细菌质量控制医学课件

临床细菌学质量控制临床细菌学质量控制1l临床细菌学质量控制1细菌质控分为细菌质控分为室内质控室内质控室间质评两部分室间质评两部分2l细菌质控分为室内质控室间质评两部分2 室室内内质质量量控控制制l临床细菌学室内质控工作是细菌检验工作中心。是随临床检测同步进行的一项常规工作；是临床检测工作的一项重要组成部分。它贯穿于实验室所有的工作环节和每一个检测项目。室内质量控制工作可使检测结果的重现性得到最大限度的保证，同时还可及时发现实验中存在的问题，如操作程序或手法、实际质量、环境温度等方面的问题。尽量减少并检测由这问题造成的结果偶然性偏差。33l室内质量控制临床细菌学室内质控工作是细菌检验工作中心。是 室内质量控制l由于室内质量控制是临床实验室天天都要进行的一项工作，所以持之以恒是非常重要的。除此之外，严格执行室内质量控制的标准操作程序亦非常重要。切忌将室内质量控制流于形式。44l室内质量控制由于室内质量控制是临床实验室天天都要进行的一项l由于检验医学各专业所采用的方法学不尽相同，使得室内质质量控制的方法亦各具特点。临床细菌学与其他专业相比，室内质量控制工作特点显得较为突出，主要表现为繁锁、个别环节不易操作.主观解释也比较多，各步骤间是密切联系的。一旦某一环节出现差错，就会直接影响最终结果及临床治疗.所以必须做好此项工作.55l由于检验医学各专业所采用的方法学不尽相同，使得室内质质量控制 室室内内质质控控包包括括以以下下几几个个方方面面：（一）实验室前的质量控制（一）实验室前的质量控制l实验室前的质量控制是所有实验室内质量控制之根本，主要包括标本的采集、运送和采集的时间。由于临床对细菌检验知识或对细菌学不太了解。对标本的采集、采集时间、采集量及运送方式不得法，使细菌检验常常失败或发生错误。不论细菌室工作人员有多丰富的细菌诊断知识及经验、如何努力、设备如何完善，如果标本采集、时间、方法、采集量及运送方法等任何一项有差错，也得不准确的结果。66l室内质控包括以下几个方面：（一）实验室前的质量控制6 所以需要临床细菌室制定标本采集指南。让临床知道和了解细菌标本采集的要求。其中包括各种标本采集时间、采集方法、采集量及运送方法。如尿和痰标本需要清晨采取；而血标本则需要根据不同目的或在发烧初期或发烧高峰期间采取；咽喉溃疡的涂片与培养时，须小心的从真正溃疡处采取标本，不要受到口腔分泌物的污染；皮肤或下表皮的扩散性感染，应采集病灶处的边缘，而非中央处的感染组织送检。77l所以需要采集标本时应遵循无菌采样，避免污染，特别是对血液、脑脊液等无菌体液标本在采集时。要严格执行无菌操作，严禁污染。采集要“足量”不得过少，且有代表性，否则影响细菌检验.如采集脓标本，最好采集数毫升；血培养应采抗凝血5ml(成人)幼儿不得少于1-2ml；用棉拭子采集标本时，必须多采取几根拭子.标本采集后要迅速送检避免保存过长时间.过长保存，会使杂菌生长起来，湮没致病菌的生长；也有可能使致病死亡。如尿液放置过长会长杂菌，痰和粪便放置过长，会使细菌死亡。不能立即送检的标本应作相应处理.所有病原学标本应在应用抗生素之前作培养.88l8（二二）标标本本接接种种培培养养前前的的质质量量控控制制 l标本接种前必须首先检查是否合格。外观检查：如痰标本的肉眼观察：观察颜色、粘度、有无血丝或脓。若标本为水状且很明显是唾液，则为不合格标本。镜检：如尿标本，用未离心的新鲜尿液在高倍镜检中，每视野白细胞大于或等于10个（10个HPF）即说所谓脓尿，为合格标本。99l（二）标本接种培养前的质量控制标本接种前必须首先检查是否合直接涂片检查 其目的是：及时发现标本中存在的微生物，选择适宜的培养基进行病原学的分离鉴定。如痰标本应作涂片检查，根据鳞状上皮细胞，柱状上皮细胞和白细胞的量判断标本采集是否合格。若鳞状上皮细胞数 25个/LHP时，表示标本受到口腔分泌液严重污染。如每低倍视野鳞状上皮细胞10个（25个（WBC25个/LHP）为合格标本。1010l直接涂片检查其目的是：及时发现标本中存在的微生物，选择适 临床医生一般认为优势菌具有临床意义，革兰染色的涂片中如何判定优势菌很重要，一般说，在油镜下，优势菌在10个视野内出现的频率至少要达到50%。不合格的标本应要求临床重新采集后送检。1111l临床医生一般认为优势菌具有临床意义，革兰染色(三三)分分离离培培养养的的质质量量控控制制 l标本中病原菌的分离率受多种因素的影响，如标本采集因素、分离培养基的质量和是否及时接种。临床上苛养菌检出率很低，其中一个重要原因是国产培养基质量问题，在一个就是细菌室技术水平和人员素质问题。如果一个细菌室分离不出可养菌，就不可能反映出细菌分布的特点，也不能满足临床的需要。此外他又是衡量一个细菌室技术水平和人员素质的重要标志。临床细菌室应建立细菌标本随时接种制度，尤其是某些苛养菌的分离，否则将严重影响分离率.1212l(三)分离培养的质量控制12（四四）培培养养基基的的质质量量控控制制l培培养养基基的的质质量量控控制制主主要要分分为为六六个个部部分分，包括原材料、分离培养基、选择性培养基、鉴定培养基、PH测试，无菌试验1、原原材材料料各种培养基的原材料进入实验室之日就应作记录，记录中应包括批号、日期、品名、厂家和开始使用的日期.