细胞生物学研究思路基础医学课件

细胞生物学研究思路基胞生物学研究思路基础医学医学细胞生物学研究思路基础医学细胞生物学研究思路基础医学细胞生物1 细胞生物学与遗传学细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组成员肿瘤研究小组成员黄辰黄辰教授教授博士博士 侯妮侯妮 讲师讲师 博士博士刘利英刘利英高级实高级实验师验师博士博士 杨娟杨娟 副教授副教授 博士博士陈妍珂陈妍珂副教授副教授博士博士赵凌宇赵凌宇讲师讲师博士博士刘颖勋刘颖勋讲师讲师博士博士秦棪楠秦棪楠讲师讲师博士博士郭波郭波讲师讲师博士博士王鲁敏王鲁敏讲师讲师博士博士王晓霏王晓霏实验室实验室硕士硕士 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组成员黄辰 侯妮刘2 细胞生物学与遗传学细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究平台肿瘤研究小组研究平台实验室建设模块实验室建设模块大型仪器检测室大型仪器检测室普通功能实验室普通功能实验室动物饲养室动物饲养室形态学检测形态学检测细胞生物学细胞生物学分子生物学分子生物学流式细胞仪流式细胞仪激光共聚激光共聚焦显微镜焦显微镜图像分析系统图像分析系统定量定量PCRPCR膜片钳膜片钳蛋白组学蛋白组学芯片点样芯片点样杂交系统杂交系统激光捕获显激光捕获显微切割系统微切割系统小动物活小动物活体成像系统体成像系统动物行为学动物行为学 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究平台实验室建设模3 细胞生物学与遗传学细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组实验环境肿瘤研究小组实验环境 技术集成（开设高端生物医学实验课程）技术集成（开设高端生物医学实验课程）一站式的科研基地（实现功能实验室与大型仪器联动）一站式的科研基地（实现功能实验室与大型仪器联动）严格管理与人性化统一严格管理与人性化统一 宽松学术氛围与严谨科学态度宽松学术氛围与严谨科学态度 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组实验环境 技术集成（4 细胞生物学与遗传学细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组肿瘤研究小组研究方向研究方向1.1.心理应激与疾病心理应激与疾病 建立了恐惧声音心理应激模型建立了恐惧声音心理应激模型 探索了心理应激与肿瘤发生关系探索了心理应激与肿瘤发生关系 探索了心理应激对学习记忆的生物学效应探索了心理应激对学习记忆的生物学效应 探索了心理应激对雄性生殖的生物学效应探索了心理应激对雄性生殖的生物学效应 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向心理应激与疾5 细胞生物学与遗传学细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组肿瘤研究小组研究方向研究方向2.2.肿瘤发生发展机制肿瘤发生发展机制 非编码非编码RNARNA与肿瘤的关系与肿瘤的关系 肿瘤的表观遗传学调控机制（肿瘤的表观遗传学调控机制（MECP2MECP2）RNARNA结合蛋白、结合蛋白、mRNAmRNA与非编码与非编码RNARNA的相互作用在肿瘤中的相互作用在肿瘤中 的网络调控的网络调控 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向2.肿瘤发生6 细胞生物学与遗传学细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组肿瘤研究小组研究方向研究方向3.3.生物标志物筛选生物标志物筛选 肿瘤血清标志物的筛选肿瘤血清标志物的筛选 自闭症血清标志物的筛选自闭症血清标志物的筛选 高原习服标志物的筛选高原习服标志物的筛选 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向3.生物标志7 细胞生物学与遗传学细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组肿瘤研究小组研究方向研究方向4.4.糖修饰组学在疾病中的作用糖修饰组学在疾病中的作用 肿瘤糖修饰组学肿瘤糖修饰组学 自闭症糖修饰组学自闭症糖修饰组学 高原习服糖修饰组学高原习服糖修饰组学 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向4.糖修饰组8 科学研究是科学工作者的幸福源泉科学研究是科学工作者的幸福源泉幸福就在于人的感性幸福就在于人的感性生活，在于感性欲望生活，在于感性欲望的满足与快乐。的满足与快乐。幸福的过程有神经递幸福的过程有神经递质的释放（多巴胺与质的释放（多巴胺与内啡肽）。内啡肽）。科学研究的幸福可以科学研究的幸福可以自我掌控。自我掌控。科学研究是科学工作者的幸福源泉幸福就在于人的感性生活，在于9为什么科学研究是一种痛苦？为什么科学研究是一种痛苦？课题死了么？课题死了么？课题死了么？课题死了么？1.1.1.1.结论已经发表结论已经发表结论已经发表结论已经发表 2.2.2.2.推理已经证实推理已经证实推理已经证实推理已经证实 3.3.3.3.技术已经应用技术已经应用技术已经应用技术已经应用 4.4.4.4.实验无法实现实验无法实现实验无法实现实验无法实现 5.5.5.5.时间不够用时间不够用时间不够用时间不够用发散思维发散思维发散思维发散思维为什么科学研究是一种痛苦？课题死了么？