核酸检测医学知识培训ppt课件

核酸检测医学知识核酸检测医学知识1为什么要做核酸检测？为什么要做核酸检测？核酸检测医学知识2为什么要做核酸检测？核酸检测医学知识2 核酸检测（基因检测）现知现知人类的疾病都与基因有直接或间接人类的疾病都与基因有直接或间接的关系的关系。医学实验室所要检测和分析的核酸医学实验室所要检测和分析的核酸既包括人体本身的基因既包括人体本身的基因(DNADNA)以及反映基因以及反映基因转录水平的转录水平的mRNA,mRNA,也包括侵入人体的致病也包括侵入人体的致病微生物等所携带的外源性基因微生物等所携带的外源性基因(DNA/RNA DNA/RNA)。核酸检测医学知识3 核酸检测（基因检测）核酸检测医学知识3传统检测试剂（酶免传统检测试剂（酶免ELISAELISA）技术特点技术特点技术特点技术特点：检测目标为蛋白检测目标为蛋白检测目标为蛋白检测目标为蛋白,所检测的主要是疾病所引所检测的主要是疾病所引所检测的主要是疾病所引所检测的主要是疾病所引发的人体抗体而不是病原体本身发的人体抗体而不是病原体本身发的人体抗体而不是病原体本身发的人体抗体而不是病原体本身,是一种间接、滞是一种间接、滞是一种间接、滞是一种间接、滞后的检测方式。易操作，成本低。后的检测方式。易操作，成本低。后的检测方式。易操作，成本低。后的检测方式。易操作，成本低。固有不足固有不足固有不足固有不足：不能够消除对不能够消除对不能够消除对不能够消除对“窗口期窗口期窗口期窗口期”标本标本标本标本(抗体阴性抗体阴性抗体阴性抗体阴性,核核核核酸阳性酸阳性酸阳性酸阳性)的漏检的漏检的漏检的漏检 难于检测病原体的不同亚型及突变型难于检测病原体的不同亚型及突变型难于检测病原体的不同亚型及突变型难于检测病原体的不同亚型及突变型 不典型血清阳转不典型血清阳转不典型血清阳转不典型血清阳转 对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检核酸检测医学知识4传统检测试剂（酶免ELISA）技术特点：核酸检测医学知识4核酸检测核酸检测显著缩短窗口期显著缩短窗口期:HIV:HIV窗口期缩短窗口期缩短45%45%，HCVHCV缩缩 短短89%89%，HBVHBV缩短缩短50%50%。提提 高高 灵灵 敏敏 度度:理论上扩增体系中单拷贝的模板理论上扩增体系中单拷贝的模板 也能被检测出。也能被检测出。特特 异异 性性 好好:使用荧光探针技术的使用荧光探针技术的PCRPCR检测，检测，几乎没有方法学的假阳性。几乎没有方法学的假阳性。直接揭示病原体的存在直接揭示病原体的存在 对操作者及检测环境的要求较高对操作者及检测环境的要求较高检测成本相对较高检测成本相对较高核酸检测医学知识5核酸检测显著缩短窗口期:HIV窗口期缩短45%，HCV缩核酸输血中可传染病原体的“窗口期”病毒种类病毒种类病毒种类病毒种类ELISAELISAELISAELISA检测项目检测项目检测项目检测项目窗口期窗口期窗口期窗口期HCVHCV抗抗-HCV 2.0/3.0 EIA-HCV 2.0/3.0 EIA 8-108-10周周HIVHIV抗抗-HIV-1/2 EIA and HIV-1-HIV-1/2 EIA and HIV-1 抗原抗原 EIAEIA 2-42-4周周HBVHBVHBVsAg EIA and HBVcAg EIAHBVsAg EIA and HBVcAg EIA 6-86-8周周HTLVHTLV抗抗-HTLV I/II EIA-HTLV I/II EIA 8-108-10周周CMVCMV抗抗-CMV EIA-CMV EIA 3-5 3-5 周周核酸检测医学知识6输血中可传染病原体的“窗口期”病毒种类ELISA检测项目窗口窗口期检测率窗口期检测率国家或地区国家或地区国家或地区国家或地区HBVHBVHCVHCVHIVHIV加拿大加拿大加拿大加拿大1:1530001:153000(1/151/15万万万万)1:23000001:2300000(1/2301/230万万万万)1:78000001:7800000(1/7801/780万万万万)法国法国法国法国1:6400001:640000(1/641/64万万万万)1:100000001:10000000(1/10001/1000万万万万)1:31500001:3150000(1/3151/315万万万万)德国德国德国德国1:2300001:230000(1/231/23万万万万)1:6700001:670000(1/671/67万万万万)1:27700001:2770000(1/2771/277万万万万)日本日本日本日本（5050混）混）混）混）1:519881:51988(1/5.21/5.2万万万万)1:3480911:348091(1/351/35万万万万)1:26686961:2668696(1/2671/267万万万万)美国美国美国美国（2424混）混）混）混）1:1800001:180000(1/181/18万万万万)1:2300001:230000(1/231/23万万万万)1 12 2:3:371640547164054(1/309(1/309万万万万)香港香港香港香港1:327861:32786(1/3.31/3.3万万万万)1:54561:5456(1/0.51/0.5万万万万)1:2221:222(1/0.021/0.02万万万万)核酸检测医学知识7窗口期检测率国家或地区HBVHCVHIV加拿大1:15300核酸检测在临床诊断中的应用定性诊断 血液筛查血液筛查 病原体筛查诊断病原体筛查诊断 SNP SNP和耐药突变诊断和耐药突变诊断 基因型分型基因型分型 遗传病诊断遗传病诊断 个体用药诊断个体用药诊断 基因鉴定和配型基因鉴定和配型 定量检测 病情的评估和预后判断病情的评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察抗病毒药物疗效的观察 新药验证新药验证 癌基因表达差异癌基因表达差异 核酸检测医学知识8核酸检测在临床诊断中的应用定性诊断定量检测核酸检测医学知识8核核 酸酸 是是 什什 么？