细菌感染病原学诊断课件

细菌感染的病原学诊断细菌感染的病原学诊断1细菌感染的病原学诊断1 （一）标本的采集（一）标本的采集要求：要求：1.1.早期采集：尽量在发病早期、应用抗生素之前采集早期采集：尽量在发病早期、应用抗生素之前采集2.2.根据标本的种类及可能的目的菌的特性选择不同的根据标本的种类及可能的目的菌的特性选择不同的标本采集方法标本采集方法3.3.无菌采集：严格无菌操作，采集后标本置于无菌容无菌采集：严格无菌操作，采集后标本置于无菌容器，且不得接触任何抗菌物质和消毒剂器，且不得接触任何抗菌物质和消毒剂4.4.标本采集要足量标本采集要足量5.5.安全采集安全采集一、临床标本的采集一、临床标本的采集及及处理原则处理原则2 （一）标本的采集一、临床标本的采集及处理原则2（二）标本的运送、保存（二）标本的运送、保存及及处理处理 标本采集后应尽快送检，厌氧菌必须在标本采集后应尽快送检，厌氧菌必须在2h内送检。内送检。1.床边接种床边接种2.置于保存液或转运培养基中送检置于保存液或转运培养基中送检3.针对可能存在的病原体的特点对标本进行冷藏、针对可能存在的病原体的特点对标本进行冷藏、保温或保持厌氧状态进行送检保温或保持厌氧状态进行送检4.标本送检过程中应注意安全标本送检过程中应注意安全3（二）标本的运送、保存及处理 标本采集后应尽快送检，厌氧菌n不染色标本检查法不染色标本检查法n染色标本检查法染色标本检查法二、细菌的形态学检查二、细菌的形态学检查4不染色标本检查法二、细菌的形态学检查4主要用于观察细菌的动力及其运动状态主要用于观察细菌的动力及其运动状态1.1.悬滴法滴法2.压滴法压滴法3.毛细管法毛细管法4.4.暗暗视野野显微微镜检查检查法法5.5.相差相差显微微镜检查法检查法（一）不染色细菌标本的检查（一）不染色细菌标本的检查5主要用于观察细菌的动力及其运动状态（一）不染色细菌标本的检查细菌染色标本的制作程序细菌染色标本的制作程序 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色（二）细菌染色标本的检查（二）细菌染色标本的检查6细菌染色标本的制作程序（二）细菌染色标本的检查6（1 1）单染色法）单染色法 只用一种染料色的方法只用一种染料色的方法 制片制片结晶紫结晶紫1min1min水洗水洗晾干、油镜检晾干、油镜检（2 2）复染色法）复染色法 革兰染色法（革兰染色法（Gram stainGram stain）抗酸染色法（抗酸染色法（acid-fast stainacid-fast stain）（3 3）特殊结构染色法）特殊结构染色法3.3.细菌常用的染色方法细菌常用的染色方法7（1）单染色法 只用一种染料色的方法3.细菌常用的染色方法革兰染色法（革兰染色法（Gram stainGram stain）方法（改良快速法）方法（改良快速法）初染：初染：结晶紫等量结晶紫等量NaHCO3 35s，水洗，水洗 媒染：媒染：碱性碘液碱性碘液 35s，水洗，水洗 脱色：脱色：丙酮酒精丙酮酒精 35s，水洗，水洗 复染：复染：碱性稀释复红碱性稀释复红 35s，水洗，水洗8革兰染色法（Gram stain）方法（改良快速法）8结果结果 紫色：革兰阳性菌紫色：革兰阳性菌 红色：革兰阴性菌红色：革兰阴性菌9结果 红色：革兰阴性菌9原理原理方法方法 （ZiehlZiehlNeelsenNeelsen染色法）染色法）初染：初染：5 5石碳酸复红石碳酸复红 加温加温 染染 3 35min 5min，水洗，水洗 脱色：脱色：3%3%盐酸酒精盐酸酒精 1 min 1 min，水洗，水洗 复染：碱性美兰复染：碱性美兰 1 min 1 min，水洗，水洗抗酸染色法（抗酸染色法（acid-fast stainacid-fast stain）10原理 初染：5石碳酸复红 加温 染 35min，结果结果p红色：抗酸性细菌红色：抗酸性细菌p蓝色：非抗酸性细菌蓝色：非抗酸性细菌注意事项注意事项p 一张玻片只能涂染一份标本一张玻片只能涂染一份标本p 不能使用染色缸不能使用染色缸p 染色关键：脱色时间的长短染色关键：脱色时间的长短11结果注意事项11特殊结构染色法特殊结构染色法q荚膜染色（荚膜染色（capsule staincapsule stain）q芽胞染色（芽胞染色（spore stainspore stain）q鞭毛染色（鞭毛染色（flagellumflagellum stain stain）12特殊结构染色法12细菌的接种细菌的接种及及分离培养技术分离培养技术13细菌的接种及分离培养技术13一、培养基（一、培养基（culture mediumculture medium）（一）定义（一）定义 用人工方法将适合细菌生长需要的各种营养物用人工方法将适合细菌生长需要的各种营养物质配制成的混合营养制品。质配制成的混合营养制品。