第十免疫学检测技术优质课件

第十免疫学检测技术第十免疫学检测技术1（优选）第十免疫学检测技术（优选）第十免疫学检测技术2第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测 抗原抗体直接反应包括沉淀反应、凝集反抗原抗体直接反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。抗原抗体反应可抗原抗体反应可 用已知的特异性抗体检测未知用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。抗体反应的敏感性。第一节 抗原或抗体的检测 抗原抗体直接反应包3抗原抗原-抗体反应的特点抗体反应的特点1.抗原抗原-抗体的结合是特异性结合抗体的结合是特异性结合2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合3.抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段特异性结合阶段 可见的反应阶段可见的反应阶段4.抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现 象，于两者的分子比例密切相关象，于两者的分子比例密切相关抗原-抗体反应的特点1.抗原-抗体的结合是特异性结合2.抗原4抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响5抗原抗体反应受多种因素影响抗原抗体反应受多种因素影响 1 1 1 1 电解质抗原抗体反应通常应用电解质抗原抗体反应通常应用电解质抗原抗体反应通常应用电解质抗原抗体反应通常应用0.85%0.85%0.85%0.85%的氯化钠的氯化钠的氯化钠的氯化钠作为作为作为作为 稀稀稀稀 释液释液释液释液 ，以供给适应浓度的电解质。，以供给适应浓度的电解质。，以供给适应浓度的电解质。，以供给适应浓度的电解质。2 2 2 2 温度一般常使用反应在温度一般常使用反应在温度一般常使用反应在温度一般常使用反应在37373737度水浴度水浴度水浴度水浴 或孵育箱中或孵育箱中或孵育箱中或孵育箱中进进进进 行。行。行。行。3.3.3.3.酸碱度抗原抗体反应适应的酸碱度酸碱度抗原抗体反应适应的酸碱度酸碱度抗原抗体反应适应的酸碱度酸碱度抗原抗体反应适应的酸碱度 为为为为PH68PH68PH68PH68。抗原抗体反应受多种因素影响1 电解质抗原抗体反应通常应用0.6抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应补体溶血反应补体溶血反应 和补体结合反应和补体结合反应中和反应中和反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应抗原抗体的检测方法凝集反应7凝集反应凝集反应(Agglutination)细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集形成凝集形成凝集形成凝集 现象，称为凝聚反应。现象，称为凝聚反应。现象，称为凝聚反应。现象，称为凝聚反应。1 1 1 1、直接凝集将细菌或红细胞与相应的抗体直、直接凝集将细菌或红细胞与相应的抗体直、直接凝集将细菌或红细胞与相应的抗体直、直接凝集将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。玻片法和试管法。玻片法和试管法。玻片法和试管法。2 2 2 2、间接凝集将可溶性抗原包被在红细胞或乳、间接凝集将可溶性抗原包被在红细胞或乳、间接凝集将可溶性抗原包被在红细胞或乳、间接凝集将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。凝集反应(Agglutination)细菌、红82、免疫荧光法常采用间接免疫荧光法。是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。3、流式细胞术借助流式细胞仪（FCM)。抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。体外法 T细胞增殖试验将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。3HTdR掺入法双向免疫扩散（Double Immunodiffusion)大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。抗原-抗体的结合是特异性结合(4)密度梯度离心(4)密度梯度离心酸碱度抗原抗体反应适应的酸碱度 为PH68。外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。（Complement Fixation,CFT)血血 球球 凝凝 集集2、免疫荧光法常采用间接免疫荧光法。血 球 凝 集9沉淀反应沉淀反应（Precipitation)血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。散故也称免疫扩散。散故也称免疫扩散。散故也称免疫扩散。沉淀反应（Precipitation)血清蛋10单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)是将一定量已知抗体混于是将一定量已知抗体混于是将一定量已知抗体混于是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在琼脂凝胶中制琼脂板，在琼脂凝胶中制琼脂板，在琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加适当位置打孔后将抗原加适当位置打孔后将抗原加适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散入孔中扩散。抗原在扩散入孔中扩散。抗原在扩散入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相过程中与凝胶中的抗体相过程中与凝胶中的抗体相过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心遇，形成以抗原孔为中心遇，形成以抗原孔为中心遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗的沉淀环，环的直径与抗的沉淀环，环的直径与抗的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法原含量成正比相关。本法原含量成正比相关。本法原含量成正比相关。本法常用于测定血清常用于测定血清常用于测定血清常用于测定血清IgGIgG、IgMIgM、IgA IgA 和和和和 C C 3 3等的含量。等的含量。等的含量。等的含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环单向免疫扩散(Single Immunodiffusion11双向免疫扩散双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion)是将抗原与抗体分别加入琼是将抗原与抗体分别加入琼是将抗原与抗体分别加入琼是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由脂凝胶的小孔中，二者自由脂凝胶的小孔中，二者自由脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例向周围扩散并相遇，在比例向周围扩散并相遇，在比例向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反合适处形成沉淀线。如果反合适处形成沉淀线。