细胞培养技术课件

春来花开艳，春来花开艳，蜜蜂采蜜忙！蜜蜂采蜜忙！6/29/20241春来花开艳，8/11/20231请欣赏请欣赏6/29/20242请欣赏8/11/20232三、体外细胞生长的基本条件三、体外细胞生长的基本条件(一一)细胞接种量细胞接种量(二）维持、促进细胞生长、繁殖的物质二）维持、促进细胞生长、繁殖的物质1.1.无机离子：无机离子：NaNa+、K K+、CaCa2+2+、ClCl-、POPO4 43-3-、SOSO4 42-2-2.2.氨基酸：氨基酸：3.3.碳水化合物：常用葡萄糖碳水化合物：常用葡萄糖 4.4.维生素：维持细胞生长的生物活性物质维生素：维持细胞生长的生物活性物质 5.5.蛋蛋白白质质：必必不不可可少少的的成成分分，动动物物血血清清是是蛋蛋白白质质的的来源来源6/29/20243三、体外细胞生长的基本条件(一)细胞接种量8/11/20三、体外细胞生长的基本条件三、体外细胞生长的基本条件(三）酸碱度：三）酸碱度：最适最适pHpH为为7.07.07.47.4，细胞能，细胞能承受的范围是承受的范围是6.66.67.87.8。细胞抗酸能力。细胞抗酸能力比抗碱能力好。比抗碱能力好。(四）气体条件：四）气体条件：O2和和CO2(五五)温温度度：一一般般最最适适温温度度为为33333737，对高温的抵抗力弱于对低温的抵抗力。对高温的抵抗力弱于对低温的抵抗力。6/29/20244三、体外细胞生长的基本条件(三）酸碱度：最适pH为7.07三、体外细胞生长的基本条件三、体外细胞生长的基本条件(六）水：六）水：双蒸水，玻璃蒸馏器重蒸，最好现制双蒸水，玻璃蒸馏器重蒸，最好现制现用。现用。(七）无菌条件七）无菌条件 在培养液中加入青、链霉素防止细菌污染；在培养液中加入青、链霉素防止细菌污染；制霉菌素或两性霉素防霉菌污染；卡那霉素制霉菌素或两性霉素防霉菌污染；卡那霉素防支原体污染。防支原体污染。6/29/20245三、体外细胞生长的基本条件(六）水：双蒸水，玻璃蒸馏器重蒸，第二节第二节细胞培养技术细胞培养技术6/29/20246第二节8/11/20236细胞培养细胞培养操作操作人人环境环境生长生长条件条件6/29/20247细胞培养操作人环境生长8/11/20237细胞培养技术细胞培养技术w要解决的问题：要解决的问题：w仪器设备仪器设备w如何培养细胞如何培养细胞w如何培养病毒如何培养病毒w如何检查病毒如何检查病毒6/29/20248细胞培养技术要解决的问题：8/11/20238一、细胞培养的基本设施与条件一、细胞培养的基本设施与条件 （一）（一）实验室：实验室：1.清洁区：清洁区：所有无菌操作均应在此区域完成。超净工所有无菌操作均应在此区域完成。超净工作台离墙放置以利清洁。无菌器械应置于该区域相邻的位作台离墙放置以利清洁。无菌器械应置于该区域相邻的位置，便于取用。操作台等表面应耐日常消毒和紫外线照射置，便于取用。操作台等表面应耐日常消毒和紫外线照射2.工作区：工作区：应有适当的通风和温度控制。尽量减少走应有适当的通风和温度控制。尽量减少走动以避免空气混流及灰尘污染。表面应耐水，并易于消毒。动以避免空气混流及灰尘污染。表面应耐水，并易于消毒。同时应有防尘的抽屉、橱柜，用于储存实验用品。同时应有防尘的抽屉、橱柜，用于储存实验用品。3.洗涤区：洗涤区：安排在实验室的入口处。存放标本的冰箱，安排在实验室的入口处。存放标本的冰箱，压力蒸汽灭菌器及其它设备。并应设有工作人员更换衣服压力蒸汽灭菌器及其它设备。并应设有工作人员更换衣服鞋帽的位置。鞋帽的位置。6/29/20249一、细胞培养的基本设施与条件8/11/20239一、细胞培养的基本设施与条件一、细胞培养的基本设施与条件 细胞培养必需避免细菌和真菌污染，因此，细胞培养必需避免细菌和真菌污染，因此，细胞培养区域最好处于滤过空气的细胞培养区域最好处于滤过空气的正压状态正压状态，且该区域内的设备及家具应尽量少放置，以且该区域内的设备及家具应尽量少放置，以利清扫及减少积尘。利清扫及减少积尘。