发散思维10从科学的痛苦到科学的幸福的基础从科学的痛苦到科学的幸福的基础创新性创新性创新性创新性可读性可读性可读性可读性信息量信息量信息量信息量文献内容文献内容文献内容文献内容 解决问题解决问题解决问题解决问题 创新之处创新之处创新之处创新之处 意义所在意义所在意义所在意义所在 技术实现技术实现技术实现技术实现 文章理念文章理念文章理念文章理念 文献内容是否文献内容是否文献内容是否文献内容是否支持作者观点支持作者观点支持作者观点支持作者观点自身研究自身研究自身研究自身研究 研究方向研究方向研究方向研究方向 最终目标最终目标最终目标最终目标 实验技能实验技能实验技能实验技能 课题技巧课题技巧课题技巧课题技巧思考思考思考思考消化消化消化消化从科学的痛苦到科学的幸福的基础创新性可读性信息量文献内容自身11 如何将科学研究的痛苦变成幸福？如何将科学研究的痛苦变成幸福？跟踪性研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路横向移植的研究横向移植的研究横向移植的研究横向移植的研究纵向连接的研究纵向连接的研究纵向连接的研究纵向连接的研究A A A AB B B BE E E EA A A AC C C CE E E EA A A AD D D DE E E EA A A AB B B B源头源头源头源头跟踪模仿跟踪模仿跟踪模仿跟踪模仿B B B BC C C C源头源头源头源头跟踪模仿跟踪模仿跟踪模仿跟踪模仿A A A AB B B BC C C C将科学研究变得简单将科学研究变得简单将科学研究变得简单将科学研究变得简单 如何将科学研究的痛苦变成幸福？跟踪性研究思路横向移植的研究12 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路 发现某基因发现某基因发现某基因发现某基因在肝癌组织中表在肝癌组织中表在肝癌组织中表在肝癌组织中表达增高，并有很达增高，并有很达增高，并有很达增高，并有很多机制多机制多机制多机制研究样本差异研究样本差异研究样本差异研究样本差异 查文献后，确定查文献后，确定查文献后，确定查文献后，确定在乳腺癌中尚无人涉在乳腺癌中尚无人涉在乳腺癌中尚无人涉在乳腺癌中尚无人涉及。及。及。及。SCISCISCISCI处女作出炉：处女作出炉：处女作出炉：处女作出炉：某基因在乳腺癌组织某基因在乳腺癌组织某基因在乳腺癌组织某基因在乳腺癌组织中表达增高。中表达增高。中表达增高。中表达增高。已发表内容已发表内容已发表内容已发表内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现某基因在肝癌组织中表13 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路 发现辛伐他汀有发现辛伐他汀有发现辛伐他汀有发现辛伐他汀有某种作用，能够治疗某种作用，能够治疗某种作用，能够治疗某种作用，能够治疗某种临床疾病，且对某种临床疾病，且对某种临床疾病，且对某种临床疾病，且对其原理进行了研究，其原理进行了研究，其原理进行了研究，其原理进行了研究，找到了相关基因。找到了相关基因。找到了相关基因。找到了相关基因。药物处理差异药物处理差异药物处理差异药物处理差异 联想到了阿托伐联想到了阿托伐联想到了阿托伐联想到了阿托伐他汀。他汀。他汀。他汀。SCISCISCISCI处女作出炉：处女作出炉：处女作出炉：处女作出炉：阿托伐他汀对某疾病阿托伐他汀对某疾病阿托伐他汀对某疾病阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用的治疗效果及其作用的治疗效果及其作用的治疗效果及其作用机制。机制。机制。机制。已发表内容已发表内容已发表内容已发表内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现辛伐他汀有某种作用，14 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路 发现某基因具发现某基因具发现某基因具发现某基因具有抗氧化应激的作有抗氧化应激的作有抗氧化应激的作有抗氧化应激的作用用用用机制相似性机制相似性机制相似性机制相似性 联想到氧化应激在联想到氧化应激在联想到氧化应激在联想到氧化应激在好多疾病的病理机制中好多疾病的病理机制中好多疾病的病理机制中好多疾病的病理机制中都发挥作用，比如糖尿都发挥作用，比如糖尿都发挥作用，比如糖尿都发挥作用，比如糖尿病肾病、糖尿病神经病病肾病、糖尿病神经病病肾病、糖尿病神经病病肾病、糖尿病神经病变等等。变等等。变等等。变等等。SCISCISCISCI处女作出处女作出处女作出处女作出炉：某基因在糖尿病肾炉：某基因在糖尿病肾炉：某基因在糖尿病肾炉：某基因在糖尿病肾病中的作用。病中的作用。病中的作用。病中的作用。已发表内容已发表内容已发表内容已发表内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现某基因具有抗氧化应激15 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路 发现发现发现发现A A A A基因具有基因具有基因具有基因具有某种作用。某种作用。某种作用。某种作用。信号通路信号通路信号通路信号通路 联想到联想到联想到联想到A A A A基因的基因的基因的基因的上游或下游基因是上游或下游基因是上游或下游基因是上游或下游基因是B B B B基因，是否也有这种基因，是否也有这种基因，是否也有这种基因，是否也有这种作用？作用？作用？作用？SCISCISCISCI处女作出处女作出处女作出处女作出炉：炉：炉：炉：B B B B基因具有某种基因具有某种基因具有某种基因具有某种作用。