每次使用也应记录配置量和操作者姓名.1313l（四）培养基的质量控制培养基的质量控制主要分为六个部分，包括分分离离培培养养基基l对分离培养的培养基质量控制标准包括菌落形态、大小、溶血特性。用流感嗜血杆菌来测试巧克力琼脂的分离能力(1618小时生长)，用肺炎链球菌测试血琼脂的分离能力（中等菌落 -溶血）并根据不同培养目的配置选择性巧克力培养基。1414l分离培养基对分离培养的培养基质量控制标准包括菌落形态、大小、选选择择性性培培养养基基l对选择性培养基要看被抑制菌和被选择菌生长的状态.用大肠杆菌、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌，来测试选择性培养基的选择性.如在中国兰培养基上，大肠杆菌（兰色菌落）和痢疾杆菌（无色菌落）可以生上，但金黄色葡萄球菌不应生长。在ss培养上痢疾杆菌生长（无色菌落），大肠杆菌少量生长（菌落粉红色，周围有沉淀），金黄色葡萄球菌不应生长.1515l选择性培养基对选择性培养基要看被抑制菌和被选择菌生长的状态.鉴鉴定定培培养养基基 l主要是用以观察细菌是否具备某种生物化学反应能力。不管是自制或商品购入的鉴定培养基，都要进行质量检测。均应用相应阳性反应和阴性反应的菌株进行测试。符合标准方可使用。lpHpH测试测试，如果使用商品化脱水培养基，严格按照说明操作，一般不必再进行pH测试。如果使用基础物质进行培养基制备，在培养基冷却后须进行pH测试.16 16l鉴定培养基主要是用以观察细菌是否具备某种生物化学反应能力。l如果pH测得值与预期值.相差0.2单位，则需要酸碱调解.l无菌试验一般为随机抽样3-5%，在35条件下培养48小时.如果抽样中每个培养基上出现2个以上菌落，证明本批培养基已被污染.l所有培养基都要进行外观检查（透明度、色泽）.性能检测.要求用已知特性稳定的质控菌株进行鉴定.用于质量控制的菌株应固定做妥善保存.1717l如果pH测得值与预期值.相差0.2单位，则需要酸碱调解.17（五五）常常用用仪仪器器的的质质量量控控制制 l实验室仪器设备是我们从事临床标本检测的工具。因此，仪器设备的质量维护对保证检测质量至关重要。1818l（五）常用仪器的质量控制实验室仪器设备是我们从事临床标本检表表表表1 1临床细菌学实验常用仪器设备的质量维护临床细菌学实验常用仪器设备的质量维护临床细菌学实验常用仪器设备的质量维护临床细菌学实验常用仪器设备的质量维护 l仪器名称仪器名称质量维护说明质量维护说明全面技术检查全面技术检查l显微镜显微镜每次工作结束后，用镜头纸擦拭并清洁镜头每次工作结束后，用镜头纸擦拭并清洁镜头至少每年一次至少每年一次l妥善放置避免振动、潮湿及灰尘妥善放置避免振动、潮湿及灰尘l至少每月检查一次聚光器至少每月检查一次聚光器高压灭菌器高压灭菌器至少每月清洁一次内室至少每月清洁一次内室至少至少6个月一次个月一次l每次使用时应有专人负责每次使用时应有专人负责l每次使用时均应动态记录温度及压力每次使用时均应动态记录温度及压力l每次使用时均应按疾病控制中心的要求进行鉴测每次使用时均应按疾病控制中心的要求进行鉴测l恒温孵育箱恒温孵育箱至少每月清洁一次内室至少每月清洁一次内室至少至少6个月一次个月一次l设定符合要求的温度控制范围，保证每日至少进行一次温度鉴测并记录设定符合要求的温度控制范围，保证每日至少进行一次温度鉴测并记录ll天平天平保持天平及砝码的清洁、干燥保持天平及砝码的清洁、干燥按照计量部门要求按照计量部门要求l妥善放置、避免振动及潮湿妥善放置、避免振动及潮湿l该工作区内尽量避免空气流动该工作区内尽量避免空气流动l称量时使用称量纸，避免被称量物直接接触托盘称量时使用称量纸，避免被称量物直接接触托盘l冰箱冰箱在距墙至少在距墙至少25cm处放置处放置至少每年一次至少每年一次l至少每两个月清理一次内室（包括除霜、除冰）至少每两个月清理一次内室（包括除霜、除冰）l设定符合要求的温度控制范围，保证每日至少进行一次温度鉴测并记录设定符合要求的温度控制范围，保证每日至少进行一次温度鉴测并记录l水浴箱水浴箱至少每月清洁一次内室壁、更换一次水至少每月清洁一次内室壁、更换一次水至少至少6个月一次个月一次l如为连续工作状态，则每日至少检查一次水位如为连续工作状态，则每日至少检查一次水位l在使用前应先检查水位在使用前应先检查水位l在使用前及使用过程中，应对温度进行连续监测在使用前及使用过程中，应对温度进行连续监测19l表1临床细菌学实验常用仪器设备的质量维护仪器名称 除上表所列举的仪器外，二氧化碳培养箱:除观察温度外，还应该观察CO2浓度，每天做好记录。厌氧设备：厌氧箱、厌氧盒、厌氧袋 使用时要用指示剂（美兰）来监测环境厌氧状态，也可以用专性需氧菌作指示剂来监测环境。细菌鉴定系统、血液培养分析系统的质量维护对细菌学检查的质量保证也非常重要的。但由于各种品牌的仪器的检测原理、工作模式等不尽相同，所以不可一概而论。制造商们在出售仪器时会同时提供使用手册，其中对仪器的质量维护有详细的说明，使用者严格执行即可。