细胞培养实验室设计的原则是保证无微细胞培养实验室设计的原则是保证无微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影响。生物污染和不受其他有毒、有害因素的影响。6/29/202410一、细胞培养的基本设施与条件8/11/202310一、细胞培养的基本设施与条件一、细胞培养的基本设施与条件w与细胞培养相反，病毒工作区域最好处与细胞培养相反，病毒工作区域最好处于负压状态，空气经过滤后排出室外。于负压状态，空气经过滤后排出室外。w理想的病毒实验室应有多个房间并有单理想的病毒实验室应有多个房间并有单独的通气和排污系统。独的通气和排污系统。6/29/202411一、细胞培养的基本设施与条件与细胞培养相反，病毒工作区域最好（二）设备（二）设备1.超净工作台或超净工作台或生物安全柜生物安全柜2.显微镜：倒置显微镜显微镜：倒置显微镜3.水浴箱水浴箱4.离心机离心机5.培养箱培养箱：CO2培养箱、普通培养箱培养箱、普通培养箱6.冰箱、冷柜与液氮罐冰箱、冷柜与液氮罐7.压力蒸汽灭菌器和干烤箱压力蒸汽灭菌器和干烤箱6/29/202412 （二）设备8/11/202312二、实验室常用洗涤、消毒和处理方法二、实验室常用洗涤、消毒和处理方法（一）无菌间的消毒处理：（一）无菌间的消毒处理：w可采用紫外线照射、福尔马林熏蒸等方可采用紫外线照射、福尔马林熏蒸等方法进行消毒处理。法进行消毒处理。（二）实验室桌面及地面的消毒处理：（二）实验室桌面及地面的消毒处理：w可采用一定浓度的新洁尔灭、过氧乙酸、可采用一定浓度的新洁尔灭、过氧乙酸、含氯消毒剂进行消毒处理。含氯消毒剂进行消毒处理。6/29/202413二、实验室常用洗涤、消毒和处理方法（一）无菌间的消毒处理：8 1 1、玻璃器材的选择：、玻璃器材的选择：2 2、玻璃器材的处理、玻璃器材的处理 1 1）新玻璃器材的处理：）新玻璃器材的处理：2 2）使用后之玻璃器材的处理：）使用后之玻璃器材的处理：3 3、玻璃器材的清洁：、玻璃器材的清洁：4 4、玻璃器材的灭菌：、玻璃器材的灭菌：湿热、干热湿热、干热（三）玻璃器材的洗涤、消毒处理（三）玻璃器材的洗涤、消毒处理中性硬质、耐酸、耐高温、中性硬质、耐酸、耐高温、透明度好、壁光滑透明度好、壁光滑去尘、中和碱去尘、中和碱去除污染去除污染清洁液浸泡、冲洗、浸泡清洁液浸泡、冲洗、浸泡湿热、干热湿热、干热6/29/202414 1、玻璃器材的选择：湿热、干热（三）玻璃器材的洗清洁液的配制清洁液的配制配制与使用时应配制与使用时应注意何问题？注意何问题？6/29/202415 清洁液的配制配制与使用时应注意何问题？8/11/202316/29/2024168/11/202316 培养瓶培养瓶6/29/202417 培养瓶8/11/202317培培 养养 板板6/29/202418培 养 板8/11/202318（四）滤器的清洁消毒（四）滤器的清洁消毒 在细胞培养中，滤器是常常要用到的器在细胞培养中，滤器是常常要用到的器材之一，主要用于材之一，主要用于不能或不宜采用高压灭菌不能或不宜采用高压灭菌手段手段进行消毒的试剂或液体的除菌。实验室常进行消毒的试剂或液体的除菌。实验室常用的除菌滤器有玻璃滤器和蔡氏滤器两种。用的除菌滤器有玻璃滤器和蔡氏滤器两种。6/29/202419（四）滤器的清洁消毒8/11/2023191 1、玻璃滤器：、玻璃滤器：新购置玻璃滤器的处理新购置玻璃滤器的处理:除尘除尘 滤器孔径是否一致滤器孔径是否一致 除菌效果除菌效果 合格后方可使用。合格后方可使用。消毒处理消毒处理:用过滤的方法进行消毒处理用过滤的方法进行消毒处理 。即自来。即自来水冲洗干净，晾干后将玻璃滤器斗内装满硫酸一重水冲洗干净，晾干后将玻璃滤器斗内装满硫酸一重酪酸钾清洁液，下接滤瓶，让清洁液自然滴落，待酪酸钾清洁液，下接滤瓶，让清洁液自然滴落，待斗内清洁液全部滴落完毕时，再用蒸馏水抽洗到滤斗内清洁液全部滴落完毕时，再用蒸馏水抽洗到滤过的蒸馏水过的蒸馏水pHpH为中性时止。