作用。作用。作用。已发表内容已发表内容已发表内容已发表内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现A基因具有某种作用。16 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路问题问题问题问题1 1 1 1：肿瘤的表观调控：肿瘤的表观调控：肿瘤的表观调控：肿瘤的表观调控 研究思路跟踪性研究思路问题1：肿瘤的表观调控17 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路问题问题问题问题2 2 2 2：MeCP2MeCP2MeCP2MeCP2在胃癌中的作用如何？在胃癌中的作用如何？在胃癌中的作用如何？在胃癌中的作用如何？研究思路跟踪性研究思路问题2：MeCP2在胃癌中的作用18 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路问题问题问题问题3 3 3 3：什么分子调控了：什么分子调控了：什么分子调控了：什么分子调控了MeCP2MeCP2MeCP2MeCP2？研究思路跟踪性研究思路问题3：什么分子调控了MeCP219 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路问题问题问题问题4 4 4 4：MeCP2MeCP2MeCP2MeCP2调控了什么分子？调控了什么分子？调控了什么分子？调控了什么分子？染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀(CHIP-on-chip)(CHIP-on-chip)(CHIP-on-chip)(CHIP-on-chip)研究思路跟踪性研究思路问题4：MeCP2调控了什么分子20 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路假设与结果假设与结果假设与结果假设与结果 研究思路跟踪性研究思路假设与结果21 研究思路研究思路跟踪性研究思路跟踪性研究思路 发现某种药发现某种药发现某种药发现某种药物能够对物能够对物能够对物能够对TNF-TNF-TNF-TNF-产生影响。产生影响。产生影响。产生影响。家族基因家族基因家族基因家族基因 拜读大作后，联拜读大作后，联拜读大作后，联拜读大作后，联想到想到想到想到IL-6IL-6IL-6IL-6以及以及以及以及CRPCRPCRPCRP都是都是都是都是炎症因子，有可能这炎症因子，有可能这炎症因子，有可能这炎症因子，有可能这种药物对种药物对种药物对种药物对IL-6IL-6IL-6IL-6以及以及以及以及CRPCRPCRPCRP也有影响。也有影响。也有影响。也有影响。SCISCISCISCI处女作处女作处女作处女作出炉：某种药物对出炉：某种药物对出炉：某种药物对出炉：某种药物对IL-IL-IL-IL-6 6 6 6以及以及以及以及CRPCRPCRPCRP的影响。的影响。的影响。的影响。已发表内容已发表内容已发表内容已发表内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现某种药物能够对TNF22 研究思路研究思路基于技术跟踪的新探索基于技术跟踪的新探索各种组学各种组学各种组学各种组学不同样本不同样本不同样本不同样本不同处理不同处理不同处理不同处理生物信息分析生物信息分析生物信息分析生物信息分析靶分子验证靶分子验证靶分子验证靶分子验证问题的解释问题的解释问题的解释问题的解释 研究思路基于技术跟踪的新探索各种组学不同样本不同处理生23 研究思路研究思路基于技术跟踪的新探索基于技术跟踪的新探索收集临床样本RNADNAProteinmicroRNA芯片基因芯片组织芯片RT-PCR或Real-time PCRWestern-blot免疫组化基因表达差异确定目的基因参考文献microRNA研究 研究思路基于技术跟踪的新探索收集临床样本RNADNAP24 研究思路研究思路基于技术跟踪的新探索基于技术跟踪的新探索问题问题问题问题1 1 1 1：自闭症诊断困难：自闭症诊断困难：自闭症诊断困难：自闭症诊断困难兴趣范围狭窄和兴趣范围狭窄和兴趣范围狭窄和兴趣范围狭窄和刻板的行为模式刻板的行为模式刻板的行为模式刻板的行为模式语言交流障碍语言交流障碍语言交流障碍语言交流障碍社会交往障碍社会交往障碍社会交往障碍社会交往障碍 研究思路基于技术跟踪的新探索问题1：自闭症诊断困难兴趣25 研究思路研究思路基于技术跟踪的新探索基于技术跟踪的新探索问题问题问题问题2 2 2 2：自闭症的遗传因素复杂：自闭症的遗传因素复杂：自闭症的遗传因素复杂：自闭症的遗传因素复杂 研究思路基于技术跟踪的新探索问题2：自闭症的遗传因素复26 研究思路研究思路基于技术跟踪的新探索基于技术跟踪的新探索问题问题问题问题3 3 3 3：为什么自闭症有共同的特征？：为什么自闭症有共同的特征？：为什么自闭症有共同的特征？：为什么自闭症有共同的特征？研究思路基于技术跟踪的新探索问题3：为什么自闭症有共同27 研究思路研究思路基于技术跟踪的新探索基于技术跟踪的新探索问题问题问题问题4 4 4 4：如何寻找自闭症的生物标志物？：如何寻找自闭症的生物标志物？：如何寻找自闭症的生物标志物？：如何寻找自闭症的生物标志物？