2020l除上表所列举的仪器外，二氧化碳培养箱:除观察温度外，还应（六六）细细菌菌染染色色液液的的质质量量控控制制l染色是临床细菌学检查最常使用的方法，根据染色部位及染色目的不同可分为革兰染色、抗酸染色、鞭毛染色、异染颗粒染色和荚膜染色等。其中革兰染色和抗酸染色使用频率最高。现对这两种染色方法的室内质控加以说明。2121l（六）细菌染色液的质量控制染色是临床细菌学检查最常使用的方 革兰染色革兰染色 1)严格按照标本收集程序取样并涂片 2)对涂片进行严格编号或标识 3)在固定涂片时，避免玻片加热过度 4)染液放置处避免高温、干燥及灰尘 5)利用过滤的方法去除结晶紫的固体结晶 6)如果卢戈氏碘染液退色，应立即更新 7）利用标准菌株（金黄色葡萄球菌 ATCC25923及大肠埃希菌ATCC25922）或其他已知的革兰阳性菌及革兰阴性菌 至少每周进行一次质控验证 2222l革兰染色22 妻妻-尼染色尼染色 1)严格按照标本收集程序取样并涂片 2)对涂片进行严格编号或标识 3)每次使用新玻片，不可重复使用 4)在固定涂片时，避免玻片加热过度 5)利用过滤的方法去除石炭酸复红染 液中的沉淀 6)利用已知的抗酸杆菌（AFB）阳性涂 片每周或在更新石炭酸复红染液时至少 进行一次质量验证 7)阳性涂片应置于专门器具专门地点保存 以备复验 8)阴性涂片至少保存两周以备复验 染色液配置后应标明名称、日期、配制者 2323l妻-尼染色23七七 细细菌菌鉴鉴定定或或鉴鉴别别常常用用试试验验的的质质量量控控制制 l细菌鉴定或鉴别主要依据细菌的形态特点、染色特点、培养特征、生化反应及血清学特征等。细菌这些生物表型特征或按固定组合的方式被用于细菌鉴定，或以灵活组合的方式用于细菌鉴定、鉴别及补充试验。无论怎样，这些生物表型检测的准确与否直接影响到细菌鉴定的准确性。下面列举一些常用且较为关键的试验.2424l七细菌鉴定或鉴别常用试验的质量控制细菌鉴定或鉴别主要依表常用细菌鉴定或鉴别试验的质量控制表常用细菌鉴定或鉴别试验的质量控制l试验名称质控周期阳性质控阴性质控l质控菌结果质控菌结果l触酶试验每次使用时金葡菌有气泡产生化脓性链球菌无变化l凝固酶试验每次使用时金葡菌与人、兔或猪血表皮葡萄球菌无凝固现象l浆产生凝固现象l氧化酶试验每次使用时铜绿产生兰紫色大肠埃希菌无颜色改变l杆菌肽敏感性试验每周化脓链纸片周围出现抑无乳链球菌纸片周围细l菌圈菌均一生长lCAMP试验与被测试菌同步进行无乳链球菌质控菌生长条化脓性链球菌无溶血程度l带在靠近金葡菌加重区出现l菌区内出现溶血l加强l胆汁溶菌试验每批号（有效期内）肺炎链球菌菌落溶解缓症链球菌无菌落溶解现象l胆汁七叶苷试验每批号（有效期内）粪肠球菌使琼脂斜面变黑牛链球菌琼脂斜面无黑色l出现l马尿酸盐试验每批号（有效期内）无乳链球菌出现深紫色粪肠球菌无颜色改变ll吲哚试验每批号（有效期内）大肠埃希菌产生红色阴沟肠杆菌无颜色改变l2525l表常用细菌鉴定或鉴别试验的质量控制试验名称抗抗血血清清的的质质量量控控：l用于诊断的各种抗血清进入实验室应记录收到日期，外观检查。注意观察血清的透明度、色泽等是否合乎标准，如有混浊和絮状物沉淀表明已被污染为不合格，同时要注意效价、有效期、使前用已知标准菌株做阳性和阴性试验，过期不能使用。l4-8冰箱中保存。2626l抗血清的质量控：用于诊断的各种抗血清进入实验室应记录收到日质质量量控控制制方方法法：纸纸片片扩扩散散法法药药物物敏敏感感试试验验的的质质量量控控制制方方法法：目的：目的：质控工作的目的是：l监测药敏试验步骤的精密度和准确度l监测试验所用试剂的质量l监测进行试验和判读结果的工作人员的操作 为达到这些目的，最好选用遗传性能稳定和 在被控的特定方法中有用的参考菌株，但也 可以加用其他菌株.2727l质量控制方法：纸片扩散法药物敏感试验的质量控制方法：质质控控菌菌株株：l为控制纸片试验的精密度和准确度，应从可靠来源获取一些质控菌株（质控菌株一般在国家卫生部临检 中心或省临检中心都可购买到）2828l质控菌株：为控制纸片试验的精密度和准确度，28表表表表3 3 3 3 纸片扩散法药敏试验的质量控制条件及质控菌株纸片扩散法药敏试验的质量控制条件及质控菌株纸片扩散法药敏试验的质量控制条件及质控菌株纸片扩散法药敏试验的质量控制条件及质控菌株质控菌株试验条件l大肠埃希菌ATCC25922培养基：Mueller-Hinton琼脂l大肠埃希菌ATCC35218接种液：生长法或直接菌落悬液l(用于-内酰胺类药/-内酰胺酶抑制剂)孵育：35：空气1618hl铜绿假单胞菌ATCC27853同上l金黄色葡萄球菌25923培养基：Mueller-Hinton琼脂接种液：生长法或直接菌落悬液孵育：35：空气1618h如测试苯唑西林、甲氧西林和奈夫西林时，孵育时间需24hl粪肠球菌ATCC29212培养基：Mueller-Hinton琼脂接种液：生长法或直接菌落悬液孵育：35：空气1618h如测试万古霉素、需要24hl流感嗜血杆菌ATCC49247培养基：嗜血杆菌试验用培养基（HTM）接种液：直接菌落悬液法孵育：35：5%CO2：16-18hl淋病奈瑟菌ATCC49226培养基：GC琼脂+1%特定的生长补充品。