因称该生物体的基因组。物种基因组基因数目物种基因组基因数目MS2噬菌体 3.68资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2.原核生物基因组的特点 通常只有一个DNA分子；无重复序列；功能相关的基因常构成一个转录单位；有重叠基因。2.原核生物基因组的特点9资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3.真核生物基因组的特点 （1）有重复序列，中度重复序列可重复几十次到几千次，如rRNA基因、tRNA基因和某些蛋白质的基因；高度重复序列可重复数百万次，如卫星DNA和微卫星DNA。（2）有断裂基因，不少基因含有称作内含子的非编码区，编码区称作外显子，有些基因可含有几十个内含子。鸡卵清蛋白的基因3.真核生物基因组的特点鸡卵清蛋白的基因10资料仅供参考,不当之处，请联系改正。人类基因组序列的类型长分散元件（长分散元件（6-8kb，约，约85万个）万个）短分散元件（短分散元件（0.1-0.3kb，约，约150万万个，其中个，其中Alu元件元件超过超过100万个）万个）简单序简单序列重复列重复大片段重复大片段重复人类基因组序列的类型长分散元件（6-8kb，约85万个）短分11资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件12资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(二)RNA功能的多样性1.某些病毒的遗传物质;2.控制蛋白质的合成;3.遗传信息的加工;4.基因表达和细胞功能的调控;5.催化功能;6.在细胞分化和个体发育中发挥重要作用;7.在生命起源中可能有重要作用。基本要求1.熟悉核酸的发现和研究简史。2.掌握核酸的种类、分布和生物功能。（重点）(二)RNA功能的多样性基本要求13资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第13章 核酸的结构 第13章 核酸的结构 14资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一、核苷酸 核酸可以水解成核苷酸，核苷酸可以水解成磷酸和核苷，核苷可以水解成戊糖和碱基，碱基可以分成多种类型。(一)碱基 一、核苷酸15资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件16资料仅供参考,不当之处，请联系改正。与氨基酸一样，碱基在细胞中也受到各种各样的修饰，其产物常常扮演信号传导信使分子、营养因子、辅酶等角色，并对核酸结构的稳定性起着重要作用.与氨基酸一样，碱基在细胞中也受到各种各样的修17资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件18资料仅供参考,不当之处，请联系改正。内酰胺内酰胺内酰亚胺内酰亚胺内酰胺内酰亚胺19资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(二)核苷(二)核苷 20资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件21资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(三)核苷酸(三)核苷酸22资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件23资料仅供参考,不当之处，请联系改正。二、核酸的共价结构 (一)核酸中核苷酸的连接方式 二、核酸的共价结构 24资料仅供参考,不当之处，请联系改正。核酸的一级结构：核酸的一级结构：碱基的排列顺序碱基的排列顺序碱基的排列顺序碱基的排列顺序DNADNA 5-ATGCATGC35-ATGCATGC3 3 3-TACGTACG3TACGTACG3RNARNA 5-AUGCAUGC3 5-AUGCAUGC3核酸的二级结构：核酸的二级结构：形成双螺旋和单链环形成双螺旋和单链环形成双螺旋和单链环形成双螺旋和单链环核酸的三级结构：核酸的三级结构：空间构象空间构象空间构象空间构象核酸的结构层次核酸的结构层次核酸的一级结构：核酸的结构层次25资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(二)DNA的一级结构(三)RNA的一级结构ACTG(二)DNA的一级结构(三)RNA的一级结构ACTG26资料仅供参考,不当之处，请联系改正。三、DNA的高级结构(一)DNA碱基组成的Chargaff规则，见表13-5(二)DNA的二级结构 依据：Chargaff规则；X衍射图；碱基不可滴定。三、DNA的高级结构 27资料仅供参考,不当之处，请联系改正。要点（1）两条链反向平行，绕同一轴相互缠绕成右手螺旋；（2）磷酸和戊糖交替处于螺旋外围，碱基处于内部，形成碱基对；(3)双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm；（4）一条链的核苷酸序列可以决定另一条互补链的核苷酸序列。*要点（1）两条链反向平行，绕同一轴相互缠绕成右手螺旋28资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件29资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Watson-CrickWatson-Crick的的的的DNADNA双螺旋双螺旋双螺旋双螺旋Watson-Crick的DNA双螺旋30资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件31资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件32资料仅供参考,不当之处，请联系改正。