晾干后与过滤瓶分别包为中性时止。晾干后与过滤瓶分别包装，装，1515磅蒸汽磅蒸汽1515分钟灭菌。分钟灭菌。6/29/2024201、玻璃滤器：8/11/202320 用于感染性或可疑感染性材料后的玻璃滤器，用于感染性或可疑感染性材料后的玻璃滤器，在使用后须经在使用后须经1 1次氯酸钠浸渍过夜后，再按上次氯酸钠浸渍过夜后，再按上述方法清洁、灭菌。述方法清洁、灭菌。2 2、蔡氏滤器：、蔡氏滤器：蔡氏滤器是用金属器将石棉板夹在中间，作蔡氏滤器是用金属器将石棉板夹在中间，作为除菌过滤之用。每次使用后，弃去用过的石棉为除菌过滤之用。每次使用后，弃去用过的石棉板，洗净金属器，晾干。使用前，夹入新石棉板板，洗净金属器，晾干。使用前，夹入新石棉板(光面向下光面向下)，将金属筒扭紧，包装后与过滤瓶分，将金属筒扭紧，包装后与过滤瓶分别经别经1515磅蒸汽磅蒸汽1515分钟灭菌即可。分钟灭菌即可。6/29/202421 用于感染性或可疑感染性材料后的玻璃滤器，在使用后须经1滤滤器器6/29/202422滤 器8/11/2023226/29/2024238/11/202323（五）橡皮塞和橡皮管的清洁消毒（五）橡皮塞和橡皮管的清洁消毒 要求质软、要求质软、弹性力强、能耐高压、对细胞无毒性。弹性力强、能耐高压、对细胞无毒性。新橡皮管（塞）处理：新橡皮管（塞）处理：2%2%氢氧化钠溶液中煮沸氢氧化钠溶液中煮沸1515分分钟，自来水洗涤；再用钟，自来水洗涤；再用4%4%盐酸溶液煮沸盐酸溶液煮沸1515分钟，自来水分钟，自来水洗涤多次，再用蒸馏水冲洗洗涤多次，再用蒸馏水冲洗5 5次以上。次以上。橡皮塞于使用前，用蒸馏水煮沸橡皮塞于使用前，用蒸馏水煮沸1010分钟灭菌，趁热将分钟灭菌，趁热将煮盒内蒸馏水倒净，置已断电源尚有余热的电炉上烘烤煮盒内蒸馏水倒净，置已断电源尚有余热的电炉上烘烤2-32-3分钟，使其干燥。分钟，使其干燥。橡皮管可根据试验要求采用煮沸或蒸汽灭菌橡皮管可根据试验要求采用煮沸或蒸汽灭菌。6/29/202424（五）橡皮塞和橡皮管的清洁消毒8/11/202324三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂w在体内，循环的体液能持续地提供细胞和组织营养在体内，循环的体液能持续地提供细胞和组织营养物质并排出代谢废物。这些体液能够提供细胞在体物质并排出代谢废物。这些体液能够提供细胞在体内存活、分化和生长的所有成分。内存活、分化和生长的所有成分。w在体外生长的细胞也完全依赖于培养液而获得营养在体外生长的细胞也完全依赖于培养液而获得营养需要。培养用液是与细胞直接接触的液体，是细胞需要。培养用液是与细胞直接接触的液体，是细胞的外环境。的外环境。w因此，因此，要求在配制过程中要求在配制过程中严格谨慎严格谨慎，以保证质量，以保证质量，使细胞培养顺利进行。使细胞培养顺利进行。6/29/202425三、细胞培养的主要试剂在体内，循环的体液能持续地提供细胞和三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂（一）培养用液和试剂（一）培养用液和试剂1.平衡盐溶液平衡盐溶液(BalancedsaltsolutionBSS)Hanks液、液、Earle液、液、PBS主要成分：主要成分：无机离子、葡萄糖无机离子、葡萄糖、指示剂指示剂制备时的注意点制备时的注意点见见P21Hanks液、液、D-Hanks液液作用？作用？用途？用途？6/29/202426三、细胞培养的主要试剂（一）培养用液和试剂 作用？8/11三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂2.培养液：培养液：分为二类分为二类生生长长液液：用用于于促促进进培培养养物物的的生生长长，一一般般含含有有血清和其它促进细胞迅血清和其它促进细胞迅速繁殖的物质。速繁殖的物质。维维持持液液：使使培培养养物物的的代代谢谢维维持持在在稳稳定定的的状状态态，溶液中促进细胞代谢和繁殖的物质较生长液少。