么？核酸检测医学知识9核 酸 是 什 么？核酸检测医学知识9核酸核酸（Nucleic Acid）是一种主要位于细胞核内的生物大分子，其充当着生物体遗传遗传信息信息的携带和传递。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。核酸检测医学知识10核酸（Nucleic Acid）是一种主要位于细胞核内的生物核酸分类：DNA、RNA；l lDNADNA：dATPdATP（A A）、dTTPdTTP（T T）、dCTP dCTP（C C）、dGTPdGTP（GG）；l lRNARNA：ATPATP、UTPUTP、CTPCTP、GTPGTP；l l3355磷酸键磷酸键核酸检测医学知识11核酸分类：DNA、RNA；核酸检测医学知识11DNA结构结构单链单链DNADNA形成双链的原则形成双链的原则 碱基互补配对：碱基互补配对：G-C T-A G-C T-A外部为磷酸和戊糖形成外部为磷酸和戊糖形成的骨架的骨架内部为碱基互补形成的内部为碱基互补形成的共价结合区域共价结合区域螺旋结构螺旋结构核酸检测医学知识12DNA结构单链DNA形成双链的原则外部为磷酸和戊糖形成核酸核酸在体内的复制核酸在体内的复制核酸检测医学知识13核酸在体内的复制核酸检测医学知识13DNADNA的热变性的热变性DNA受热，会解开双链互补状态，形成单链；降温会恢复双链状态核酸检测医学知识14DNA的热变性DNA受热，会解开双链互补状态，形成单链；降温怎样进行核酸检测？怎样进行核酸检测？核酸检测医学知识15怎样进行核酸检测？核酸检测医学知识15核酸检测的一般流程核酸检测的一般流程核酸样品的制备：从血液、体液、组织中提取或从血液、体液、组织中提取或PCRPCR扩增扩增样品的检测：核酸杂交、核酸杂交、PCRPCR、荧光定量、荧光定量PCRPCR、PCR-ELISAPCR-ELISA等等 结果判读：电泳、膜、荧光定量电泳、膜、荧光定量PCRPCR仪等仪等核酸检测医学知识16核酸检测的一般流程核酸样品的制备：核酸检测医学知识16核 酸 杂 交 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Southern blot hybridization）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。核酸检测医学知识17核 酸 杂 交 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小核酸提取核酸提取PCR扩增扩增探针点膜探针点膜交联交联杂交杂交显色显色结果判读结果判读核酸检测医学知识18核酸提取PCR扩增探针点膜交联杂交显色结果判读核酸检测医学知PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)(Polymerase Chain Reaction)，简称，简称PCRPCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNADNA片段。可看作生物体外的特殊片段。可看作生物体外的特殊DNADNA复制。复制。DNADNA的复制是生物进化和传代的重要途径。双链的复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNADNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNADNA聚合聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，分子挎贝。在实验中发现，DNADNA在高温时也可以发生在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制通过温度变化控制DNADNA的变性和复性，加入设计的变性和复性，加入设计引物，引物，DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP就可以完成特定基因的体外复制。就可以完成特定基因的体外复制。核酸检测医学知识19PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain RePCR的产生核酸检测医学知识20PCR的产生核酸检测医学知识20实时荧光实时荧光PCR 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用，利用荧光信号累积实现了荧光信号累积实现了实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，进程，对对起始模板起始模板进行分析的方法进行分析的方法,可以进行定量和定可以进行定量和定性检测。