生物生物生物生物芯片芯片芯片芯片或磁珠或磁珠或磁珠或磁珠化学化学化学化学芯片芯片芯片芯片或磁珠或磁珠或磁珠或磁珠疏疏疏疏水芯片水芯片水芯片水芯片 阳阳阳阳离子交换离子交换离子交换离子交换金属金属金属金属芯片芯片芯片芯片亲水芯片亲水芯片亲水芯片亲水芯片 抗抗抗抗原原原原-抗体抗体抗体抗体受受受受体体体体-配体配体配体配体DNA-ProteinDNA-ProteinDNA-ProteinDNA-Protein阴阴阴阴离子交换离子交换离子交换离子交换PS10 or PS20PS10 or PS20PS10 or PS20PS10 or PS20 研究思路基于技术跟踪的新探索问题4：如何寻找自闭症的生28Choose diseaseBoth tumor patients and health controls Collecting samplesserumSample quality is very important Blood samples were collected by trained phlebotomist,and processed within a few hours according to a standard protocol.Aliquots of sera for mass spectrometric analysis were frozen at-80 immediately after processing.Separation proteins by The liquid chip ClinProt BeadsClinProt BeadsClinProt BeadshydrophobicityMB-HIC 1MB-HIC 3 MB-HIC 8MB-HIC 18weak anion and weak cationMB-WCXMB-WAXmetal ions MB-IMAC-FeMB-IMAC-CuChoose diseaseCollecting sampl29Mass spectrum analysisMass spectrum analysis30峰质量变化倍数基因名称鉴定序列43881.971.78SERPINA5SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP64089.211.61FGAGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV84208.051.73ASLFVAEFLFWASLCM*THLSRM*AEDLILYCTKEFSFVQ表1 串联质谱鉴定的可能的ASD相关蛋白 l研究结果研究结果研究结果研究结果峰质量变化倍数基因名称鉴定序列43881.971.78SER31新的问题或未解决的问题新的问题或未解决的问题新的问题或未解决的问题新的问题或未解决的问题所有技术为我所用所有技术为我所用所有技术为我所用所有技术为我所用 研究思路研究思路基于新现象观察下的新探索基于新现象观察下的新探索新的问题或未解决的问题所有技术为我所用 研究思路基于新现32 基因功能的分析基因功能的分析基因功能研究基因功能研究目的基因表达调控目的基因表达调控细胞水平细胞水平动物水平动物水平活性周期运动分化衰老凋亡.模式动物药物处理药物处理临床样本收集临床样本收集组织水平组织水平动物组织稳定细胞系稳定细胞系药物处理药物处理成瘤实验成瘤实验.免疫组化qPCRWB.基因功能的分析基因功能研究目的基因表达调控细胞水平动物水平33 按照论文结构的实验设计按照论文结构的实验设计分子准备工作、前期初分子准备工作、前期初步实验结果引入步实验结果引入细胞细胞/组织水平现象组织水平现象作用机制切入作用机制切入作用机制深入作用机制深入可选：可选：1.1.模式细胞模式细胞/动物验证动物验证2.2.旁通机制旁通机制3.3.临床样本验证临床样本验证4.4.模式图模式图 DiagramDiagram1 12 23 34 45 56 6qPCRqPCRWBWBWBWBWBWBRNAiRNAiIFIFFCMFCMIHCIHCDrugsDrugsMorphologyMorphology 按照论文结构的实验设计分子准备工作、前期初步实验结果引入细34 基因突变与沉默技术RNAip19901990年，年，JorgensenJorgensen将色素的基因导入矮牵牛将色素的基因导入矮牵牛(petunias)(petunias)，发现了共抑制现象发现了共抑制现象 (cosuppression)(cosuppression)。p19951995年，年，GuoGuo等应用等应用par Ipar I基因的反义基因的反义RNARNA处理线虫产生了处理线虫产生了par par I I 基因功能缺失型或基因敲除型的表型。基因功能缺失型或基因敲除型的表型。p19981998年，年，Fire Fire 和和 Mello Mello 证实证实GuoGuo发现的正义发现的正义RNARNA或反义或反义RNARNA诱诱导基因表达抑制是由微量导基因表达抑制是由微量dsRNA dsRNA 而引起。提出而引起。提出RNARNA干涉干涉(RNA(RNA interference,RNAi)interference,RNAi)的概念。的概念。基因突变与沉默技术RNAi1990年，Jorgense35 基因突变与沉默技术RNAiDouble-stranded RNAinjectC.elegansNeg.control UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998 391:806-811Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridizationAndrew Z.Fire(Stanford University photo)Craig C.Mello(University of Massachusetts Medical School)基因突变与沉默技术RNAiDouble-strande36 基因突变与沉默技术RNAidsRNAdsRNA22nt siRNAs22nt