纸片扩散法不需要使用无半胱氨酸的生长补充品接种液：直接菌落悬液法孵育：35：5%CO2：20-24hl肺炎链球菌ATCC49619培养基：Mueller-Hinton琼脂+5%羊血接种液：直接菌落悬液法孵育：35：5%CO2：20-24h2929l表3纸片扩散法药敏试验的质量控制条件及质控菌株l监控M-H琼脂中药物抑制剂的水平是否低的可以接受（含量是否符合要求）用粪肠球菌ATCC29212或粪肠球菌 ATCC33186（抑菌圈20mmM-H琼脂为 合格）粪肠球菌ATCC29212也可用于高 含量氨基糖苷类纸片的质控。l 一般的实验室，最少应保存三种质控 菌 ATCC225922 ATCC225923 ATCC27853 3030l监控M-H琼脂中药物抑制剂的水平是30质质控控菌菌株株的的测测试试与与保保存存：l质控菌株的测试：质控菌株的测试：l质控菌株的测试应按照标准纸片扩散试验步骤进行，并且使用与临床分离株相同的抗微生物药。质控菌株保存：质控菌株保存：l日常所用的质控菌应贮存在胰大豆琼脂（非苛养菌）l或营养丰富的巧巧克力琼脂斜面（苛养菌），4-8 l冰箱保存。l长期贮存，可用5%小牛血清肉汤，10%胰大豆肉汤，10%-15%甘油，脱纤维羊血或脱脂牛奶，于-20甚至更低温度保存。3131l质控菌株的测试与保存：质控菌株的测试：31l 日常所用的质控培养物应于4-8贮存。每周 l 进行移种。日常所用的质控培养物每月都要用冷冻的或 冻干来更换。在测试前应将菌株在琼脂平板上进行移种以 获得单个菌落 按推荐的接种物制备方法，将菌株进行培养 或制成悬液以进行试验。只要平均抑菌圈直径没有发生由于方法错误，造成的有意义的改变，质控培养物就可以一 直用于监测试验的精密度和准确度3232l日常所用的质控培养物应于4-8贮存。每周32l如果某意外结果提示该菌株的内在敏感性发生改变，就应换用此质控株的新培养物。（如果平均抑菌圈直径有明显改变，表示质控菌株被污染或敏感性发生改变，此时，就应换用此质控株的新培养物）3333l如果某意外结果提示该菌株的内在敏感性发生改变，就应换用此质控 药药敏敏试试验验质质控控标标准准（琼琼脂脂扩扩散散法法）l药敏纸片：药敏纸片：l药敏纸片的直径为6.00-6.25mm，吸水性能要很好（每片的吸水量约20）。边缘光滑，无毛刺。l药名代号和药量标记要清楚。纸片的含药量必须与NCCLs规定的含药量一致，药物纸片用前必须作质量评定。用以下两个指标判定纸片的质量3434l药敏试验质控标准（琼脂扩散法）药敏纸片：34l含含药纸片的均匀度：片的均匀度：含药纸片的均匀度（片间差）测定方法：用质控菌株按常规方法接种菌株后，同一平板贴6张相同的纸片，35OC培养一定时间后，测量抑菌圈直径，6个抑菌圈直径相差一般不超过3mm为合格，如果相差太大，说明纸片含量不均。3535l含药纸片的均匀度：35 l含药准确性：含药准确性：含药准确性：判定纸片的实际含药量与标量是否一致，计算上述六个抑菌圈直径的平均值与质控标准比较，判断纸片含药量的准确性，平均值高或低于质控标准表明准确性差。3636l含药准确性：36药敏敏纸片片的的保保存存：l一般长期保存在-20以下的低温冰箱中。l日常工作用，临时保存在2-8的冰箱中，但其存放时间不能超过一周。使用前要室温平衡，用完立即放回冰箱中，不能放实验室过夜。实验室过夜的纸片，若想再次使用必须做质控，合格才可继续使用。某些不稳定的药物，（如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸复合药物）应冷冻保存直至用的当天取出，以尽量保持其稳定性。-内酰胺类药物纸片应密封包装并冷冻，少量正用的纸片可冷藏至一周。3737l药敏纸片的保存：一般长期保存在-20以下的低温冰箱中。3l用纸片分配器时，应上紧盖子并配备足量干燥剂。分配器在打开前应预先平衡至室温。当指示剂变色时，应更换干燥剂以防止过于潮湿。装有纸片的分配器在不用时应冷藏。l只能使用尚未过期的纸片，过期纸片均应弃去，决不能使用。38 38l用纸片分配器时，应上紧盖子并配备足量干燥剂。分配器在打开前应制制备备接接种种物物时时的的浊浊度度标标准准：1.为使药敏试验的接种浊度标准化，应使用一个等同于0.5号麦氏标准管的BaSO4浊度标准管（此管可以买，也可以自制但一定要准确）.2.在使用前，应将浊度标准管置于旋转混匀器上剧烈振动，目测其外观浊度应均匀一致。若有大颗粒出现，此标准管应更换。3.每个月都应更换BaSO4浊度标准管，或者对其浓度进行核实（BaSO4浊度标准管稳定性差）。3939l制备接种物时的浊度标准：1.为使药敏试验的接种浊度标准化，接接种种物物的的制制备:l有两方法：1.生长法2.直接菌落悬液法 接种物的要求：接种物的要求：l接种菌液要求纯培养物，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板。l接种菌液浓度要求与0.5号BaSO4麦氏浊 度标准管相同（接种菌液浓度对药敏试 验至关重要，在配置时浓度一定要准确，避免过浓或稀）4040l接种物的制备:有两方法：1.