第十二章机体免疫功能的检测技术ppt课件

第十二章机体免疫功能的检测技术第十二章机体免疫功能的检测技术1优选第十二章机体免疫功能的检测技术优选第十二章机体免疫功能的检测技术2第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化一、一、白细胞的分离白细胞的分离二、二、外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离三、三、淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离 四、四、其他细胞的分离和收集其他细胞的分离和收集 返回第一节 免疫细胞的分离与纯化一、白细胞的分离返回31自然沉降分离法2聚合物加速沉淀法返回一、白细胞的分离血液中红细胞与白细胞比例约6001000:1 1自然沉降分离法返回一、白细胞的分离血液中红细胞与白细胞比4上层淡黄色血浆灰白层白细胞底层红细胞返回1自然沉降分离法室温静置30-60min上层淡黄色血浆返回1自然沉降分离法室温静置30-60min52聚合物加速沉淀法返回 某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。2聚合物加速沉淀法返回 某些高分子聚合物（如明胶、右旋61.Ficoll分层液法2.Percoll分层液法二、外周血单个核细胞的分离二、外周血单个核细胞的分离返回人外周血细胞的密度为：红细胞 1.093，粒细胞 1.092，单个核细胞1.0751.090，血小板 1.0301.035。1.Ficoll分层液法二、外周血单个核细胞的分离返回人71.Ficoll分层液法 Ficoll分层液法即聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心分离法（ficollhypaque density gradient centrifugation)聚蔗糖密度1.020 泛影葡胺密度1.200 外周血单个核细胞（PBMC）密度 人1.077 小鼠1.088 马1.0901.Ficoll分层液法 Ficoll分层液法即聚蔗糖8用Ficoll分离外周血单个核细胞返回95%2000rpm20min用Ficoll分离外周血单个核细胞返回95%2000rpm292.Percoll分层液法 Percoll是聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶混悬液的商品名，为一种无细胞毒无刺激的新型密度梯度分层液。Percoll原液（密度1.135）+8.5%NaCl或1.5M PBS (9:1)Percoll 浓度（%）70 60 50 40 30 20 比重（g/ml)1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.0312.Percoll分层液法 Percoll是聚乙烯吡咯烷10用Percoll分离外周血单个核细胞返回75%98%血小板血小板用Percoll分离外周血单个核细胞返回75%98%血小板11三、淋巴细胞及其亚群的分离三、淋巴细胞及其亚群的分离1.红细胞的去除2.血小板的去除3.单核细胞的去除4.淋巴细胞亚群的分离返回三、淋巴细胞及其亚群的分离1.红细胞的去除返回121.红细胞的去除（1）低渗裂解法：蒸馏水（2）氯化铵处理法：0.83%氯化铵返回PBMC+1ml H2O轻轻振摇不超过1min加入等量1.8%生理盐水去除红细胞碎片1.红细胞的去除（1）低渗裂解法：蒸馏水（2）氯化铵处理法133.单核细胞的去除（1）粘附贴壁法：在玻璃或塑料平皿中于37温箱静置1h3.