siRNAstargettargetmRNAmRNAsecondary secondary siRNAssiRNAsamplificationamplificationprocessingprocessingdegradationdegradationrecognitionrecognitioncopyingcopying+processingprocessingspreadingspreading 基因突变与沉默技术RNAidsRNA22nt siR37 基因突变与沉默技术RNAiC.elegansDrosophilaArabidopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1 基因突变与沉默技术RNAiC.elegansDros38 基因突变与沉默技术RNAiC.elegansDrosophilaArabidopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1 基因突变与沉默技术RNAiC.elegansDros39Initiation StepATPATPADP+ppiADP+ppiDICERDICERKINASEKINASERdRPRdRPInitiation StepATPATPADP+ppi40DicerDicer41siRNA55335533RISCsiRNA5353RISC42Effector Step siRNA bindingsiRNA binding siRNA unwindingsiRNA unwinding RISC activationRISC activationEffector StepsiRNA binding43 基因突变与沉默技术RNAi研究案例研究案例小英家系小英家系小英的心电图小英的心电图显性负效应显性负效应 基因突变与沉默技术RNAi研究案例小英家系小英的心电图44 基因突变与沉默技术RNAi研究案例研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例45 基因突变与沉默技术RNAi研究案例研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例46 基因突变与沉默技术RNAi研究案例研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例47 基因突变与沉默技术RNAi研究案例研究案例H Heart Rhythm.eart Rhythm.2013,10 2013,10（1 1）：）：128136128136 基因突变与沉默技术RNAi研究案例Heart Rhyt48 基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术 锌指核酸酶是锌指蛋白和锌指核酸酶是锌指蛋白和FokIFokI核酸内切酶的剪切结构核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白域组成的嵌合融合蛋白,其锌指蛋白结构域负责识别靶位其锌指蛋白结构域负责识别靶位点点,依赖依赖FokIFokI的作用打断的作用打断DNADNA双链双链,从而造成双链断裂，断从而造成双链断裂，断开的双链开的双链DNADNA在修复过程中会发生碱基的缺失、插入、同源在修复过程中会发生碱基的缺失、插入、同源交换等突变。交换等突变。基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术 锌指核酸酶49 基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术锌指核酸酶：锌指核酸酶：锌指蛋白锌指蛋白Fokl+识别区域识别区域酶切区域酶切区域u靶点选择受限。靶点选择受限。u“上下文效应上下文效应”。uOff-targetingOff-targeting现象严重现象严重 。uZFNs ZFNs 的合成组装技术难度大的合成组装技术难度大。基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术锌指核酸酶：锌指蛋50 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术2009 2009 年，年，BochBoch等和等和MoscouMoscou等破解黄单胞菌效应子蛋白等破解黄单胞菌效应子蛋白 TALETALE（transcription activator-like effectorstranscription activator-like effectors）与）与寄主靶基因寄主靶基因 DNADNA特异性识别分子密码。特异性识别分子密码。20112011年年Sangamo BioSciencesSangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用小组分别利用TALENsTALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研技术进行了基因组靶向修饰相关研究。究。基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术2009 年，51 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术TALE nuclease结构结构DNADNA识别区（识别区（TALETALE蛋白）蛋白）：TALETALE蛋白是由植物病原体黄单胞蛋白是由植物病原体黄单胞菌属分泌的一种蛋白菌属分泌的一种蛋白,能特异性的识别并结合能特异性的识别并结合 DNA DNA 序列。