溶液中促进细胞代谢和繁殖的物质较生长液少。6/29/202427三、细胞培养的主要试剂2.培养液：分为二类8/11/202三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂w生长液：生长液：w天然生长液：天然生长液：w合成生长液：常用的有合成生长液：常用的有Eagle：常用的是低限量：常用的是低限量Eagle培养液（培养液（minimumEaglemedium，MEM）及改良）及改良Eagle基本培养基（基本培养基（basalmediumEagle，BME）、）、Dulbecco改良的改良的Eagle培养基（培养基（DulbeccosmodifiedEaglemedium，DMEM）RPMI1640（RooseveltParkInstitutemedium1640）种类：水解乳蛋白、小牛血清种类：水解乳蛋白、小牛血清优点：含有丰富的营养物质及优点：含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、质，渗透压、pH等也与体内环等也与体内环境相似。境相似。缺点：成分不明确的混合物、缺点：成分不明确的混合物、可能会引入污染可能会引入污染、个体差异导、个体差异导致结果的不一致。致结果的不一致。是否需要选择是否需要选择培养基培养基6/29/202428三、细胞培养的主要试剂生长液：种类：水解乳蛋白、小牛血清是否三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂3.细胞分散剂：用于细胞分散剂：用于分离组织和细胞分离组织和细胞 1 1）胰胰蛋蛋白白酶酶液液：胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于与与赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽健健，除除去去细细胞胞间间粘粘蛋蛋白白及及糖糖蛋蛋白白，影影响响细细胞骨架，从而使细胞分离。胞骨架，从而使细胞分离。浓浓度度0.25%0.25%或或0.125%0.125%；温温度度3737或或室室温温；pH7.8pH7.8，D-D-HanksHanks液配制。酶的活性可被血清灭活。液配制。酶的活性可被血清灭活。2 2）EDTAEDTA液液：主主要要作作用用是是与与维维持持组组织织完完整整的的CaCa2+2+、MgMg2+2+离离子结合，使细胞分散。使用浓度子结合，使细胞分散。使用浓度0.02%0.02%。3 3）胰酶胰酶-EDTA-EDTA消化液消化液：0.25%-0.02%0.25%-0.02%6/29/202429三、细胞培养的主要试剂3.细胞分散剂：用于分离组织和细胞8三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂4.酸碱调节剂：酸碱调节剂：在大多数培养基中，Na+、K+、HCO3-和HPO42-是主要的pH调节成分。磷酸盐缓冲液和碳酸碳酸氢盐缓冲系统与血液中的缓冲系统相似，常用于细胞培养中的pH调控。尽管在生理pH时，碳酸氢盐的缓冲能力较低，但因费用低廉且无毒性，故仍然是最常用的。HEPESHEPES：在在生生理理pH的的整整个个范范围围内内，具具有有更更强强的的缓缓冲冲能能力力。在在有有血血清清的的培培养养液液内内，1025mmol/LHEPES对对大大多多数细胞无毒性。数细胞无毒性。7.5%NaHCO36/29/202430三、细胞培养的主要试剂4.酸碱调节剂：8/11/2023三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂5.酸酸碱碱指指示示剂剂:用用于于指指示示溶溶液液酸酸碱碱度度的的变变化化情情况况。以以便便用用肉眼肉眼观察观察pHpH的改变的改变。