双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直。稳定双螺旋结构的作用力为氢键、碱基堆积力（即疏水作用）和环境中正离子的作用。双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直33资料仅供参考,不当之处，请联系改正。碱基的配对使得双碱基的配对使得双螺旋螺旋DNADNA分子在复制时分子在复制时以半保留的形式进行。以半保留的形式进行。碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式34资料仅供参考,不当之处，请联系改正。5.DNA双螺旋分子结构的不同类型：主要有三种，分别命名为A、B和C型。其中B型与Watson-Crick提出的模型一致，A和C型在低相对湿度的条件下形成，它们的螺距都比B型要短，A型DNA的结构与DNA和RNA的杂合链相似。Z型DNA首先在富含GC的DNA短片段中发现，后用抗体证明天然DNA中也有，它是一种左手螺旋，在细胞中可能与基因表达的调控有关。螺距 残基数 碱基倾斜 A型(75%,Na)2.8 11 20B型(92%,Na)3.4 10 0C型(66%,Li)3.1 9.3 6D/R hybrid 2.8 11 20Z型 4.6 12 95.DNA双螺旋分子结构的不同类型：35资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Z-DNAZ-DNA的结构特点：的结构特点：（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。（2）左旋。（3）G的糖苷键呈顺式(Syn)，使G残基位于分子表面。（4）大沟消失，小沟窄而深。（5）每个螺旋有12bp。Z ZDNADNA存在的条件：存在的条件：（1）高盐：NaCl2Mol/L,MgCl20.7 Mol/L （2）Pu,Py相间排列。（3）在活细胞中如果有m5C,则无需嘌呤-嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下可产生Z型将结构。（4）在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺等阳离子，可和磷酸基因结合，使B-DNA转变成Z-DNA。（5）某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电荷，可使DNA周围形成局部的高盐浓度微环境。（6）负超螺旋的存在。Z-DNA的结构特点：36资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Z-DNAZ-DNA的生物学意义的生物学意义 (1)可能提供某些调节蛋白的识别位点。啮齿类动物病毒的复制起始部位有d（GC）有交替顺序的存在；在SV40的增强子中有三段8bp的Z-DNA存在。(2)原生动物纤毛虫，有大、小两个核，大核大核有转录活性，小核小核与繁殖有关。Z-DNA抗体以萤光标记后，显示仅和大核DNA结合，而不和小核的DNA结合，说明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和转录调控有关。Z-DNA的生物学意义37资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件38资料仅供参考,不当之处，请联系改正。*6.DNA分子的三螺旋结构和单链结构：在DNA分子中，镜像重复序列可以回折，形成三螺旋结构。在某些病毒中，DNA分子以单链形式存在。*6.DNA分子的三螺旋结构和单链结构：39资料仅供参考,不当之处，请联系改正。正螺旋和负螺旋正螺旋和负螺旋正螺旋和负螺旋正螺旋和负螺旋负超螺旋负超螺旋负超螺旋负超螺旋 右旋右旋右旋右旋正超螺旋正超螺旋正超螺旋正超螺旋 左旋左旋左旋左旋 DNA双螺旋为右手螺旋。细胞中的环状DNA一般呈负超螺旋，即右手螺旋不足导致部分碱基不能形成配对，分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右手螺旋的不足，在数学上呈1：1，即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解开过度的螺旋。(三)DNA的三级结构 正螺旋和负螺旋负超螺旋正超螺旋 DNA双螺旋为右手螺旋40资料仅供参考,不当之处，请联系改正。WhiteWhite方程：方程：L=T+WL=T+W L L（Linking nnmber）：连环数或称拓扑环绕数，指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数。其特点是：(1)L是整数；(2)在 cccDNA中任何拓扑学状态中其值保持不变；（3）右手螺旋的L取正值。W W（Writhing number）：扭曲数，即超螺旋数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；(3)右手超螺旋的W取负值。T T（Twisting number）：缠绕数，即双螺旋的圈数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；(3)右手螺旋时T为正值。