序列。剪切结构域（剪切结构域（FoklFokl）：FoklFokl则可通过二聚化产生核酸内切酶则可通过二聚化产生核酸内切酶活性活性,在该序列附近造成在该序列附近造成 DNA DNA 的双链断裂的双链断裂(Double-stand(Double-stand break,DSB)break,DSB)。基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALE nu52 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术TALE蛋白蛋白TALETALE蛋白蛋白是由是由1212个或以上特异性识别个或以上特异性识别DNADNA的串联的串联“蛋白模块蛋白模块”和两侧的和两侧的N-N-末端及末端及C-C-末端序列组末端序列组成成。每个每个“蛋白模块蛋白模块”包含包含3434个氨基酸，第个氨基酸，第1212和和1313位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的变的双连氨基酸残基双连氨基酸残基位点位点（Repeat Variant Repeat Variant Di-residue,RVDDi-residue,RVD）。每个蛋白模块每个蛋白模块上上RVDsRVDs对应对应识别一个碱基。识别一个碱基。基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALE蛋白T53 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术Fokl 核酸内切酶核酸内切酶TALENsZFNsFoklFokl酶只有形成二聚体时才具有酶切活性，所以每次必酶只有形成二聚体时才具有酶切活性，所以每次必须设计一对须设计一对TALENsTALENs，在实际操作中需在目标基因中选择，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔两处相邻（间隔1717碱基）的靶序列（一般十几个碱基）碱基）的靶序列（一般十几个碱基）分别进行分别进行TALETALE识别模块构建。识别模块构建。TALENsTALENs和和ZFNsZFNs使用相同的使用相同的FoklFokl酶。酶。基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术Fokl 核酸54 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术基因敲除步骤基因敲除步骤-TALE TALE 靶点识别模块构建靶点识别模块构建 Four basic single-unit vectors 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤-55 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术基因敲除步骤基因敲除步骤-TALE TALE 靶点识别模块构建靶点识别模块构建 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤-56 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术基因敲除步骤基因敲除步骤 TALENs TALENs质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其可分别找到其DNADNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个两个TALENsTALENs融合蛋白中的融合蛋白中的FokIFokI功能域形成二聚体，发挥功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。诱发诱发DNADNA损伤修复机制，主要有非同源末端连接损伤修复机制，主要有非同源末端连接（NHEJNHEJ）和同源直接修复（）和同源直接修复（HDRHDR）。在此修过程中形成）。在此修过程中形成一定的插入或缺失突变，即形成目标基因敲除突变体。一定的插入或缺失突变，即形成目标基因敲除突变体。基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤 57 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术TALENsTALENs的优势的优势TALETALE的核酸识别单元与的核酸识别单元与A A、G G、C C、T T有恒定的对应关系。有恒定的对应关系。靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。中的任意靶序列。无基因序列、细胞、物种限制。无基因序列、细胞、物种限制。毒性低、脱靶情况少。毒性低、脱靶情况少。成对的成对的TALETALE识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALENs的58 基因突变、敲除与沉默技术TALENsTALENs技术技术TALENsTALENs的应用领域的应用领域 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALENs的59 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术CRISPR-CasCRISPR-Cas：由：由RNARNA指导指导CasCas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。