14一、培养基（culture medium）（一）定义14n营养物质营养物质 氮源、碳源、无机盐类、生长因子等氮源、碳源、无机盐类、生长因子等n凝固物质凝固物质 琼脂、明胶、卵白蛋白等琼脂、明胶、卵白蛋白等n抑制剂抑制剂 抗生素、化学物质、染料等抗生素、化学物质、染料等n指示剂指示剂 酚红、溴甲酚紫、中性红等酚红、溴甲酚紫、中性红等（二）培养基的组成成分（二）培养基的组成成分15营养物质 氮源、碳源、无机盐类、生长因子等（二）培养基的组成n按用途分类按用途分类n基础培养基础培养基（基（basic medium）牛肉汤、普通琼脂平板）牛肉汤、普通琼脂平板 n营养培养基（营养培养基（nutrient medium）血琼脂平板、巧克力）血琼脂平板、巧克力血平板血平板n鉴别培养基鉴别培养基(differential medium)糖发酵管、糖发酵管、KIA、MIUn选择培养基（选择培养基（selective medium）SS琼脂、麦康凯琼脂琼脂、麦康凯琼脂n特殊培养基（特殊培养基（special medium）厌氧菌培养基、细菌）厌氧菌培养基、细菌L型培养基型培养基（三）培养基的种类（三）培养基的种类16按用途分类（三）培养基的种类16n按物理性状分类按物理性状分类 q固体（平板、斜面、高层）固体（平板、斜面、高层）q半固体半固体q液体液体17按物理性状分类 17（一）接种工具（一）接种工具 接种环接种环及及接种针接种针二、细菌的接种二、细菌的接种及及分离技术分离技术18（一）接种工具二、细菌的接种及分离技术18（二）细菌的接种方法（二）细菌的接种方法1.平板划线分离法平板划线分离法n 用于细菌标本的分离纯化。用于细菌标本的分离纯化。19（二）细菌的接种方法192.琼脂斜面接种法琼脂斜面接种法 n主要用于单个菌落的纯培主要用于单个菌落的纯培养及保存菌种，也可用于养及保存菌种，也可用于某些生化鉴定试验的接种。某些生化鉴定试验的接种。202.琼脂斜面接种法 203.穿刺接种法穿刺接种法n用于半固体培养基或用于半固体培养基或KIA、明胶等具有高层的培养基接明胶等具有高层的培养基接种。种。n半固体培养基的穿刺接种可半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。用于观察细菌的动力。213.穿刺接种法用于半固体培养基或KIA、明胶等具有高层的培n用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。糖发酵管等的接种。4.液体接种法液体接种法22用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。4.5.倾注平板法倾注平板法 n细菌定量培养细菌定量培养 6.6.涂布法涂布法nL L棒涂布。棒涂布。n增菌培养、活菌计数、药敏试验等。增菌培养、活菌计数、药敏试验等。23 5.倾注平板法 6.涂布法23四、细菌的培养方法四、细菌的培养方法1.需氧培养（普通培养）需氧培养（普通培养）需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下进行的培养需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下进行的培养普通普通孵育箱孵育箱37 C 1824h观察培养结果观察培养结果 平板平板已接种好的已接种好的 斜面斜面 试管试管n 少数生长缓慢的细菌需要培少数生长缓慢的细菌需要培养养37d直至直至1个月才能生长。个月才能生长。24四、细菌的培养方法1.需氧培养（普通培养）普通孵育箱观察培2.二氧化碳培养二氧化碳培养 将已接种培养基置于将已接种培养基置于5%10%CO2环境中进环境中进行培养的方法。行培养的方法。（2）烛缸培养：简单）烛缸培养：简单易行，不需特殊设备，易行，不需特殊设备，尤其适用于基层实验室。尤其适用于基层实验室。（1）二氧化碳培养箱：）二氧化碳培养箱：能自动调节能自动调节CO2的含量、的含量、温度和湿度。温度和湿度。252.二氧化碳培养 （2）烛缸培养：简单易行，不需特殊设备3.厌氧培养厌氧培养 n厌氧菌对厌氧菌对O O2 2敏感，培养过程中需造成低氧化还原电敏感，培养过程中需造成低氧化还原电势的厌氧环境。势的厌氧环境。q物理法、化学法、生物法。物理法、化学法、生物法。q厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧菌共生厌氧法等。菌共生厌氧法等。263.厌氧培养 26五、细菌的生长现象五、细菌的生长现象 细菌的菌落特征细菌的菌落特征:n菌落大小菌落大小n形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）n高度（突起、扁平或凹陷）高度（突起、扁平或凹陷）n边缘（整齐、波形、锯齿状、卷发状等）边缘（整齐、波形、锯齿状、卷发状等）n表面（光滑、粗糙等）表面（光滑、粗糙等）n湿润度（干燥、湿润等）湿润度（干燥、湿润等）n透明度（不透明、半透明、透明等）透明度（不透明、半透明、透明等）n颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、黄色或无色等）颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、黄色或无色等）n溶血性（溶血性（溶血、溶血、溶血或溶血或溶血）溶血）n特殊气味特殊气味27五、细菌的生长现象 细菌的菌落特征:2728282929半固体观察半固体观察动力阴性动力阴性动力阳性动力阳性30半固体观察动力阴性动力阳性30n表面菌膜生长表面菌膜生长n均匀混浊生长均匀混浊生长n沉淀生长沉淀生长细菌在液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象31表面菌膜生长细菌在液体培养基中的生长现象31细菌的生化反应细菌的生化反应32细菌的生化反应32不同细菌具有不同的酶系统，对糖和蛋白质不同细菌具有不同的酶系统，对糖和蛋白质的分解能力不同，因而其代谢产物也各异。