超螺旋的量度可以用超螺旋密度来表示：=（L-T）/T 在天然DNA中，约为-0.05，大约20个双螺旋有1个超螺旋。White方程：L=T+W41资料仅供参考,不当之处，请联系改正。促旋酶（拓扑异构酶）的作用方式促旋酶（拓扑异构酶）的作用方式42资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件43资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(四)DNA与蛋白质复合物的结构(四)DNA与蛋白质复合物的结构 44资料仅供参考,不当之处，请联系改正。平均每200bp的DNA绕核小体左旋1.75转，因此真核生物的DNA分子为正超螺旋核小体的电镜照片核小体的电镜照片平均每200bp的DNA绕核小体左旋1.75转，因此真核生物45资料仅供参考,不当之处，请联系改正。组蛋白八聚体：（a)前面观；(b)顶面观；（c）沿着染色体纤维长轴的透视图；(d)DNA与组蛋白空间结构的模式图。（a)核小体的结构图，左图为沿核小体轴观察的图示；右图为沿核小体轴垂直方向观察的图示；(b)一半核小体的结构图。组蛋白八聚体：（a)前面观；(b)顶面观；（c）沿着染色体纤46资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件47资料仅供参考,不当之处，请联系改正。四、RNA的高级结构(一)tRNA的高级结构 四、RNA的高级结构 48资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件49资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件50资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(二)rRNA的高级结构 16S rRNA(二)rRNA的高级结构 16S rRNA51资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件52资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(三)其他RNA的高级结构(三)其他RNA的高级结构 53资料仅供参考,不当之处，请联系改正。基本要求1.掌握核苷酸的结构特点和重要核苷酸的生物学功用。（重点）2.掌握核酸的共价结构。（重点）3.掌握DNA的二级结构，熟悉DNA的三级结构。（重点）4.掌握RNA的二级结构，熟悉RNA的三级结构。（重点）作业题作业题第500页第3题；第500页第4题；第500页第5题；第500页第6题；第500页第7题；第500页第10题；第500页第12题；第500页第13题；第500页第14题。基本要求作业题54资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第14章 核酸的物理化学性质 第14章 55资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一、核酸的水解(一)酸水解 糖苷键比磷酸酯键更易水解，特别是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键很容易水解。(二)碱水解 通常用于RNA水解，DNA的碱水解比较困难。一、核酸的水解56资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件57资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(三)酶水解(三)酶水解58资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件59资料仅供参考,不当之处，请联系改正。双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断,又可以再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。这就是分子克隆和DNA重组技术的基础。DNADNA与与限制性内切酶限制性内切酶 双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性60资料仅供参考,不当之处，请联系改正。大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4 6 个碱基的palindrome 顺序。它们在微生物细胞内发挥iu的是防御外来DNA入侵的国防军的作用。大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4 6 个碱基的pali61资料仅供参考,不当之处，请联系改正。碱基碱基adenine 4.15,9.8cytosine 4.5,12.2guanine 3.2,9.6thymine 9.9,13核苷核苷adenosine 3.5,12.5 deoxyadenosine 3.8cytidine 4.15,12.5 deoxycytidine 4.3,13guanosine 1.6,9.2 deoxyguanosine 2.5uridine 9.2,12.5 deoxythymidine 9.8,13核苷酸核苷酸AMP 3.7,6.1 :dAMP 4.4ADP 3.9,6.3 :-CMP 4.5,6.3 :dCMP 4.6GMP 2.4,6.1,9.4 :dGMP 2.9,9.7UMP 6.4,9.5 :dTMP 10.0二、核酸的酸碱性质 碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式。