单核细胞的去除（1）粘附贴壁法：14 玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附单核细胞，收集未吸附的淋巴细胞（2）吸附柱过滤法：单核细胞37 1-2h淋巴细胞 玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附单核细胞，收集未吸附15刺激指数(SI)=刺激孔cpm/对照孔cpmBFA阻滞细胞因子释放杀伤肿瘤细胞不需抗原致敏吞噬红细胞的巨噬细胞数50%为降低嗜中性粒细胞趋化功能检测B细胞+刺激物（PWM，LPS）巨噬细胞表面受体的检测玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附单核细胞，收集未吸附的淋巴细胞（5）免疫磁珠分离法50%为降低二、外周血单个核细胞的分离实验孔OD值-自发释放孔OD值（1）单相免疫扩散试验NK细胞和LAK细胞功能的检测三、淋巴细胞及其亚群的分离LAK细胞的靶细胞：LiBr用Ficoll分离外周血单个核细胞轻轻振摇不超过1min后，诱导产生的一类新型杀伤细胞（3）磁铁吸引法：加入直径为3um的羰基铁颗粒，待单核细胞充分吞噬颗粒后，再用磁铁将单核细胞吸至管底，上层液中则含有较纯的淋巴细胞。返回刺激指数(SI)=刺激孔cpm/对照孔cpm（3）磁铁吸引法164.淋巴细胞亚群的分离（1）E-玫瑰花环沉降法（2）尼龙棉纤维分离法（3）亲和分离法（4）抗体/补体介导的特异性细胞 毒作用分离法（5）免疫磁珠分离法（6）流式细胞仪分离法返回4.淋巴细胞亚群的分离（1）E-玫瑰花环沉降法（2）尼17（1）E-玫瑰花环沉降法返回（1）E-玫瑰花环沉降法返回18（2）尼龙棉纤维分离法T细胞：不吸附B细胞：吸附T细胞(90%)B细胞(80%)37 1-2h返回10-20%小牛血清培养液（2）尼龙棉纤维分离法T细胞：不吸附T细胞(90%)B细胞19（3）亲和分离法返回（3）亲和分离法返回20（4）抗体/补体介导的特异性 细胞毒作用分离法返回 在补体的作用下裂解与抗体结合的细胞，从而分离出不能与此抗体结合的细胞亚群。这是一种负选性分离法，简称细胞毒法。（4）抗体/补体介导的特异性返回 在补体的作用下裂解与21（5）免疫磁珠分离法PBMC+生物素标记抗体+亲和素标记磁珠（5）免疫磁珠分离法PBMC+生物素标记抗体+亲和素22 CD56 MicroBeads:positive selection NK Cell Isolation Kit:negative selection分离前分离后 CD56 MicroBeads:positive sel23BrdUPBMCNK-depleted PBMC17.6%41%BrdUPBMCNK-depleted PBMC17.6%424返回返回25返回（6）流式细胞仪分离法返回（6）流式细胞仪分离法26四、其他细胞的分离和收集（一）巨噬细胞的分离和收集（二）NK细胞细胞的分离返回四、其他细胞的分离和收集（一）巨噬细胞的分离和收集（二）NK27（一）吞噬细胞的分离和收集u 人：组织液（斑蝥敷贴法）滤纸蘸取10%中药斑蝥酒精浸出液臂内侧皮肤48小时后局部形成水疱吸取疱中的组织液,内含巨噬细胞（一）吞噬细胞的分离和收集 人：组织液（斑蝥敷贴法）滤纸蘸取28实验孔cpm-自发释放孔cpmB细胞+刺激物（PWM，LPS）人外周血细胞的密度为：红细胞 1.某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。用Percoll分离外周血单个核细胞巨噬细胞功能的检测转化细胞：体积大，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小评价标准：60-80%为正常，LAK细胞的靶细胞：LiBr轻轻振摇不超过1min比重（g/ml)1.三、淋巴细胞及其亚群的分离在补体的作用下裂解与抗体结合的细胞，从而分离出不能与此抗体结合的细胞亚群。转化细胞：体积大，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小 外周血单个核细胞（PBMC）密度 外周血单个核细胞（PBMC）密度一、免疫球蛋白的定量检测第十二章机体免疫功能的检测技术一、免疫球蛋白的定量检测四、其他细胞的分离和收集杀伤肿瘤细胞不需抗原致敏返回u 小动物：腹腔巨噬细胞小鼠腹腔内注入石蜡油天后吸出腹腔浸出液7080%为巨噬细胞实验孔cpm-自发释放孔cpm返回 小动物：腹腔巨噬细胞小鼠29（二）NK细胞的分离单核细胞:粘附法B细胞:尼仑棉纤维T细胞:E-玫瑰花环沉降法返回PBMCNK（二）NK细胞的分离单核细胞:粘附法B细胞:尼仑棉纤维T30第二节第二节 体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测二、B细胞数目及功能的检测返回第二节 