据的分解能力不同，因而其代谢产物也各异。据此可利用生物化学方法检测这些代谢产物以区此可利用生物化学方法检测这些代谢产物以区别和鉴定不同细菌。别和鉴定不同细菌。原理原理33不同细菌具有不同的酶系统，对糖和蛋白质的分解能力不同，因而其1.糖（醇、苷）类发酵试验糖（醇、苷）类发酵试验一、碳水化合物代谢试验一、碳水化合物代谢试验 用途用途 糖发酵试验是鉴定细菌最常用的生化反应，特别用于肠糖发酵试验是鉴定细菌最常用的生化反应，特别用于肠杆菌科细菌的鉴定。杆菌科细菌的鉴定。341.糖（醇、苷）类发酵试验一、碳水化合物代谢试验 用途342.2.氧化氧化/发酵试验（发酵试验（O OF F试验）试验）又又 称称 葡葡 萄萄 糖糖 代代 谢谢 类类 型型 鉴鉴 别别 试试 验验 或或 Hugh-Hugh-LeifsonLeifson（HLHL）试验）试验分解葡萄糖分解葡萄糖 氧化型氧化型分解葡萄糖分解葡萄糖 发酵型发酵型不分解葡萄糖不分解葡萄糖 产碱型产碱型有氧有氧有氧或无氧有氧或无氧有氧或无氧有氧或无氧细菌细菌n 原理原理352.氧化/发酵试验（OF试验）又称葡萄糖代谢类型鉴别试 产碱型产碱型 发酵型发酵型 氧化型氧化型n用途用途 主要用于革兰阴性杆菌的鉴别。肠杆菌科细菌均为发酵型，主要用于革兰阴性杆菌的鉴别。肠杆菌科细菌均为发酵型，非发酵菌通常为氧化型或产碱型。非发酵菌通常为氧化型或产碱型。葡萄球菌和微球菌的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型。葡萄球菌和微球菌的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型。36 产碱型 发酵型 阳性阳性 培养基变黑培养基变黑阴性阴性 培养基不变色培养基不变色 用途用途 主要用于主要用于D D群链球菌群链球菌及及其他链球菌的鉴别，前者其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于肠杆菌科、其他革兰阴性阳性，后者阴性。也可用于肠杆菌科、其他革兰阴性菌及厌氧菌的鉴别。菌及厌氧菌的鉴别。3.七叶苷水解试验七叶苷水解试验37阳性 培养基变黑 用途3.七叶苷水解试验374.4.甲基红（甲基红（MRMR）试验）试验细菌细菌葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸 醇、酮、醛等醇、酮、醛等 培养基培养基 pHpH5.45.4甲酸、乙酸、乳酸等甲酸、乙酸、乳酸等 培养基培养基 pHpH4.44.4甲基红指示剂甲基红指示剂 pHpH4.5 4.5 变为红色变为红色 pHpH5.4 5.4 变为黄色变为黄色 用途用途 主要用于大肠埃希菌和产气肠杆主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。n原理原理384.甲基红（MR）试验细菌葡萄糖丙酮酸 醇、酮、醛等 5.VP5.VP试验试验细菌细菌脱羧脱羧KOH-2H二乙酰二乙酰胍基胍基红色化合物红色化合物葡萄糖葡萄糖乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 COCO2 2丙酮酸丙酮酸 用途用途 本试验常本试验常及及MRMR试验一起使用，通常两者结试验一起使用，通常两者结果相反。果相反。MR VPMR VP 大肠埃希菌大肠埃希菌 产气肠杆菌产气肠杆菌 395.VP试验细菌脱羧KOH-2H二乙酰胍基红色化合物葡萄糖二、蛋白质和氨基酸的代谢试验二、蛋白质和氨基酸的代谢试验1.1.吲哚试验（靛基质试验）吲哚试验（靛基质试验）n原理原理 色氨酸色氨酸 吲哚（靛基质）吲哚（靛基质）细菌细菌对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛（柯氏试剂）（柯氏试剂）玫瑰吲哚玫瑰吲哚（红色）（红色）n用途用途 主要用于主要用于肠杆菌科杆菌科细菌的菌的鉴定。定。40二、蛋白质和氨基酸的代谢试验1.吲哚试验（靛基质试验）细菌对2.2.硫化氢试验硫化氢试验n 原理原理含硫氨基酸含硫氨基酸细菌细菌硫化氢硫化氢Fe2+（或或Pb2+）FeS（PbS）（黑色）（黑色）n 用途用途 常用于肠杆菌科菌属间的鉴定。常用于肠杆菌科菌属间的鉴定。412.硫化氢试验 原理含硫氨基酸细菌硫化氢Fe2+（或Pb2+3.3.尿素酶试验尿素酶试验n原理原理 NH2OC 2H2O (NH4)2CO3 2NH3CO2 H2O NH2 细菌（脲酶）细菌（脲酶）（尿素）（尿素）（碳酸铵）（碳酸铵）（培养基（培养基pH）n用途用途 主要用于肠道杆菌科的鉴定。主要用于肠道杆菌科的鉴定。变形杆菌属为。变形杆菌属为。423.尿素酶试验原理细菌（脲酶）（尿素）（碳酸铵）（培养基pH4.4.苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验n 原理原理 苯丙氨酸苯丙氨酸 苯丙酮酸苯丙酮酸NH3细菌（苯丙氨酸脱氨酶）细菌（苯丙氨酸脱氨酶）Fe+绿色化合物绿色化合物n 用途用途 主要用于肠杆菌科的鉴定。主要用于肠杆菌科的鉴定。434.