碱基中的H原子一般不移动，因此很少有亚氨基团。在中性pH条件下，参与氢键的-NH2基均不带电荷，这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果，否则双螺旋结构不会稳定。碱基、核碱基、核苷、核苷苷、核苷酸的酸的pK值值碱基二、核酸的酸碱性质碱基、核苷、核苷酸的pK值62资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件63资料仅供参考,不当之处，请联系改正。三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 g SS DNA 37 g RNA 40 g三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 64资料仅供参考,不当之处，请联系改正。DNADNADNADNA分子的变性分子的变性分子的变性分子的变性四、核酸的变性，复性及杂交变性和复性的含义DNA分子的变性四、核酸的变性，复性及杂交变性和复性的含义65资料仅供参考,不当之处，请联系改正。DNADNADNADNA的变性的变性的变性的变性在紫外吸在紫外吸在紫外吸在紫外吸收上的变收上的变收上的变收上的变化化化化Tm的定义影响Tm的因素 1.DNA 的均一性越高,Tm的温度范围越小。2.G-C含量越高,Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式：Tm=69.3+0.41(G+C)%，或GC%=（Tm-69.3）2.44 3.介质的离子强度较高时,Tm的值较大。4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 降低Tm的值。5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。DNA的变性在紫外吸收上的变化Tm的定义影响Tm的因素 66资料仅供参考,不当之处，请联系改正。SSC溶液，常用于溶液，常用于DNA的溶解。的溶解。SSC溶液，常用于DNA的溶解。67资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件68资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(二)复性 T1/2 C constDNADNA浓度与复性时间的关系浓度与复性时间的关系影响复性速度的因素1.DNA的片段越大,复性的速度越慢;2.DNA的浓度越高,复性的速度越快;3.DNA的重复序列越多,复性的速度越快;4.溶液的pH过高或过低,复性的速度均会降低;5.适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。(二)复性 T1/2 C constDNA浓度与复69资料仅供参考,不当之处，请联系改正。DNADNADNADNA复性与复性与复性与复性与CotCotCotCot分析分析分析分析当 C/C0=1/2时，k=1/C0t1/2DNA复性与Cot分析当 C/C0=1/2时，k=70资料仅供参考,不当之处，请联系改正。哺乳动物的DNA 一般均呈右图的曲线，这是因为它们的基因组DNA 中插入了大量的重复序列，如人的DNA中就插入了长度为350bp的Alu序列达50万份拷贝之多。人人DNADNA的的CotCot曲线曲线 哺乳动物的DNA 一般均呈右图的曲线，这是因71资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(三三)DNADNA的分子杂交技术的分子杂交技术 分子杂交分子杂交是将不同来源的核酸分子分别变性，再混合后复性，使不同来源的单链的互补区形成双链的技术。通常将其中的一方用放射性同位素放射性同位素或特定的基团(如生物素生物素,地高辛地高辛)标记，称作探针，探针，现时的探针多为人工合成的短片段。若将杂交的另一方直接点到膜上进行杂交，称作点杂交。点杂交。对组织切片或菌落进行处理后再杂交称作原位杂交。原位杂交。分子杂交的广泛应用是将样品DNADNA用限制性内切酶切割限制性内切酶切割成一定大小的片段，进行变性凝胶电泳，变性凝胶电泳，将凝胶电泳形成的DNADNA区带转移到膜上转移到膜上再进行杂交，这种技术称作SouthernSouthern杂交。杂交。将RNARNA凝胶电泳形成的区带转移到膜上再进行杂交称作NorthernNorthern杂交。杂交。将蛋白质蛋白质凝胶电泳形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作WesternWestern印印迹技术。迹技术。将蛋白质等点聚焦蛋白质等点聚焦形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作EasternEastern印迹技术。印迹技术。分子杂交技术在现代生命科学中的应用十分广泛。将人工合成的探针探针用点样机点到玻璃或塑料基片上形成高密度的阵列，阵列，将样品样品DNA用限制性内切酶切割成一定大小的片段，变性后用荧光基团标记，荧光基团标记，再进行分子杂分子杂交操作，交操作，这就是DNADNA芯片技术芯片技术的基本原理。用类似的技术可以制成蛋白质芯片。蛋白质芯片。按指令在基片上合成探针，可以制成密度特别高的芯片。生物芯片技术有非常广阔的应用前景。