0.4%酚红溶液酚红溶液 对细胞基本无毒对细胞基本无毒 pH6.8 pH6.8时，酚红呈现黄色，时，酚红呈现黄色，pH7.0pH7.0时为桔红色，时为桔红色，pH7.4pH7.4时为红色，时为红色，pH7.8pH7.8以上时则为紫红色。以上时则为紫红色。颜色十分容易观察。颜色十分容易观察。对细胞的毒性对细胞的毒性变色范围变色范围颜色的变化颜色的变化6/29/202431三、细胞培养的主要试剂 5.酸碱指示剂:用于指示溶液酸碱度三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂6.抗生素抗生素 青青霉霉素素G G的的使使用用浓浓度度为为100100250U250Umlml，抑抑制制大大多多数数G+G+菌菌 ，但但青青霉霉素素G G不不稳稳定定，35353748h3748h后后,即即被被降降解解灭活。灭活。硫硫酸酸链链霉霉素素较较青青霉霉素素稳稳定定，35353737可可维维持持4d,4d,抑抑制制许许多多G-G-菌菌。常常联联合合应应用用青青霉霉素素(100(100250U250Uml)ml)和和链霉素链霉素(100ug(100ugml)ml)。庆庆大大霉霉素素对对多多种种G+G+和和G-G-均均有有效效，并并且且能能抑抑制制常常污污染染细细胞胞培培养养的的多多种种支支原原体体，常常用用浓浓度度为为5 510ug10ugmlml，35353737能维持能维持2 2周。周。6/29/202432三、细胞培养的主要试剂6.抗生素8/11/202332三、细胞培养的主要试剂三、细胞培养的主要试剂w二性霉素二性霉素B等抗真菌抗生素，可根据需要选用，浓度：等抗真菌抗生素，可根据需要选用，浓度：l4ugml，3537时半衰期为时半衰期为4d，抑制真菌生长而非，抑制真菌生长而非杀死真菌。杀死真菌。w长期使用可致低水平的、常常是隐性的真菌污染。当细胞长期使用可致低水平的、常常是隐性的真菌污染。当细胞适应了这种低水平污染所致的培养条件改变时，其表型常适应了这种低水平污染所致的培养条件改变时，其表型常可出现改变。因此，二性霉素可出现改变。因此，二性霉素B不宜不宜常规应用于细胞传代。常规应用于细胞传代。如确需使用，则应定时撤除。如确需使用，则应定时撤除。w病毒分离时不涉及细胞传代，可以常规使用二性霉素病毒分离时不涉及细胞传代，可以常规使用二性霉素B。6/29/202433三、细胞培养的主要试剂二性霉素B等抗真菌抗生素，可根据需要选w四、各种细胞培养方法四、各种细胞培养方法6/29/2024348/11/202334胰蛋白酶胰蛋白酶EDTA单个细胞单个细胞完好完好细胞膜损伤细胞膜损伤 死死亡亡细胞核完好细胞核完好良好的生长条件良好的生长条件贴瓶贴瓶繁殖繁殖单层单层细细胞胞培培养养过过程程新鲜的组织小块新鲜的组织小块6/29/202435细胞培养过程新鲜的组织小块8/11/202335细胞培养的基本程序细胞培养的基本程序w组织的获得与处理：无菌取组织，洗涤，剪碎，洗涤组织的获得与处理：无菌取组织，洗涤，剪碎，洗涤w分散组织：方法（机械法、消化法），洗涤分散组织：方法（机械法、消化法），洗涤w获得单个细胞悬液：吹打分散（维持液获得单个细胞悬液：吹打分散（维持液?）w细胞计数与分装：活力检查，一定浓度，分装细胞计数与分装：活力检查，一定浓度，分装w培养与观察培养与观察6/29/202436细胞培养的基本程序组织的获得与处理：无菌取组织，洗涤，剪碎，6/29/2024378/11/202337观察的内容：观察的内容：是否被污染；细胞生长状况；生长液的是否被污染；细胞生长状况；生长液的pHpH。观察时的注意事项：观察时的注意事项：1 1）初培养：）初培养：4848h h内，不应镜检或摇动，以免影响细内，不应镜检或摇动，以免影响细胞贴壁。胞贴壁。2 2）镜检或换液时，培养瓶不宜在室温放置过久，要）镜检或换液时，培养瓶不宜在室温放置过久，要随用随取，速放回。随用随取，速放回。3 3）培养瓶镜检完毕，注意细胞面朝下放平，使培养）培养瓶镜检完毕，注意细胞面朝下放平，使培养液浸渍整个细胞面。切勿倒置。液浸渍整个细胞面。切勿倒置。