苯丙氨酸脱氨酶试验 原理细菌（苯丙氨酸脱氨酶）Fe+三、碳源和氮源利用试验三、碳源和氮源利用试验枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验n原理原理 某某些些细细菌菌能能利利用用枸枸橼橼酸酸钠钠作作为为唯唯一一碳碳源源获获得得能能量量，并并利利用用铵铵盐盐作作为为唯唯一一氮氮源源，因因而而能能在在枸枸橼橼酸酸盐盐培培养养基基上上生生长长，分分解解枸枸橼橼酸酸盐盐生成碳酸钠和氨，使培养基变为碱性。生成碳酸钠和氨，使培养基变为碱性。44三、碳源和氮源利用试验枸橼酸盐利用试验44n结果结果 培养基变蓝为阳性，不变色为阴性。培养基变蓝为阳性，不变色为阴性。n用途用途 用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别。用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别。45结果用途45IMViCIMViC试验试验I I 吲哚试验吲哚试验M MRM MR试验试验V VPV VP试验试验C C 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验用于肠道杆菌的鉴定用于肠道杆菌的鉴定 I MR VP CI MR VP C 大肠埃希菌大肠埃希菌 产气肠杆菌产气肠杆菌 +46IMViC试验I 吲哚试验 四、呼吸酶类试验四、呼吸酶类试验1.1.氧化酶试验氧化酶试验n原理原理还原型细胞色素还原型细胞色素C C 氧化型细胞色素氧化型细胞色素C C 细菌（细胞色素氧化酶）细菌（细胞色素氧化酶）对苯二胺对苯二胺醌类化合物醌类化合物（WursterWurster氏蓝）氏蓝）n试剂试剂 1%1%盐酸四甲基对苯二胺盐酸四甲基对苯二胺 或或 1%1%盐酸二甲基对苯二胺盐酸二甲基对苯二胺试剂试剂47四、呼吸酶类试验1.氧化酶试验细菌（细胞色素氧化酶）对苯二胺n结果结果 细细菌菌10s10s内内呈呈深深紫紫色色（或或深深蓝蓝色色）为为阳阳性性，不变色为阴性。不变色为阴性。四甲基对苯二胺四甲基对苯二胺二甲基对苯二胺二甲基对苯二胺48结果四甲基对苯二胺二甲基对苯二胺48n用途用途（1）革兰阴性杆菌的鉴定：肠杆菌科均呈阴性，）革兰阴性杆菌的鉴定：肠杆菌科均呈阴性，大多数非发酵菌呈阳性。大多数非发酵菌呈阳性。（2）奈瑟菌属的鉴定：奈瑟菌属为阳性）奈瑟菌属的鉴定：奈瑟菌属为阳性。n注意事项注意事项 试验时避免接触含铁物质，不能用接种环取菌。试验时避免接触含铁物质，不能用接种环取菌。49用途492.2.过氧化氢酶试验（过氧化氢酶试验（触酶试验）触酶试验）n原理原理 细菌（过氧化氢酶）细菌（过氧化氢酶）2H2O2 2H2OO2用途用途 常用于革兰阳性球菌的初步分常用于革兰阳性球菌的初步分群。葡萄球菌属和微球菌属为阳群。葡萄球菌属和微球菌属为阳性，链球菌属和肠球菌为阴性。性，链球菌属和肠球菌为阴性。502.过氧化氢酶试验（触酶试验）原理用途50五、抑菌试验五、抑菌试验1.1.杆菌肽试验杆菌肽试验n原理原理 A A群群溶溶血血性性链链球球菌菌对对杆杆菌菌肽肽几几乎乎100%100%敏敏感感，而其它链球菌对杆菌肽通常耐药。而其它链球菌对杆菌肽通常耐药。n 用途用途 鉴别鉴别A A群和非群和非A群链球菌的重要试验，群链球菌的重要试验，A A群链球菌为阳性，其他群链球菌为群链球菌为阳性，其他群链球菌为阴性。阴性。51五、抑菌试验1.杆菌肽试验 用途512.2.奥普托欣（奥普托欣（Optochin Optochin）敏感试验）敏感试验n原理原理 Optochin(Optochin(乙基氢化羟基奎宁乙基氢化羟基奎宁)能干扰肺炎链能干扰肺炎链球菌叶酸合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌球菌叶酸合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对对OptochinOptochin敏感，而其它链球菌对其耐药。敏感，而其它链球菌对其耐药。n用途用途 用于肺炎链球菌和甲型链球用于肺炎链球菌和甲型链球菌的鉴别。菌的鉴别。肺炎链球菌肺炎链球菌为阳性，为阳性，甲型链球菌为阴性。甲型链球菌为阴性。522.奥普托欣（Optochin）敏感试验原理用途52六、其他生化试验六、其他生化试验1.凝固酶试验凝固酶试验n原理原理 致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶：结合凝固酶致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶：结合凝固酶（或凝聚因子）和游离凝固酶。（或凝聚因子）和游离凝固酶。游离凝固酶游离凝固酶 凝血酶样物质凝血酶样物质（凝血酶原）（凝血酶原）协同因子协同因子纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白纤维蛋白 （试管法）（试管法）结合凝固酶结合凝固酶纤维蛋白纤维蛋白 （玻片法（玻片法）纤维蛋白原纤维蛋白原53六、其他生化试验1.凝固酶试验 游离凝固酶 n结果结果 玻片法：对照侧无凝集颗粒玻片法：对照侧无凝集颗粒 血浆侧出现明显凝集颗粒血浆侧出现明显凝集颗粒 阳性阳性n用途用途 用于葡萄球菌的鉴定，常作为鉴定葡萄球菌致病性的用于葡萄球菌的鉴定，常作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标。