蛋白对靶向基因进行修饰的技术。基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI60 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术CRISPRCRISPR结构结构CRISPR：clustered regularly interspaced short palindromic repeats 是一个特殊的是一个特殊的DNADNA重复序列家族重复序列家族,广泛分布于细菌和古细广泛分布于细菌和古细菌基因组中。菌基因组中。CRISPR CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列组成位点通常由短的高度保守的重复序列组成,重复序列的长度通常重复序列的长度通常 2121 48 bp,48 bp,重复序列之间被重复序列之间被 26 26 72 bp 72 bp 间隔序列隔开。间隔序列隔开。CRISPRCRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别。进行识别。基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI61 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术CasCas家族家族CasCas（CRISPR associatedCRISPR associated）：）：存在于存在于CRISPRCRISPR位点附近，是一种双链位点附近，是一种双链DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引导下对靶位点进行切割。它与引导下对靶位点进行切割。它与folkfolk酶功能类似，酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术Cas62 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术CRISPR-CasCRISPR-Cas系统的细胞内免疫作用系统的细胞内免疫作用 CRISPR-Cas CRISPR-Cas系统赋予原核细系统赋予原核细胞针对外源胞针对外源DNADNA特异性免疫特异性免疫,而而这种特异性是由间隔序列决定的。这种特异性是由间隔序列决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了菌进化了CRISPR CRISPR 介导的适应性介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR CRISPR 间隔序列的动态性变化，间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列来实即通过增加或删除间隔序列来实现的。现的。基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI63 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术PAMPAM（protospacer-adjacent motifprotospacer-adjacent motif）为）为NGGNGG。在人类基因组中，在人类基因组中，平均每平均每8bp8bp就出现一个就出现一个NGG PAMNGG PAM。基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术PAM64 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术PAMPAM（protospacer-adjacent motifprotospacer-adjacent motif）为）为NGGNGG。基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术PAM65 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术CRISPR-CasCRISPR-Cas系统介导基因修饰系统介导基因修饰 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI66 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术CRISPR-CasCRISPR-Cas系统介导基因修饰系统介导基因修饰dual-RNAdual-RNA 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI67 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术CRISPR-CasCRISPR-Cas系统介导基因修饰系统介导基因修饰sg-RNAsg-RNACas9sg-RNA 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI68 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-CasCRISPR-Cas技术技术CRISPR-CasCRISPR-Cas系统介导基因修饰系统介导基因修饰cr-RNAcr-RNA 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI69谢谢大家！谢谢大家！70