生长法2.直接菌落悬液法40试试验验平平板板的的接接种种：1.接种物悬液的浊度调整后，最好在15分钟内接种，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。2.用棉拭子在无菌的稍干燥的M-H琼脂表面划线接种，重复操作两次，每次将平板转动约60度。最后沿平板周边绕两圈，保证涂布均匀。3.在贴纸片之前，可以将培养皿盖半开3-5分钟，但不超过15分钟以使表面过多的水分被吸收。4141l试验平板的接种：1.接种物悬液的浊度调整后，最好在15 注注意意：不同菌种不可在同一平板上做混合细菌药敏试验。避免用临床标本直接作药敏试验，除非临床上急需且革兰氏染色见到单一菌种，但随后必须按标准方法重作第二次。禁止用未稀释的过夜肉汤培养或其他非标准接种物进行平扳划线。4242l注意：不同菌种不可在同一平板上做混合细菌药敏试验。避免用贴贴纸纸片片要要求求：1.将纸片贴到接种好菌的琼脂平板表面。每个纸片都应下压一下，以保证与琼脂表面完全接触。不管纸片是单个贴还是用分配器加，都应均匀分布，每张纸片中心间距不少24mm。纸片中心点离平皿内壁不少于15mm。青霉素和头孢菌素纸片离平皿内壁10mm以上，两纸片中心相距至少30mm。一般情况下，150mm平板所贴纸片不应超过12个，100mm的不应超过5个。一旦纸片接触了琼脂表面，就不应再挪动位置，因为有些药物几乎立即扩散，而应该在需要的地方贴新的纸片。4343l贴纸片要求：1.将纸片贴到接种好菌的琼脂平板表面。每个纸片2.贴完纸片后，应在15分钟内，将平板反转过来，置于35温箱中孵育。除嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌以外，平板不应放在CO2含量高的空气中孵育，因为其抑菌圈解释标准是根据普通空气中的孵育结果研究出的，CO2可使培养基PH变酸，还会显著改变某些药物的抑菌圈大小。4444l2.贴完纸片后，应在15分钟内，将平板反转过来，置于35温判判读读平平板板和和解解释释结结果果：1.孵育16-18小时后，检查每一块平板，如果平板划线满意，接种物准确无误，菌落应相互融合生长。如果出现明显的单个菌落，是因为接种量太少(或菌液太淡)，必须重复试验，测量的应该是完全抑制区域的直径（肉眼判读），包括纸片直径。4545l判读平板和解释结果：1.孵育16-18小时后，检查每一块平2.抑菌圈的测量可以用游标卡尺，尺子或特制的模板，测量到最接近的整数毫米数。如果是加血的琼脂培养基（如对链球菌），则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。如果被测菌是葡萄菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分别观察笨唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐苯唑西林或耐万古霉素菌落的微弱生长。抑菌圈内的任何可见的生长，都表示苯唑西林或万古霉素耐药。4646l2.抑菌圈的测量可以用游标卡尺，尺子或特制的模板，测量到最3.抑菌圈边缘应是肉眼观察无明显生长区域。如果在抑菌圈的边缘有微弱的小菌落生长，而且只有用放大镜才能看到，这些菌落就应该忽略。如果在透明的抑菌圈内有任何的单个菌落，都应该进行二次培养，重新鉴定重新试验，变形杆菌属的菌株可能会在某些抗微生物药的抑菌圈内蔓延生长。对于变形杆菌属，在本该十分明显的抑菌圈内薄纱样蔓延生长，也应该忽略。对于甲氧苄啶和磺胺，培养基内的药物拮抗剂可能使细菌能微弱的生长，因此应忽略微弱的生长（生长的菌膜20%或更少），并且应测量更为明显的边缘来决定抑菌圈的直径。用加血培养基测试链球菌时应该测量生长受抑制的区域，而不是溶血受抑制的区域。4747l3.抑菌圈边缘应是肉眼观察无明显生长区域。如果在抑菌圈M-H琼琼脂脂培培养养基基质质控控标标准准：l在众多现用的培养基中，MH琼脂最适于常规药敏试验，对于非苛养菌的常规药敏试验是最好的。原因如下：l它的药敏试验的批间重复性好。l它含有的磺胺、甲氧苄啶和四环素的抑制物很少l它可使绝大多数非苛养病原菌获得满意生长.l用它进行的药敏试验已积累了大量的数据和经验（尽管MH琼脂培养基用于药敏试验通常是可靠的，但偶然也有产品的批间差，所以对每批培养基用之前都要进行质量检测）4848lM-H琼脂培养基质控标准：在众多现用的培养基中，MH琼脂M-H琼琼脂脂的的制制备备：lM-H琼脂应使用商用脱水培养基基础并按照制造厂家的说明制备。l高压灭菌后立即水浴冷却至45-50oCl将新制备并冷却的培养基倒入培养皿中，厚度应均匀一致，约4mm。直径150mm的培养皿应倒入60-70ml，而100直径的可倒25-30ml，直径90mm培养皿可到入25ml。4949lM-H琼脂的制备：M-H琼脂应使用商用脱水培养基基础并按l培养基应冷却至室温，若当天不使用，应保存于冰箱中（2-8oC）。