如果反合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原应体系中含两种以上的抗原应体系中含两种以上的抗原应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现抗体系统，则小孔间可出现抗体系统，则小孔间可出现抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常两条以上的沉淀线。本法常两条以上的沉淀线。本法常两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性用于抗原或抗体的定性用于抗原或抗体的定性用于抗原或抗体的定性 、组、组、组、组成和两种抗原相关性分析的成和两种抗原相关性分析的成和两种抗原相关性分析的成和两种抗原相关性分析的检测。检测。检测。检测。双向免疫扩散（Double Immunodiffusio12免疫电泳免疫电泳（Immunoelectrophoresis)是先将待侧血清标本作琼脂凝是先将待侧血清标本作琼脂凝是先将待侧血清标本作琼脂凝是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被胶电泳，血清中各蛋白组分被胶电泳，血清中各蛋白组分被胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳分成不同的区带，然后与电泳分成不同的区带，然后与电泳分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应方向平行挖一小槽，加入相应方向平行挖一小槽，加入相应方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白的抗血清，把分成区带的蛋白的抗血清，把分成区带的蛋白的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在抗原成分作双向免疫扩散，在抗原成分作双向免疫扩散，在抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。各区带相应的位置形成沉淀弧。各区带相应的位置形成沉淀弧。各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，该法常用于血清蛋白种类分析，该法常用于血清蛋白种类分析，该法常用于血清蛋白种类分析，以观察以观察以观察以观察Ig Ig的异常增多或缺失。的异常增多或缺失。的异常增多或缺失。的异常增多或缺失。免疫电泳（Immunoelectrophoresis)是先13火箭电泳火箭电泳（Rocket Electrophoresis)火箭电泳，是把单向免疫扩散同电泳结火箭电泳，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。标本中抗原的含量。火箭电泳 火箭电泳，是把单向免疫扩散同电泳结合14火箭电泳示意图火箭电泳示意图火箭电泳示意图15用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。形态学检查酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。双向免疫扩散（Double Immunodiffusion)大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。体外法 T细胞增殖试验用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原抗体反应。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。间接荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）抗原-抗体的结合是特异性结合放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)此法是在间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体，使之与抗原抗体复合物结合；将荧光素直接标记抗体作标本染色。常用于检测多种病毒 如HIV 的抗体或抗原。免疫印迹法(Immunoblotting)免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。抗原-抗体的结合是特异性结合补体结合反应补体结合反应（Complement Fixation,CFT)敏感性和特异性均较高，但该试验影响因敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。补体结合反应 16免疫标记技术免疫标记技术 用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗标记抗标记抗标记抗体（或抗原）进行抗原抗体反应。标记物质与抗体体（或抗原）进行抗原抗体反应。标记物质与抗体体（或抗原）进行抗原抗体反应。标记物质与抗体体（或抗原）进行抗原抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。定性或定位检测。定性或定位检测。定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型免疫荧光免疫标记技术主要有三种基本类型免疫荧光免疫标记技术主要有三种基本类型免疫荧光免疫标记技术主要有三种基本类型免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。技术、免疫酶技术和同位素标记技术。技术、免疫酶技术和同位素标记技术。技术、免疫酶技术和同位素标记技术。免疫标记技术 用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记17免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术(Immunofluorescence Technique)用荧光素（常用的有异硫氰酸荧用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，光素，FITC)与抗体连接成荧光抗体，再与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。借此对标本中的抗原作鉴定和定位。包括直接荧光法、间接荧光法和补体包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。法。免疫荧光显微技术(Immunofluorescence T18直接荧光法直接荧光法 将荧光素直接标记抗体作标本染色。该将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检法的优点是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。直接荧光法19间接荧光法（间接荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。会增加。间接荧光法（indirect immunofluoresce20间接免疫荧光法示意图间接免疫荧光法示意图间接免疫荧光法示意图21补体结合免疫荧光法补体结合免疫荧光法 此法是在间接法的第一步抗原此法是在间接法的第一步抗原抗体反抗体反应时加入补体，使之与抗原应时加入补体，使之与抗原抗体复合抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行抗体进行示踪。示踪。