(三)DNA的分子杂交技术 分子杂交是将不同来源的72资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件73资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件74资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件75资料仅供参考,不当之处，请联系改正。基本要求1.熟悉核酸的水解方法及水解产物。2.掌握核酸的酸碱性质。（重点）3.掌握核酸的紫外吸收。（重点）4.掌握核酸变性、复性及杂交的有关知识及应用。（重点、难点）基本要求76资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第15章 核酸的研究方法 第15章 77资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一、核酸的分离、提纯和定量测定(一)DNA的分离 用1mol/L的NaCl制备组织匀浆,离心除去组织残渣,多次用苯酚处理使蛋白质变性,每次处理后离心取上层水相,最后加2倍体积的乙醇沉淀出DNA。(二)RNA的分离 由于RNA酶存在广泛,且十分稳定,破碎细胞时要加入胍盐破坏RNA酶,试剂要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制,器皿要高压灭菌或用0.1%的DEPC处理,多次用苯酚或氯仿处理使蛋白质变性,每次处理后离心取上层水相,mRNA可用寡聚dT-纤维素亲和层析从总RNA中分离。(三)核酸含量的测定法 常用的方法是测定260nm的消光度,用公式计算核酸的含量。核酸的含量也可以用定磷法测定。DNA的含量可以用二苯胺显色法测定。RNA的含量可以用地衣酚显色法测定。一、核酸的分离、提纯和定量测定(一)DNA的分离78资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（四）核酸的超速离心(图15-2)超速离心可以分离超螺旋DNA（密度大）,线性DNA（密度小）和闭环DNA（密度居中）。也可以分离RNA。（五）核酸的凝胶电泳(图15-3)松弛型，松弛型，OC,Open circular DNA超螺旋超螺旋,CCC,covalently-closed circular DNA从细菌抽从细菌抽提得到的提得到的质粒质粒DNA 样品中不样品中不含线状含线状DNA（四）核酸的超速离心(图15-2)松弛型，OC,Open79资料仅供参考,不当之处，请联系改正。二、核酸的核苷酸序列测定和化学合成 二、核酸的核苷酸序列测定和化学合成 80资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(一)DNA的酶法（末端终止法）测序(一)DNA的酶法（末端终止法）测序 81资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(二)DNA的化学法测序(二)DNA的化学法测序82资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件83资料仅供参考,不当之处，请联系改正。生物化学核酸化学医学知识课件84资料仅供参考,不当之处，请联系改正。DNA酶法测序自动化 使用4种荧光素标记的双脱氧核苷酸，毛细管电泳和激光扫描技术使测序自动化，一个泳道一次可测大约1000个核苷酸，测序已成为可以快速完成的常规技术。人类基因组测序已经完成，多态性的研究和功能基因组学已经成为研究的热点。DNA酶法测序自动化85资料仅供参考,不当之处，请联系改正。由于测序仪在一个泳道只能准确测出几百个核苷酸，对于长DNA,只能将其切成小段再测序，为了组装，需要确定足够多的标记位点。常用遗传图、转录图、物理图、序列标签位点(STS)、表达序列标签(EST)等方法确定标记位点。限制性酶切位点分析是绘制物理图的常用方法由于测序仪在一个泳道只能准确测出几百个核苷酸，对于长DNA,86资料仅供参考,不当之处，请联系改正。(三)RNA的测序 1.RNA的测序可以用4种特异性的酶切割（从胰脏提取的RNase A水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯键，米曲霉中提取的RNase T1水解鸟苷酸的磷酸二酯键，黑粉曲霉中提取的RNase U2水解腺苷酸的磷酸二酯键，多头黏菌中提取的RNase Phy 水解A、U、G三种核苷酸的磷酸二酯键）,凝胶电泳分离，用类似蛋白质序列分析的方法推断核苷酸序列。2.也可以用化学试剂断裂RNA链，用类似DNA化学测序的方法推断核苷酸序列。3.最常用的方法是逆转录成cDNA，用DNA测序的方法推断核苷酸序列。(三)RNA的测序 1.RNA的测序可以用87资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（四）聚合酶链反（四）聚合酶链反（四）聚合酶链反（四）聚合酶链反应（应（应（应（PCRPCRPCRPCR）原理原理原理原理 PCR(polymerase PCR(polymerase chain reaction)chain reaction)是应用最广的分子生物学技术之一，模板DNA的含量依指数方式增加，可用来快速在体外扩增DNA,PCRDNA,PCR技术在临床检验和分子生物学中的应用十分广泛。耐热DNA聚合酶的发现推动了这一技术的广泛应用。（四）聚合酶链反应（PCR）原理 PCR(polym88资料仅供参考,不当之处，请联系改正。PCR技术的扩展技术的扩展 典型的PCR经过一定的调整可用于特殊的研究工作，使PCR技术扩展到分子生物学的各个方面，较常用的技术扩展有：1.“巢式巢式”PCR(nested PCR)先用一对引物对模板进行扩增，然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物，这一PCR 技术即巢式PCR。