l培养基应于制备后七天内使用完，但若采取了充分的防范措施，减缓了琼脂干燥，如使用了槊料包装（水分不蒸发的可适当延长）但在用之前用规定的质控菌株进行试验，结果仍然正确，则可延长使用期。l每批平板都应抽样，在30-35 oC孵育24小时或更长时间以检查其无菌性。5050l培养基应冷却至室温，若当天不使用，应保存于冰箱中（2-8oPH测测定定：l在制配培养基时应检查每批MH琼脂的PH值，其确切方法因不同实验室的设备不同而异。胶化后，琼脂培养基在室温下PH值应为7.27.4。如PH值过低，某些药物会失去效力（如氨基糖苷类与大环内酯类）。而另一些药物活性可能增强（如青霉素类）。如PH值过高，上述情况则相反（在配制培养基时要注意高压灭菌后的PH值改变5151lPH测定：在制配培养基时应检查每批MH琼脂的PH值，其确检检测测P PH H值值可可用用以以下下几几种种方方法法：l用足量琼脂浸没PH电极端进行测量。l在烧杯或杯子中，取少量琼脂固化与PH电极端周围进行测量。l使用一个准确定标的表面电极测量。5252l检测PH值可用以下几种方法：用足量琼脂浸没PH电极端进行培培养养基基中中的的拮拮抗抗物物质质的的影影响响(胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷或或胸胸腺腺嘧嘧啶啶)l含过量胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶的培养基可能逆转磺胺类和甲氧苄啶的抑菌效应,使得抑菌圈变小变模糊,甚至消失,从而导致假耐药报告。因此应使用胸腺嘧啶核苷含量尽可能低的M-H琼脂。为评价一批新的M-H琼脂,可用甲氧苄啶/SMZ纸片,对粪肠球菌ATCC29212或ATCC33186进行试验,质量好的培养基上可出现一个边缘清楚的抑菌圈,直径为20mm或更大。质量差的培养基上可能没有抑菌圈,可能在抑菌圈内有菌生长,也可能抑菌圈直径小于20mm。5353l培养基中的拮抗物质的影响(胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶)含过量胸二二价价阳阳离离子子含含量量变变化化的的影影响响:l二价阳离子,主要是指镁和钙的含量变化,可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的实验结果.含量过高,抑菌圈会变小,含量过低,抑菌圈会大的不可接受。锌离子会影响细菌对碳头孢烯的敏感性。5454l二价阳离子含量变化的影响:二价阳离子,主要是指镁和钙的含量室室内内控控制制步步骤骤:按NCCLS颁布的每年修改内的“抗微生物药物敏感试验的执行标准”进行操作。l质控菌株应按标准方法与临床标本分离株同步进行药敏试验l质控菌株在实行常规监控（每周一次）前连续监测30天 l对每一个药物/细菌组合，每30个抑菌圈直径结果（即一个药物/细菌组合连续30天的抑菌圈直径结果）中，只允许最多3次超过质控允许范围，并且这3次失控不应该连续出现。55 55l室内控制步骤:按NCCLS颁布的每年修改内的“抗微 如果30次连续测定的结果完全符合上述标准，试验频率可以降低，每一质控菌株可以每周测一次，实行常规监控。5656l如果30次连续测定的结果完全符合上述标准，试验频率可以降日日常常工工作作的的质质量量控控制制 ：l日常工作中随同标本测定质控菌株的抑菌圈。每周做一次质控。l质量监测的情况应完整的记录下来,以便进行分析。当更换药物或培养基时必须用相应质控菌株测试。l使用每周质控测试系统时，如果出现一个抑菌圈直径超过允许的质控范围时，需要采取纠正措施。如果结果失控是因为明显的错误,如使用了错误的纸片、错误的质控菌株、明显被污染的菌株和错误的孵育气体,应从重复此质控试验.如果无明显错误而出现的失控结果,则实验室应恢复每天质控,直至弄清错误的原因并提供解决的办法为 5757l日常工作的质量控制：日常工作中随同标本测定质控菌株的抑菌以以下下内内容容可可用用以以证证实实问问题题已已获获解解决决：1.用合适质控菌株连续测试五天：并且证实对每个药物/细菌组合，所有5个抑菌圈直径.（即每个组合连续五天的抑菌圈直径）都应在质允许范围内2.如果问题不能马上解决（即至少一个抑菌圈直径仍在质控允许范围外），就必须进行每日质控直至最终得到解决。恢复每周质控前，必须有记录证实又有连续30个实验日有满意结果。5858l以下内容可用以证实问题已获解决：1.用合适质控菌株连续测试失失控控原原因因及及其其纠纠正正：质量控制工作中,一旦有结果超出质控允许范围,说明可能某种条件发生改变,称为失控。遇到失控情况应该仔细分析质控结果,查找原因予以解决。在在临临床床工工作作中中常常规规的的失失控控现现象象及及其其原原因因有有以以下下几种：几种：抑菌圈直径超过或低于规定的质控允许范围时，考虑以下常见的错误来源：l抄录质控数据时的书写错误5959l失控原因及其纠正：质量控制工作中,一旦有结果超出质控允l测量抑菌圈直径读出错误l接种菌悬液太浓或太淡l质控菌株有污染或有其他改变l0.5号硫酸钡浊度标准管未摇匀或变质l错误的孵育温度或气体l试验用培养基的质量有差异（在某一新 批号使用前应进行检查）l药物纸片在实验室取用或储存的过程中失效l不了解新的药敏判定标准6060l测量抑菌圈直径读出错误60l氨基糖苷类抗生素抑菌圈减小（或增大），而四环素类抗菌素抑菌圈增（或减小）这是培养基得PH值不对.