重要指标。试管法：试管法：血浆凝固、不流动血浆凝固、不流动 阳性阳性54结果阳性用途试管法：542.2.胆汁溶菌试验胆汁溶菌试验n原理原理 胆盐或胆汁能溶解肺炎链球菌。胆盐或胆汁能溶解肺炎链球菌。n用途用途 主要用于肺炎链球菌主要用于肺炎链球菌及及草绿色链球菌的鉴别。肺草绿色链球菌的鉴别。肺炎链球菌阳性，草绿色链球菌阴性。炎链球菌阳性，草绿色链球菌阴性。552.胆汁溶菌试验原理用途55血清学试验血清学试验56血清学试验56血清学检测的原理血清学检测的原理：未知未知 已知已知 血清学鉴定（确诊，细菌定种、定型）血清学鉴定（确诊，细菌定种、定型）已知已知 未知未知 血清学诊断（协助诊断）血清学诊断（协助诊断）Ag AbAg-Ab57血清学检测的原理：未知 已知 血清学鉴定（确诊，1.表面抗原表面抗原 荚膜多糖抗原荚膜多糖抗原 K抗原抗原 Vi抗原抗原2.菌体抗原（菌体抗原（O抗原）抗原）3.鞭毛抗原（鞭毛抗原（H抗原）抗原）4.菌毛抗原菌毛抗原 目前尚未用于细菌鉴定目前尚未用于细菌鉴定特异性抗原特异性抗原：细菌鉴定：细菌鉴定及及分群（型）的主要依据分群（型）的主要依据类属抗原或共同抗原类属抗原或共同抗原：非特异性交叉反应的原因：非特异性交叉反应的原因细菌的抗原物质：细菌的抗原物质：58 1.表面抗原 荚膜多糖抗原 K抗原 Vi抗原1.1.玻片凝集试验玻片凝集试验n 原理原理 用用诊诊断断血血清清（已已知知抗抗体体）在在载载玻玻片片上上直直接接及及待待检检菌菌混混合合，若若有有相相应应细细菌菌，则则可可出出现现肉肉眼眼可可见见的的凝凝集集颗颗粒粒，借借以鉴定细菌。以鉴定细菌。n方法方法细菌细菌诊断血清诊断血清生理盐水生理盐水混匀混匀13min观察结果观察结果（一）凝集反应（一）凝集反应一、血清学鉴定一、血清学鉴定591.玻片凝集试验细菌诊断血清生理盐水混匀观察结果（一）凝集反n结果结果阳性阳性试验侧出现凝集颗粒，对照侧均匀混浊；试验侧出现凝集颗粒，对照侧均匀混浊；阴性阴性试验侧试验侧及及对照侧均为均匀混浊；对照侧均为均匀混浊；自凝自凝试验侧及对照侧均出现凝集颗粒。试验侧及对照侧均出现凝集颗粒。n 用途用途 用于鉴定菌种及菌型。用于鉴定菌种及菌型。n 评价评价 本法简便、快速、特异性强，是鉴定细菌最常用的方法。本法简便、快速、特异性强，是鉴定细菌最常用的方法。60结果 用途602.反相间接凝集试验反相间接凝集试验 n原理原理 已知已知AbAb颗粒性载体颗粒性载体 Ag 颗粒凝集颗粒凝集 （致敏颗粒）（致敏颗粒）（未知）（未知）n方法方法 常用方法有反相间接红细胞凝集试验和胶乳凝集试常用方法有反相间接红细胞凝集试验和胶乳凝集试验。验。n评价评价 敏感性高且易于观察结果，是一种敏感快速的方法。敏感性高且易于观察结果，是一种敏感快速的方法。可用于检测微量抗原可用于检测微量抗原。612.反相间接凝集试验 原理方法61（二）荚膜肿胀试验（二）荚膜肿胀试验 n原理原理 当特异性抗血清当特异性抗血清及及相应细菌的荚膜抗原特相应细菌的荚膜抗原特异性结合，形成复合物时，可使细菌荚膜显著异性结合，形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大，呈肿胀现象。增大，呈肿胀现象。n方法方法 待检菌抗血清染料待检菌抗血清染料待检菌正常兔血清染料待检菌正常兔血清染料室温室温510min镜检镜检62（二）荚膜肿胀试验 原理 当特异性抗血清及相应细菌的荚膜n结果结果 阳性阳性 在红色细菌周围可见厚薄不等、边界清晰的无色在红色细菌周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物，而在对照侧无此现象；环状物，而在对照侧无此现象；阴性阴性 试验侧试验侧及及对照侧均不产生无色环状物。对照侧均不产生无色环状物。n 应用应用 本试验常用于肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、流感本试验常用于肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌的检测及分型。嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌的检测及分型。63结果 应用 63（三）制动试验（三）制动试验n原理原理 抗鞭毛抗体抗鞭毛抗体及及鞭毛抗原结合，使鞭毛强直、鞭毛抗原结合，使鞭毛强直、相互粘着而失去动力，细菌运动停止。相互粘着而失去动力，细菌运动停止。n方法方法 抗血清抗血清室温室温 510min悬滴观察细悬滴观察细菌运动菌运动悬滴观察悬滴观察细菌运动细菌运动 菌悬液菌悬液 64（三）制动试验原理 抗血清悬滴观察细菌运动悬滴观察细菌运动 n结果结果 阳性阳性 细菌运动停止，菌体凝集成块细菌运动停止，菌体凝集成块 阴性阴性 细菌运动无改变细菌运动无改变n注意事项注意事项 抗血清中不能加防腐剂。抗血清中不能加防腐剂。n应用应用 常用于运动活泼细菌的快速鉴定，如霍乱弧常用于运动活泼细菌的快速鉴定，如霍乱弧菌的鉴定。菌的鉴定。65结果65二、血清学诊断二、血清学诊断 用已知抗原检测病人血清中的相应抗体，以诊断感染用已知抗原检测病人血清中的相应抗体，以诊断感染性疾病的方法。性疾病的方法。