性检测。核酸检测医学知识21实时荧光PCR 在PCR反应体系中加入核酸检测医学知识22核酸检测医学知识22核酸检测医学知识23核酸检测医学知识23核酸检测医学知识培训ppt课件24核酸检测医学知识25核酸检测医学知识25荧光定量PCR标记方法内掺式染料内掺式染料SYBR Green ISYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)核酸检测医学知识26荧光定量PCR标记方法内掺式染料核酸检测医学知识26SYBRSYBRGREEN GREEN 双双探探针针杂杂交交分子分子信标信标 Taqman Taqman 引物特异引物特异探探针针 性质性质 可逆荧光可逆荧光 积累荧光积累荧光 熔点分析熔点分析 能能不能不能特异性特异性 引物（非引物（非特异性扩特异性扩增或引物增或引物二聚体有二聚体有影响）影响）引物引物2 2探针探针 引物引物探针探针 引物引物探针探针 引物（非特引物（非特异性扩增或异性扩增或引物二聚体引物二聚体有影响）有影响）探针探针无无有有有有有有无无通用性通用性通用通用专用专用专用专用专用专用专用专用探针特点核酸检测医学知识27SYBR双探针分子Taqman 引物特异性质 可逆荧光 积SYBR Green 融解曲线分析核酸检测医学知识28SYBR Green 融解曲线分析核酸检测医学知识28SYBR Green法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜核酸检测医学知识29SYBR Green法优缺点核酸检测医学知识29TaqMan探针法核酸检测医学知识30TaqMan探针法核酸检测医学知识30TaqMan法优缺点核酸检测医学知识31TaqMan法优缺点核酸检测医学知识31核酸检测医学知识32核酸检测医学知识32市市 场场 状状 况况核酸检测医学知识33市 场 状 况核酸检测医学知识33生产厂家生产厂家检测项目检测项目使用技术使用技术使用仪器使用仪器达安基因达安基因HBVHBV、HIVHIV、HCVHCV、HPV HPV、TBTB、HCMVHCMV、淋球菌、解脲脲原体、淋球菌、解脲脲原体、肺炎支原体、沙眼衣原肺炎支原体、沙眼衣原体、单纯疱疹病毒体、单纯疱疹病毒型、型、地中海贫血、缺失地中海贫血、缺失型型-地中海贫血、地中海贫血、淋球淋球菌、血筛试剂菌、血筛试剂PCRPCR荧光探针法荧光探针法PCR-PCR-反向点杂反向点杂交法交法荧光定量荧光定量PCRPCR仪仪PCRPCR仪仪上海科华上海科华HBVHBV、HCVHCV、新型冠新型冠状病毒、状病毒、血筛试剂血筛试剂PCRPCR荧光探针法荧光探针法PCR-PCR-酶免酶免荧光定量荧光定量PCRPCR仪仪酶免相关仪器酶免相关仪器匹基匹基HBVHBV、HIVHIV、HPVHPV、TBTB、HCVHCV、沙眼衣原体、沙眼衣原体、新型冠状病毒新型冠状病毒PCRPCR荧光探针法荧光探针法荧光定量荧光定量PCRPCR仪仪上海华美上海华美HBVHBV、HCVHCV、TBTB、沙眼衣原体、新型冠状沙眼衣原体、新型冠状病毒病毒PCRPCR荧光探针法荧光探针法荧光定量荧光定量PCRPCR仪仪上海克隆上海克隆HBVHBV、TBTB、HPVHPVPCRPCR荧光探针法荧光探针法荧光定量荧光定量PCRPCR仪仪凯普、港龙以HPV检测为主。浩源血筛试剂已进入审批阶段。罗氏、生物梅里埃公司有HIV检测试剂盒，均以各自公司的专利技术为主研发。核酸检测医学知识34生产厂家检测项目使用技术使用仪器达安基因HBV、HIV、HC现状和趋势1 1、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操作为主；缺乏规范；核心技术少；作为主；缺乏规范；核心技术少；2 2、趋势：管理部门逐渐加强管理，相关标准制、趋势：管理部门逐渐加强管理，相关标准制订中；进口试剂以全自动诊断平台为主在国内订中；进口试剂以全自动诊断平台为主在国内推广，国内厂家渐进推出自动化核酸提取仪器推广，国内厂家渐进推出自动化核酸提取仪器进入市场；进入市场；核酸检测医学知识35现状和趋势1、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操作为主；实时荧光PCR检测的难点1 1、大规模适合自动化核酸提取的样品制备技术、大规模适合自动化核酸提取的样品制备技术2 2、适合筛查应用的多重、适合筛查应用的多重PCRPCR技术技术3 3、高通量全自动的核酸提取设备和耗材、高通量全自动的核酸提取设备和耗材4 4、高通量检测设备和配套耗材的成本控制、高通量检测设备和配套耗材的成本控制5 5、质量控制和质量管理方法、质量控制和质量管理方法6 6、核心原料的成本控制、核心原料的成本控制核酸检测医学知识36实时荧光PCR检测的难点1、大规模适合自动化核酸提取的样品制试剂质量控制方法1、实验室分类和功能化2、人员培训和自我约束3、建立切实可行的质量控制方法 和管理体系核酸检测医学知识37试剂质量控制方法1、实验室分类和功能化核酸检测医学知识37核酸检测医学知识38谢谢大家！核酸检测医学知识38