氨基糖苷类抗生素在碱性中活性强，酸性中活性弱.PH值对四环素的作用正好相反.出现此种情况必须纠正培养基的PH值.l某一种药物的抑菌圈逐渐减小，其他药物均正常这是药敏纸片中抗生素失效的表现，最容易出现这种现象的药物是青霉素和头孢菌素类.此时必须更换新的纸片.6161l氨基糖苷类抗生素抑菌圈减小（或增大），而四环素类抗菌素抑菌圈l更换新培养基后质控结果改变 培养基决定质量控制结果的准确性，如果新换一批培养基，质控结果有很大改变，这是由培养基质量的批间差造成的，除PH可以调节外，其他成分不易纠正，只能从新更养基或从新标定质控标准.l一旦发现结果失控时，应先仔细检查平板，常能容易的解决一些错误问题.如果方法上没问题，可暂认为是统计上的变异，第二天重复试验的结果应符合要求.如仍失控必须继续查找原因.在问题未纠正之前须每天做质控，至少恢复5个连续试验日，直到问题解决。6262l更换新培养基后质控结果改变培养基决定质量控制结果的准确性，l临床细菌室应该建立室内质控的标准操作程序（SOP）文件以及保证该SOP文件得以严格执行：要有的放失地进行室内质控工作，实验室应严格对室内质控结果进行记录，未了便于操作，最好设计出简便合理的记录表格。对于任何一项室内质控均给出明确的质控预期结果，以便判断室内质控结果是否合格。针对失控，需建立失控处理程序，失控处理最后应填写失控报告备案。应认真学习好NCCLS颁布的有关纸片扩散法试验时应注意的问题，应严格按照NCCLS颁布的标准来判定敏感和耐药，如对于耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌6363l临床细菌室应该建立室内质控的标准操作程序（SOP）文件以及保的MRS株，头孢菌素类和其他-内酰胺类如阿莫西林/克拉维酸，氨苄西林/舒巴坦等和亚胺培南等可在体外显示活性，但临床无效，因此仍报告临床耐药。从血液和脑脊液分离的肺炎链球菌,应用MIC法测试并报告青霉素，头孢噻肟或头孢曲松,美罗培南和万古霉素的敏感性。对其他部位的分离株则用苯唑西林纸片筛选试验，如果抑菌环=19mm应测试青霉素和头孢噻肟或头孢曲松的MIC。对于肠球菌，头孢菌素类，氨基糖苷类，克林霉素和TMP/SMZ在体外可能有活性，但临床上无效，因此不报告细菌对这些药物敏感。对于沙门菌属和志贺菌属分离株，1代和2代头孢菌素在体外可能表现对于沙门菌属和志贺菌属有活性，但临床无效，故不应报告为敏感等等。6464l的MRS株，头孢菌素类和其他-内酰胺类如阿莫西林/克 室室间间质质量量控控制制方方法法：l重点是冻干菌株的复活。冻干菌株一般用无菌盐水或肉汤溶解即可，接种时先接种一个血平板和一个选择性培养基，另外还要做增菌培养，用营养肉汤或牛心浸液都可以.l革兰染色、分离鉴定：当菌株被分离出来，应先进行革兰染色。革兰染色是细菌鉴定的关键之一，为防止错判染色结果，导致错误的鉴定方向，可用新鲜的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌标准菌株与待检菌株放在同一玻璃片上，以确保待检菌株染色结果的真实性.同时还应做3%KOH拉丝试验，待检菌拉丝试验阳性为革兰阴性杆菌.6565l室间质量控制方法：重点是冻干菌株的复活。冻干菌株一般用无 分支杆菌为强抗酸菌，用1%盐酸酒精脱色，而怒卡菌为弱抗酸菌则用1%硫酸酒精脱色。分支杆菌的涂片包括金胺-罗丹明法和妻-尼法。金胺-罗丹明法阳性后，要用妻-尼法确证。实验室要掌握多种染色方法，以防漏检.66 66l分支杆菌为强抗酸菌，用1%盐酸酒精脱色，而怒卡菌为弱抗酸 分分离离鉴鉴定定：当菌株被分离出来后，就要坚持正确鉴定程序，这一点对能否将质控菌株做出正确鉴定至关重要。可按操作规程方法进行鉴定，也可采用数字编码方法。做好菌株的鉴定。还要掌握一些关键性试验，如：动力试验，氧化酶试验，触酶试验，耐盐试验，O/F试验，吲哚试验，苯丙氨酸托氨酶试验，CAMP试验，硫化氢试验。4，22，44及CO2生长试验等。还应掌握不常见菌的关键性鉴定，如产单核细胞李斯特菌22-25有动力，37无动力，在血平板上形成较小的狭窄溶血环的菌落，触酶阳性，CAMP试验阳性。6767l分离鉴定：当菌株被分离出来后，就要坚持正确鉴定程序，l小肠结肠炎耶尔森菌耐低温，4-40均能生长，37时阴性。嗜麦芽窄食单胞菌，氧化酶阴性，DNA酶阳性，赖氨酸脱羧酶阳性，七叶苷阳性，在麦康凯平皿上的菌落无色或不扩散的淡黄色色素等等。我们不但要掌握这关键性试验，还应了解某些细菌所具有特性，还能以灵活组合的方式用于细菌鉴定。虽然实验室的试剂完备和鉴定仪器等对做好质控有很大帮助，但是检验人员的基础知识，基本技术掌握的水平也是很重要的。对培养基的选择，分离技术，（在先进的仪器也需要提供纯的菌落才能鉴定）操作步骤是否正确，对结果的判定和解释都十分重要。如果这些掌握不好，用仪器也会鉴定错误。