n用途用途 作为某些传染病的辅助诊断，尤其对某些病原体作为某些传染病的辅助诊断，尤其对某些病原体不能培养或难于培养的感染性疾病，可以提供诊断依据。不能培养或难于培养的感染性疾病，可以提供诊断依据。血清学诊断主要适用于病程较长的传染病的诊断。血清学诊断主要适用于病程较长的传染病的诊断。n结果判断结果判断 一般作血清学诊断时，需取患者急性期和恢一般作血清学诊断时，需取患者急性期和恢复期双份血清标本，若后者的抗体效价比前者有复期双份血清标本，若后者的抗体效价比前者有4 4倍或倍或4 4倍以增长上才有诊断意义。倍以增长上才有诊断意义。66二、血清学诊断 用已知抗原检测病人血清中的相应抗体，病毒感染的病原学检查病毒感染的病原学检查67病毒感染的病原学检查67病毒感染的实验诊断方法病毒感染的实验诊断方法 病原学诊断病原学诊断 显微镜检查显微镜检查病毒分离培养病毒分离培养及及鉴定鉴定抗原检测抗原检测核酸检测核酸检测血清学诊断血清学诊断 抗体检测抗体检测 IgM、IgG68病毒感染的实验诊断方法 病原学诊断 68一、标本采集、运送和处理一、标本采集、运送和处理（一）标本采集（一）标本采集n采集时间：尽早采集（越早越好）采集时间：尽早采集（越早越好）n标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择标本种类择标本种类n无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理n血清学检查标本：双份血清血清学检查标本：双份血清69一、标本采集、运送和处理（一）标本采集69（二）标本的运送（二）标本的运送及及保存保存1.低温送检低温送检q 4可保存数小时，可保存数小时，-70可长期保存可长期保存q对冷冻标本应避免反复冻融对冷冻标本应避免反复冻融2.保湿送检保湿送检50%甘油盐水保存送检甘油盐水保存送检 病毒转运培养基（病毒转运培养基（virus transport medium，VTM）含）含0.5%明胶或牛血清白蛋白的明胶或牛血清白蛋白的Hanks液液3.无菌送检无菌送检70（二）标本的运送及保存1.低温送检70二、病毒形态学检查二、病毒形态学检查1.光学显微镜光学显微镜 仅用于大病毒颗粒和包涵体的检查。仅用于大病毒颗粒和包涵体的检查。简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后不形成包涵体不形成包涵体狂犬病毒胞浆内包涵体狂犬病毒胞浆内包涵体（内基小提）（内基小提）巨细胞病毒胞核内包涵体巨细胞病毒胞核内包涵体71二、病毒形态学检查1.光学显微镜狂犬病毒胞浆内包涵体（内基小2.电镜及免疫电镜电镜及免疫电镜直接检查标本中的病毒颗粒，快速，直接检查标本中的病毒颗粒，快速，可确诊。但敏感性低（可确诊。但敏感性低（106/ml）免疫电镜敏感性高，但只能用于已免疫电镜敏感性高，但只能用于已知病毒的检测）知病毒的检测）乙型肝炎病毒电镜图 轮状病毒电镜图 722.电镜及免疫电镜直接检查标本中的病毒颗粒，快速，可确诊。3.病毒大小的测定方法病毒大小的测定方法（1）电子显微镜直接测量）电子显微镜直接测量（2）超过滤法）超过滤法（3）超速离心法）超速离心法733.病毒大小的测定方法73（一）病毒分离和鉴定的一般程序（一）病毒分离和鉴定的一般程序 动物接种动物接种组织培养组织培养标本采集标本采集标本处理后接种标本处理后接种鸡胚接种鸡胚接种卵黄囊膜卵黄囊膜尿囊液尿囊液羊膜腔液羊膜腔液绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜观察囊膜病变观察囊膜病变血凝试验血凝试验血凝抑制试验血凝抑制试验CPEEM包涵体包涵体空斑试验空斑试验红细胞吸附红细胞吸附中和试验中和试验观察发病观察发病抗原检测抗原检测抗体检测抗体检测病理检查病理检查三、病毒的分离三、病毒的分离及及鉴定鉴定74（一）病毒分离和鉴定的一般程序 动物接种组织培养标本采集标本（二）病毒的分离（二）病毒的分离n鸡胚培养鸡胚培养n动物接种动物接种n组织培养组织培养75（二）病毒的分离鸡胚培养751.动物接种动物接种常常用用动动物物 小小鼠鼠、大大白白鼠鼠、豚豚鼠鼠、家家兔兔、猴猴等等。不不同同病病对对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。接种途径接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：n乙型脑炎病毒及狂犬病毒乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种小鼠脑内接种n柯萨奇病毒柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种乳鼠腹腔接种n乙肝病毒乙肝病毒 黑猩猩静脉注射黑猩猩静脉注射n流感病毒流感病毒 鼻腔滴种鼻腔滴种用途用途n分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清761.动物接种常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不2.