6/29/202438观察的内容：8/11/2023386/29/2024398/11/2023396/29/2024408/11/202340四、各种细胞培养方法四、各种细胞培养方法1、原代细胞培养、原代细胞培养2、传代细胞培养（二倍体细胞株、传代细胞系）、传代细胞培养（二倍体细胞株、传代细胞系）3、同管两种细胞培养、同管两种细胞培养4、旋转管培养法、旋转管培养法5、微量细胞培养、微量细胞培养P24-276/29/202441四、各种细胞培养方法 1、原代细胞培养 8/11传代细胞培养的过程图示传代细胞培养的过程图示w致密单层细胞在致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈使瓶壁呈半透明半透明：w弃去培养液，在弃去培养液，在此可先摇动细胞此可先摇动细胞瓶，使老化死亡瓶，使老化死亡贴壁情况不好的贴壁情况不好的细胞随培养液弃细胞随培养液弃去去。6/29/202442传代细胞培养的过程图示致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈细胞完全皱缩变圆，此时细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代：吸管吹散后传代：有经验后，可肉眼对光观有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。判断消化程度。细胞基本皱缩变圆，细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下。此时细胞吹打可下。细胞开始皱缩但不明显，细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态仍维持细胞正常形态刚加入胰酶，细胞仍刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层呈致密单层 细胞明显皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，细胞明显皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大。化程度，这样略有点过也影响不大。6/29/202443细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从四、各种细胞培养方法四、各种细胞培养方法6、微载体培养、微载体培养(Microcarrierculture)w传统的贴壁依赖性细胞的培养通过静止或转瓶等培养来获得，操作繁复，且耗费空间及人力。w1967年，Van Wezel首次提出了“微载体”培养系统，使贴壁依赖型细胞贴附在微载体上悬浮于液体培养基中生长，兼具平板培养和悬浮培养的优势，增加培养面积同时获得均一的环境培养条件(温度、pH值、CO2 浓度、葡萄糖浓度等)，便于控制放大获得高密度培养细胞和优化下游控制。6/29/202444四、各种细胞培养方法6、微载体培养(Microcarrie四、各种细胞培养方法四、各种细胞培养方法7、中空纤维培养、中空纤维培养(Hollowfibresculture)w1972年，Richard Knazek首次报道此技术。w该技术是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统中空纤维表面具有海绵状多孔结构，既能使水分子、营养物质和气体透过，也能使细胞在上面贴附生长。w该技术的特点是：细胞培养环境温和，培养细胞密度较高，产品较容易分离纯化。6/29/202445四、各种细胞培养方法7、中空纤维培养(Hollow fibr四、各种细胞培养方法四、各种细胞培养方法8、微囊法培养、微囊法培养(Microencapsulationculture)w微囊化培养技术是20世纪70年代由Lin和Sun创建的一种大规模培养技术，其要点是：在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再将微囊放入培养系统内进行培养。