补体结合免疫荧光法22免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术23流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry,FCM)FCM FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。集。集。集。FCMFCM还可对同一细胞的多种参数（如还可对同一细胞的多种参数（如还可对同一细胞的多种参数（如还可对同一细胞的多种参数（如DNADNA、RNARNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。流式细胞术 FCM是将免疫荧光技术应用于流式细24流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理25酶免疫测定酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA)用酶（常用的有辣根过氧化物酶，用酶（常用的有辣根过氧化物酶，HRP和和碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，AP)标记的抗体进行的抗原抗体反标记的抗体进行的抗原抗体反应。应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者后者测定组织中或细胞表面的抗原。测定组织中或细胞表面的抗原。酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA26酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法间接法BASELISABASELISA等。等。酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno27 ELISA 检测抗体检测抗体 ELISA28第一节 抗原或抗体的检测酸碱度抗原抗体反应适应的酸碱度 为PH68。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。可见的反应阶段该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA)可见的反应阶段1 电解质抗原抗体反应通常应用0.该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。2、间接凝集将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。抗原抗体反应可 用已知的特异性抗体检测未知的抗原；抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。用酶（常用的有辣根过氧化物酶，HRP和碱性磷酸酶，AP)标记的抗体进行的抗原抗体反应。3、流式细胞术借助流式细胞仪（FCM)。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。沉淀反应（Precipitation)（Flow Cytometry,FCM)1 电解质抗原抗体反应通常应用0.此法是在间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体，使之与抗原抗体复合物结合；第一节 抗原或抗体的检测29放射免疫测定法放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素标记抗原进行的免疫学用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达感性达pg水平。水平。常用于标记的放射性核素有常用于标记的放射性核素有I125和和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。的测定。放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA30 Ag*Ab Ag 标记抗原 特异性抗体 待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab 和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性 放射免疫测定法放射免疫测定法(RIA)示意图示意图 Ag*Ab31RIA法原理及标准曲线法原理及标准曲线 7550 30 100110100 1000未标记抗原浓度（ng/ml)结合/未结合的放射活性（%）RIA法原理及标准曲线 7550 30 10011010032免疫印迹法免疫印迹法(Immunoblotting)将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒于检测多种病毒 如如HIV 的抗体或抗原。的抗体或抗原。免疫印迹法(Immunoblotting)将凝胶电33免免 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图免 疫 印 迹 法 示 意 图34二二 淋巴细胞淋巴细胞 的测定的测定 检测各群体淋巴细胞的数量与功检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但仅外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。行检查。二 淋巴细胞 的测定 检测各35(1)抗凝抗凝静脉血静脉血(2)加加等量等量NS(4)密度梯度离密度梯度离心心血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓混匀后，缓慢加于分离液上慢加于分离液上(1)抗凝(2)加等量NS(4)密度梯度离心血浆分离36一）淋巴细胞类型和数目的测定一）淋巴细胞类型和数目的测定1 1、花结试验、花结试验E E花结试验可用于检测花结试验可用于检测T T细胞数细胞数目。目。EAEA花结试验可用于检测花结试验可用于检测B B细胞数目。细胞数目。2 2、免疫荧光法常采用间接免疫荧光法。、免疫荧光法常采用间接免疫荧光法。3 3、流式细胞术借助流式细胞仪（、流式细胞术借助流式细胞仪（FCM)FCM)。一）淋巴细胞类型和数目的测定1、花结试验E花结试验可用于检测37花结试验示意图花结试验示意图花结试验示意图38T细胞功能测定细胞功能测定体外法体外法 T T细胞增殖试验细胞增殖试验 形态学检查形态学检查 3HTdR 3HTdR掺入法掺入法 MTT MTT法法体内法体内法 用生物抗原或化学抗原作皮内试验。用生物抗原或化学抗原作皮内试验。OTPPD(OTPPD(结核菌素试验结核菌素试验)皮皮试试 SDSK(SDSK(链球菌链球菌DNADNA酶链激酶链激酶酶)皮试皮试 T细胞功能测定体外法 T细胞增殖试验 39火箭电泳，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。3、流式细胞术借助流式细胞仪（FCM)。抗原-抗体的结合是特异性结合间接荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）第一节 抗原或抗体的检测敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表面的抗原。酸碱度抗原抗体反应适应的酸碱度 为PH68。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。抗原抗体反应可 用已知的特异性抗体检测未知的抗原；免疫荧光显微技术(Immunofluorescence Technique)培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图掺入法）示意图火箭电泳，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。培养液3H40