鸡胚培养鸡胚培养常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养接种途径及方法接种途径及方法 新鲜受精卵新鲜受精卵 接种病毒接种病毒3839713d卵黄囊接种卵黄囊接种羊膜腔接种羊膜腔接种尿囊腔接种尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种772.鸡胚培养常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养38绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤78绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤783.3.组织培养组织培养n将将人人或或动动物物离离体体的的活活组组织织或或分分散散的的活活细细胞胞在在体体外外人人工工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。组织培养的类型组织培养的类型（1）组织块培养）组织块培养（2）器官培养）器官培养 人胚气管呼吸道病毒；人胚气管呼吸道病毒；人胚肠人胚肠 肠道病毒肠道病毒（3）细胞培养最常用）细胞培养最常用793.组织培养将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控原原代代和和次次代代细细胞胞培培养养 对对病病毒毒敏敏感感，但但制制备备费费时时费费力力，只能传只能传23代。代。二二倍倍体体细细胞胞培培养养 原原代代细细胞胞反反复复传传代代（4050代代）仍仍保保持持二二倍倍体体染染色色体体特特性性。病病毒毒分分离离和和疫疫苗苗制制备备的的首首选选细胞株细胞株。传传代代细细胞胞培培养养 来来源源于于肿肿瘤瘤细细胞胞或或突突变变的的二二倍倍体体细细胞胞，常用于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。常用于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。8080（三）病毒的鉴定（三）病毒的鉴定病毒的初步鉴定病毒的初步鉴定n动物感染范围及潜伏期动物感染范围及潜伏期n对鸡胚的敏感性对鸡胚的敏感性n在细胞培养中的表现在细胞培养中的表现n理化性质的测定理化性质的测定最后鉴定最后鉴定n血血清清学学鉴鉴定定:中中和和试试验验、补补体体结结合合试试验验、血血凝凝抑抑制制试验等试验等81（三）病毒的鉴定病毒的初步鉴定81病毒在细胞培养中的表现病毒在细胞培养中的表现（1）细胞代谢作用改变）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化）（培养液颜色变化）n正常细胞代谢：正常细胞代谢：培养液由红变黄培养液由红变黄n病病毒毒增增殖殖，抑抑制制细细胞胞代代谢谢：培培养养液液颜颜色色不不变变或或更更红红82病毒在细胞培养中的表现（1）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化 病病毒毒在在细细胞胞内内增增殖殖后后，使使宿宿主主的的形形态态发发生生不不同同程程度度改改变变，这这种种由由病病毒毒增增殖殖引引起起的的细细胞胞形形态态变变化化，称为细胞病变效应。称为细胞病变效应。（2）细胞病变（）细胞病变（cytopathic effect，CPE）细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。某些病毒感染细胞后不出现某些病毒感染细胞后不出现CPE83病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发生不同程度改变，这种由病毒848485858686（4）干扰现象干扰现象当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。象。鼻病毒鼻病毒无无CPE鼻鼻V.Poli.V无无CPEPoli.V有有CPE87（4）干扰现象鼻病毒Poli.V87（5）红细胞吸附及吸附抑制试验）红细胞吸附及吸附抑制试验 受受感感染染的的宿宿主主细细胞胞膜膜含含病病毒毒抗抗原原（血血凝凝素素），可可吸吸附鸡、豚鼠或猴红细胞附鸡、豚鼠或猴红细胞 如如果果在在培培养养瓶瓶中中加加入入相相应应的的血血凝凝素素抗抗血血清清，则则不不出出现现红红细细胞胞吸吸附附现现象象，即即红红细细胞吸附抑制试验阳性胞吸附抑制试验阳性88（5）红细胞吸附及吸附抑制试验 受感染的宿主细（6）血凝及血凝抑制试验）血凝及血凝抑制试验 含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于分型。抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于分型。89（6）血凝及血凝抑制试验 含有血凝素的病毒能吸附一定种类的新分离病毒的鉴定新分离病毒的鉴定（1）病毒的大小及形态）病毒的大小及形态（2）核酸类型）核酸类型:5-溴溴-2-脱氧尿苷（脱氧尿苷（BUDR）能抑）能抑 制制DNA复制，而不抑制复制，而不抑制RNA病毒。病毒。