6868l小肠结肠炎耶尔森菌耐低温，4-40均能生长，37时阴性 注注意意事事项项：l 校正好室内质控物，才能保证室间质控l 尽量使收到的冻干菌株存活l 要坚持正确的鉴定程序l 认真填写好回报单（菌名、革兰染色、仪器、试剂、主要生化鉴定）细菌室的工作需要室间质控来评估，室间质控不仅仅是简单的考核，而是用最新的知识来教育提高细菌室的整体水平.参加质控不仅是为了好的成绩，更重要的是为临床更好的服务.6969l注意事项：校正好室内质控物，才能保证室间质控69N N N NC C C CC C C CL L L LS S S S M M M M1 1 1 10 0 0 00 0 0 0-S S S Sl l l l4 4 4 4文文文文件件件件中中中中有有有有关关关关质质质质控控控控方方方方面面面面的的的的修修修修改改改改：l药敏试验用品来自新邮件或新批号要进行一天质控试验；来自新的厂家的MIC试验用品要进行20-30天质控试验l影响药敏试验的新的软件要进行5天质控试验，而且要监测本室所有正在使用的抗生素l添加任何新的未曾用过的抗生素需要有20-30天的满意的质控试验结果l仪器修理好后质控1天；更换仪器硬件，如阅读器、温箱、质控20-30天.这些试验亦可与常规药敏同时进行，质控结果合格，常规结果也合格.变更接种物制备方法/使用仪器设备。从目测的方法改为用光度计测量浊度要质控5天.7070lNCCLSM100-Sl4文件中有关质控方面的修改：药敏NGGLS 2004年 M100-S14文件药敏试验解释标准主要更新内容：l革兰阴性杆菌的主要改变：革兰阴性杆菌的主要改变：沙门菌与氟喹诺酮类：肠道外分离的沙门菌要加测奈丁酸的敏感性.对奈丁酸耐药而对氟喹诺酮类敏感菌株，应告知临床医生用氟喹诺酮类治疗可能无效或疗效慢.7171lNGGLS2004年M100-S14文件药敏试验解释标准 纸片扩散法与嗜麦芽窄食单胞菌：嗜麦芽窄食单胞菌对3种抗生素有自己 明确的解释标准：1.对 米 诺 环 素 的 解 释 标 准 为 14R,19S;2.对磺胺复合剂的解释标准为10R 16S,3.对左氧氟沙星的解释标准为13R,17S。72 72l纸片扩散法与嗜麦芽窄食单胞菌：嗜麦芽窄食单胞菌对 纸片扩散法与洋葱博克菌：洋葱博克菌对3种抗生素有自己明确的 解释标准（孵育时间20-24h）:l对米诺环素的解释标准为 14R,19S l对头孢他啶的解释标准为17R,21S l对美洛培南的解释标准为15R,20S。7373l纸片扩散法与洋葱博克菌：73l左氧氟沙星在铜绿假单胞菌及非发酵菌中再定位：鉴于左氧氟沙星对铜绿假单胞菌及非发酵菌有较好的体内和体外活性，将他由尿组（U组）提升至B组.B组菌为临床重要致病菌和引起医院感染的病菌.l葡萄球菌的主要改变：葡萄球菌用头孢西丁代替苯唑西林检出MRSA。100S14中增加用30g/片的头孢西丁纸片进行纸片扩散试验，结果预报mecA介导的MRSA耐药。7474l左氧氟沙星在铜绿假单胞菌及非发酵菌中再定位：鉴于左氧氟沙星对纸片扩散法用头孢西丁筛选MRSA（mm）菌名头孢西丁（30g/片）苯唑西林RSRS 金葡 19 20 10 13 凝固酶阴性 24 25 17 18 葡萄球菌 头孢西丁对金黄色葡萄球菌纸片扩散法抑菌圈直径19mm应报告对苯唑西林耐药，20 mm应报告对苯唑 西林敏感。头孢西丁对凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径24 mm应报告对苯唑西林耐药，25mm应报告对苯唑西林敏感。75 75l纸片扩散法用头孢西丁筛选MRSA（mm）理由：头孢西丁代替苯唑西林检测mecA基因介导的MRSA,其特异性和敏感性均提高了。从而减少了非mecA基因介导的假MRSA。结果优于苯唑西林纸片的结果。结果清晰，读起来比苯唑西林容易。l粪肠球/亚胺培南的报告：M100-S14文件中增加“氨苄西林敏感性可用于预报粪肠球菌对亚胺培南的敏感性”内容。例如1株来自血的粪肠球菌分离株，万古霉素敏感，庆大霉素高度敏感，但氨苄西敏感，即应加写亚胺培南敏感。此条不包括屎肠球菌。7676l理由：头孢西丁代替苯唑西林检测mecA基因介导的MRSAlNGGLS 2004年 M100-S14文件药敏试验解释标准，是我们每一个临床微生物实验室做药敏试验的方法，试验步骤，抗生素的选择，及实验结果的解释，是得到了全世界的认可。是我们目前应不折不扣执行的一个标准。l要使微生物的报告成为临床医生诊断感染患者及应用抗生素依赖性的指标，还存在着相当大的差距。由于微生物实验室的特殊性，它不可能像其他指标那样在很短时间内报告结果，因此微生物实验室的另一个重要任务是定期的向临床科室报告病原学鉴定结果，及细菌对抗生素的耐药结果，这个结果要保证它的准确性和科学性。7777lNGGLS2004年M100-S14文件药敏试验解释标准l这些数据会成为临床医生在得到病原学确切诊断及药物敏感试验结果之前参考用要依据。还可以使临床医生对本院引起感染的常见细菌及抗生素的耐药性有较为全面的了解。7878l这些数据会成为临床医生在得到病原学确切诊断及药物敏感试验结果谢谢 谢谢 ！79l谢谢！