培养液中的水和营养物质可透过半透膜进入微囊供应给细胞，细胞的代谢物也可透过半透膜被排出，而细胞分泌的大分子物质则被阻留而积累在囊内。w微囊化培养的优点：a.细胞能生长和维持在小体积的培养液中，这使培养液中的分泌产物变浓，简化了下游加工；b.培养液易于迅速改变，且无分离细胞与培养液的困难；c.微囊固定化细胞还能使细胞较少暴露于物理损伤环境中。用微胶囊培养可保护细胞在胶囊内，可起到中空纤维的某些作用，也可避免反应器的剪切力对细胞的损伤。6/29/202446四、各种细胞培养方法8、微囊法培养(Microencap细胞培养中应注意的一些问题细胞培养中应注意的一些问题 1 1、消化时间问题：消化时间问题：“透透”！2 2、细细胞胞的的保保存存问问题题：取取到到早早代代细细胞胞种种子子时时一一定定要要及及时时地保存起来以防丢失或污染。地保存起来以防丢失或污染。3 3、温温度度的的问问题题：温温度度增增加加2-32-3对对细细胞胞产产生生不不良良影影响响，使使之之在在2424小小时时之之内内死死亡亡。低低温温对对细细胞胞影影响响较较小小。细细胞胞一一般般3737放放7 7天天大大部部分分脱脱落落。室室温温放放1010天天不不但但脱脱落落，形形态态都都有有一一些些代代谢谢改改变变。在在44放放2020天天细细胞胞能能保保持持良良好形态，如需使用时在好形态，如需使用时在3737放置放置2323小时即可。小时即可。4、血清问题：血清问题：种类、质量、浓度种类、质量、浓度l细胞相互已分离，间细胞相互已分离，间隙加大，胞体趋于变圆。隙加大，胞体趋于变圆。6/29/202447细胞培养中应注意的一些问题 1、消化时间问题：“透”！细胞五、细胞培养物的保存、复苏及运输细胞培养物的保存、复苏及运输1 1保存保存盛玻璃球的试管培养法：盛玻璃球的试管培养法：降温维持法：降温维持法：冻结保存法：冻结保存法：冷冻保护剂：甘油、二甲基亚砜（冷冻保护剂：甘油、二甲基亚砜（DMSO）低温要求：低温要求：-70或液氮（或液氮（-150至至-196）原则：慢冻原则：慢冻？6/29/202448五、细胞培养物的保存、复苏及运输1保存？8/11/2023慢冻程序慢冻程序w标准程序：标准程序：当温度在当温度在-25-25以上时，以上时，1 12/min2/min；当温度；当温度达达-25-25以下时，以下时，5 510/min10/min；当温度达；当温度达-100-100时，可迅速放入液氮中时，可迅速放入液氮中 。w简易程序：简易程序：将将冷冷冻冻管管（管管口口要要朝朝上上）放放入入纱纱布布袋袋内内，纱纱布布袋袋系系以以线线绳绳，通通过过线线绳绳将将纱纱布布袋袋固固定定于于液液氮氮罐罐罐罐口口，按按每每分分钟钟温温度度下下降降1 122的的速速度度，在在4040分分钟钟内内降降至至液氮表面，停液氮表面，停3030分钟后，直接投人液氮中。分钟后，直接投人液氮中。6/29/202449慢冻程序标准程序：8/11/202349五、细胞培养物的保存、运输及复苏细胞培养物的保存、运输及复苏2 2冻存细胞的复苏：冻存细胞的复苏：原则快融原则快融 3 3运输：运输：悬液状态（每悬液状态（每mlml生长液含生长液含100100万个细胞），万个细胞），单层培养运输时，生长液单层培养运输时，生长液装满装满培养瓶，冰盒运培养瓶，冰盒运输。输。#6/29/202450五、细胞培养物的保存、运输及复苏2冻存细胞的复苏：原则快融细胞复苏的方法w （l）从从液液氮氮中中取取出出冷冷冻冻管管，迅迅速速投投入入3738水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（1分钟左右）。分钟左右）。w（2）5分分钟钟内内用用培培养养液液稀稀释释至至原原体体积积的的10倍倍以上。以上。w（3）低速离心）低速离心10分钟。分钟。w（4）去去上上清清，加加新新鲜鲜培培养养液液培培养养后后进进行行培培养养。