（3）乙醚敏感试验）乙醚敏感试验:有包膜病毒对乙醚敏感，经有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性乙醚作用后，失去感染性（4）耐酸试验）耐酸试验 肠道病毒耐酸，在肠道病毒耐酸，在pH3的环境下的环境下稳定，鼻病毒不耐酸，在稳定，鼻病毒不耐酸，在pH3的环境下被灭活的环境下被灭活90新分离病毒的鉴定（1）病毒的大小及形态90病毒的血清学鉴定病毒的血清学鉴定n中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等91病毒的血清学鉴定中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等91四、病毒的血清学诊断四、病毒的血清学诊断单份血清单份血清IgM测定测定 早期诊断早期诊断双份血清双份血清IgG测定测定 4倍以上增长，有诊断意义倍以上增长，有诊断意义92四、病毒的血清学诊断单份血清IgM测定 早期诊断92五、病毒的分子生物学检测五、病毒的分子生物学检测 多种分子生物学方法。检测以不同形式存在的多种分子生物学方法。检测以不同形式存在的病毒基因片断。敏感、特异、简便、快速，标病毒基因片断。敏感、特异、简便、快速，标本用量少。本用量少。n核酸电泳技术核酸电泳技术n核酸杂交技术核酸杂交技术nPCRn基因芯片技术基因芯片技术93五、病毒的分子生物学检测 多种分子生物学方法。检测以不同形真菌感染的病原学诊断真菌感染的病原学诊断94真菌感染的病原学诊断94 以直接镜检和分离培养为主以直接镜检和分离培养为主不染色标本检查不染色标本检查染色标本检查染色标本检查标本直接检查标本直接检查分离培养分离培养生化反应生化反应动物学试验动物学试验显微镜检查显微镜检查 抗原检测抗原检测95 以直接镜检和分离培养为主不染色标本检查染色标本检查标本直接一、标本采集一、标本采集 毛发毛发 皮皮(甲甲)屑屑 痰痰 血血 脑脊液脑脊液 分泌物分泌物 穿穿刺液刺液96一、标本采集96二、二、直接镜检直接镜检（一）（一）不染色标本检查不染色标本检查 直直接接采采取取标标本本制制片片、置置显显微微镜镜下下观观察察，若若发发现现真真菌菌菌菌丝丝或或孢孢子子存存在在时时，即即可可初初步步判判定定为为真真菌菌感染。感染。标本封固液标本封固液 低倍或高倍显微镜低倍或高倍显微镜 封固液封固液97二、直接镜检（一）不染色标本检查封固液97 KOH溶液：适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、溶液：适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）指甲、鳞屑等）墨汁：墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌）主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌）生理盐水：观察真菌的出芽现象，生理盐水：观察真菌的出芽现象，脓汁、尿液、脑脊液脓汁、尿液、脑脊液等也可用。等也可用。水合氯醛石炭酸乳酸封固液：透明力较强，只限于水合氯醛石炭酸乳酸封固液：透明力较强，只限于不透明的标本。不透明的标本。98 KOH溶液：适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、9999100100新生隐球菌（墨汁负染）新生隐球菌（墨汁负染）101新生隐球菌（墨汁负染）101（二）染色标本检查（二）染色标本检查n革革兰兰染染色色 各各种种真真菌菌均均为为革革兰兰阳阳性性。常常用用于于深深部部感感染染真真菌的的染色检查。菌的的染色检查。n乳乳酸酸酚酚棉棉蓝蓝染染色色 适适用用于于各各种种真真菌菌的的直直接接检检查查。真真菌菌被被染成蓝色。染成蓝色。n糖糖原原染染色色 菌菌体体均均染染成成红红色色。用用于于标标本本直直接接涂涂片片及及组组织织病理切片染色。病理切片染色。n荧光染色荧光染色 可用于直接涂片、培养涂片及组织切片。可用于直接涂片、培养涂片及组织切片。102（二）染色标本检查革兰染色 各种真菌均为革兰阳性。常用于深部白假丝酵母菌革兰染色103白假丝酵母菌革兰染色103104104105105三、三、真菌的分离培养真菌的分离培养是目前鉴定真菌的唯一方法。是目前鉴定真菌的唯一方法。常用培养基为沙保培养基（常用培养基为沙保培养基（2228）n深部真菌可用血琼脂培养基或脑心葡萄糖血深部真菌可用血琼脂培养基或脑心葡萄糖血琼脂培养基置琼脂培养基置37培养培养106三、真菌的分离培养是目前鉴定真菌的唯一方法。106真菌常用培养方法真菌常用培养方法 1.试管斜面培养：最常用。常用于分离培养、试管斜面培养：最常用。常用于分离培养、菌种保存。菌种保存。2.大培养：常用于纯种的培养、研究。大培养：常用于纯种的培养、研究。3.小培养：可有效观察真菌的结构（菌丝、孢小培养：可有效观察真菌的结构（菌丝、孢子）及生长发育，用于菌种鉴定。子）及生长发育，用于菌种鉴定。107真菌常用培养方法107四、真菌鉴定四、真菌鉴定形态特点：菌丝、孢子及某些特殊结构的特征形态特点：菌丝、孢子及某些特殊结构的特征菌落特点：包括生长速度、菌落性质、菌落形态、大菌落特点：包括生长速度、菌落性质、菌落形态、大小及颜色小及颜色特殊试验：芽管形成试验特殊试验：芽管形成试验生化试验：主要用于深部感染真菌的鉴定生化试验：主要用于深部感染真菌的鉴定动物试验动物试验抗原检测抗原检测核酸检测核酸检测毒素检测毒素检测108四、真菌鉴定形态特点：菌丝、孢子及某些特殊结构的特征108