第一次扩增所用引物称外引物(outer-primer)，第二次扩增作用的引物称内引物(inter-primer)。进行“巢式”PCR可将外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，用外引物进行时，采用较高退火温度使内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增。经过若干循环，待外引物基本消耗完毕后，只需降低退火温度即可直接进行内引物的PCR扩增。这种PCR技术被称为“中途进退式”PCR(drop-in-drop-out PCR)。“巢式”及“中途进退式”PCR主要用于极少量模板的扩增。PCR技术的扩展89资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2.复合复合PCR(multiplex PCR)在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法称复合PCR。复合PCR主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体。此外也常用于多点突变性分子病的诊断。3.不对称不对称PCR(asymmetric PCR)两种引物比例相差较大的PCR称不对称PCR。不对称PCR可制备用于核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针等。4.反转录反转录PCR(reverse transcription PCR)由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增，这种PCR技术称为反转录PCR，在分子生物学和临床检验等领域均有广泛应用。5.涂片涂片PCR(slide-PCR)直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增的方法称涂片PCR。涂片PCR结合原位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序列的PCR检测。2.复合PCR(multiplex PCR)90资料仅供参考,不当之处，请联系改正。6.反向反向PCR(inverse PCR)扩增引物相反方向DNA序列的PCR技术称反向PCR。在反向PCR中，要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知DNA片段进行酶切和环化，然后直接进行PCR，也可将已知序列酶切后再进行PCR。反向PCR主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增。7.锚定锚定PCR(anchored PCR)用酶法在一通用引物反转录的cDNA 3端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增称为锚定PCR，可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。8.修饰引物修饰引物PCR 为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5-末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等，这种PCR技术称为修饰引物PCR。此外，还可将一些信号分子如荧光素、生物素等连接于引物的5末端，当PCR完成后可对产物直接进行检测。PCR在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。6.反向PCR(inverse PCR)91资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（五）DNA的化学合成 固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3-OH与固相载体成共价键，5-OH被4，4-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，下一个核苷酸的5-OH亦被DMTr保护，3-OH上的磷酸基上有-N(C3H7)2和-OCH3两个基团，3-OH因此被活化。（五）DNA的化学合成 固相磷酰亚胺法合成时，末端核92资料仅供参考,不当之处，请联系改正。每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1)脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5-OH。(2)缩合：新生成的5-OH 在四唑催化下与下一个核苷3-磷酰亚胺单体缩合使链增长。(3)盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4)氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向5方向延伸一个核苷酸。每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1)脱三苯甲基：末端核苷93资料仅供参考,不当之处，请联系改正。基本要求1.掌握核酸的分离、提纯、定量测定、超速离心和凝胶电泳等基本方法。（重点）2.熟悉核苷酸序列测定的原理。（难点）3.熟悉DNA聚合酶链反应的原理及应用。（难点）4.熟悉DNA化学合成的原理及应用。（难点）基本要求94