*6/29/202451细胞复苏的方法8/11/202351细胞悬液可用下述方法使之稳定，以备运输。细胞悬液可用下述方法使之稳定，以备运输。用生长液稀释胰酶消化细胞，每毫升不要超用生长液稀释胰酶消化细胞，每毫升不要超过过60万个细胞，然后在万个细胞，然后在04放放24小时。小时。取出后，细胞悬液以取出后，细胞悬液以200rpm沉淀沉淀30分钟，分钟，弃去含细胞毒素的上清液，再加入生长液，弃去含细胞毒素的上清液，再加入生长液，使最终浓度为使最终浓度为300万万/毫升。毫升。细胞装于冰盒后航运，收到后以细胞装于冰盒后航运，收到后以200rpm沉沉淀淀30分钟，沉下的细胞悬于新鲜生长液内，分钟，沉下的细胞悬于新鲜生长液内，使每使每ml含含60万个细胞，然后接种培养瓶。万个细胞，然后接种培养瓶。6/29/202452细胞悬液可用下述方法使之稳定，以备运输。用生长液稀释胰酶MDCK细胞保存及复苏 一般保存液为含一般保存液为含10%10%二甲基亚砜的小牛血清。二甲基亚砜的小牛血清。（1 1）MDCKMDCK细细胞胞保保存存：将将单单层层细细胞胞消消化化分分散散成成为为单单细细胞胞，加加入入0.9ml0.9ml小小牛牛血血清清和和0.1ml0.1ml二二甲甲基基亚亚砜砜混混合合保保存存液液，每每瓶瓶加加1ml1ml保保存存液液，缓缓慢慢冻冻存存：先先放放42h42h，转转放放704h704h，再转放液氮中长期保存。再转放液氮中长期保存。（2 2）MDCKMDCK细细胞胞复复苏苏：细细胞胞冻冻存存管管从从液液氮氮罐罐取取出出后后，速速放放3737水水浴浴溶溶化化，1500rpm/1500rpm/分分离离心心1 1分分钟钟，弃弃上上清清、沉沉渣渣加加入入若若干干mlml培培养养液液，混混匀匀后后加加入入细细胞胞培培养养瓶瓶中中，置置3737二二氧化碳温箱培养。氧化碳温箱培养。6/29/202453MDCK细胞保存及复苏 一般保存液为含10%二甲基亚砜的小牛关于细胞的冻存与复苏关于细胞的冻存与复苏w对用于保存的细胞有何要求？对用于保存的细胞有何要求？高活力、一定的浓度高活力、一定的浓度（110106/ml）w细胞的冻存与复苏的细胞的冻存与复苏的四个原则四个原则？6/29/202454关于细胞的冻存与复苏对用于保存的细胞有何要求？8/11/20取细胞冻存管一支，于取细胞冻存管一支，于40C水中速融；水中速融；25ml细胞方瓶中细胞方瓶中加入含加入含10%小牛血清的培养小牛血清的培养基基10ml，将冻存管中细胞全，将冻存管中细胞全部洗入瓶中，置部洗入瓶中，置372.5%二二氧化碳孵箱中静置培养。氧化碳孵箱中静置培养。4小小时后倒去全部培养基以去除时后倒去全部培养基以去除冻存液，更换冻存液，更换10ml培养基，培养基，同上静置培养。同上静置培养。经经24小时培养后，小时培养后，细胞的生长情况细胞的生长情况经经48小时培养后，小时培养后，细胞长成致密单层细胞长成致密单层的情况的情况6/29/202455取细胞冻存管一支，于40C水中速融；25ml细胞方瓶中加入六、无菌操作技术六、无菌操作技术P236/29/202456六、无菌操作技术8/11/2023566/29/2024578/11/2023576/29/202458 第三节8/11/202358w污染来源污染来源w微生物污染与监测微生物污染与监测w细胞间交叉污染与监测细胞间交叉污染与监测w细胞污染的防治措施细胞污染的防治措施6/29/202459污染来源8/11/202359解决的问题w污染的来源有哪些？污染的来源有哪些？w最易造成的污染是何种微生物？为什么？最易造成的污染是何种微生物？为什么？w如何进行细胞污染的检测？如何进行细胞污染的检测？6/29/202460解决的问题污染的来源有哪些？8/11/2023606/29/2024618/11/2023616/29/2024628/11/2023626/29/2024638/11/2023636/29/202464再见8/11/202364