体液免疫功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测二、B细胞31一、免疫球蛋白的定量检测返回（1）单相免疫扩散试验（2）双相免疫扩散试验（3）火箭电泳（4）中和反应（5）ELISA一、免疫球蛋白的定量检测返回（1）单相免疫扩散试验32单相免疫扩散试验返回FLASH单相免疫扩散试验返回FLASH33双相免疫扩散试验双相免疫扩散试验34双相免疫扩散试验返回FLASH双相免疫扩散试验返回FLASH35（3）火箭电泳（3）火箭电泳36返回返回37血清抗体病毒接种细胞或鸡胚计算半数保护率（PD50）（4）中和反应返回血清抗体病毒接种细胞或鸡胚计算半数保护率（PD50）（4）中38返回返回39巨噬细胞功能的检测评价标准：60-80%为正常，实验孔cpm-自发释放孔cpm轻轻振摇不超过1min 外周血单个核细胞（PBMC）密度（1）低渗裂解法：蒸馏水第四节 细胞因子及其受体的检测技术外周血B细胞功能的检测（二）NK细胞细胞的分离一、细胞因子测定的基本原理及方法毒作用分离法外周血B细胞数目的检测LAK细胞的靶细胞：LiBr（一）吞噬细胞的分离和收集单个细胞产生细胞因子的测定技术（ELISPOT,反向溶血空斑试验）实验孔OD值-自发释放孔OD值玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附单核细胞，收集未吸附的淋巴细胞24h后收集细胞于玻璃纤维滤膜二、B细胞数目及功能的检测1.外周血B细胞数目的检测2.外周血B细胞功能的检测返回巨噬细胞功能的检测二、B细胞数目及功能的检测1.外周血B细401.外周血B细胞数目的检测 免疫荧光技术 花环试验返回1.外周血B细胞数目的检测 免疫荧光技术 花环试验返回41荧光显微镜荧光显微镜42返回CD19CD3流式细胞仪返回CD19CD3流式细胞仪43 B细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图 返回 B细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图 返回442.外周血B细胞功能的检测 B细胞非特异性增殖 抗体产生能力返回2.外周血B细胞功能的检测 B细胞非特异性增殖 抗体产45返回B细胞+刺激物（PWM，LPS）返回B细胞+刺激物（PWM，LPS）46溶血空斑试验溶血空斑试验47酶联免疫斑点试验返回酶联免疫斑点试验返回48第三节第三节 细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测一、一、T细胞亚群和数目的检测细胞亚群和数目的检测二、二、T细胞功能的检测细胞功能的检测三、三、其他免疫细胞功能的检测其他免疫细胞功能的检测返回第三节 细胞免疫功能的检测一、T细胞亚群和数目的检测二、T细49一、一、T细胞亚群和数目的检测细胞亚群和数目的检测2.免疫荧光技术1.花环试验3.免疫酶细胞技术返回一、T细胞亚群和数目的检测2.免疫荧光技术1.花环试验350返回玫瑰花环试验正常范围:60-80%E-花环形成率=形成花环的淋巴细胞数淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)返回玫瑰花环试验正常范围:60-80%E-花环形成率=形成51荧光显微镜荧光显微镜52返回流式细胞仪返回流式细胞仪53二、二、T细胞功能的检测细胞功能的检测（一）体外功能实验（二）体内功能实验返回二、T细胞功能的检测（一）体外功能实验（二）体内功能实验返回54（一）体外功能实验（一）体外功能实验1.淋巴细胞增殖试验2.细胞毒试验返回 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞凋亡检测法（一）体外功能实验1.淋巴细胞增殖试验2.细胞毒试验返回551.淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验非特异性刺激物（PHA、ConA）特异性刺激物（抗原）3H-TdR掺入法MTT法形态学计数法1.淋巴细胞增殖试验非特异性刺激物特异性刺激物3H-TdR56形态学计数法转化细胞：体积大，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小未转化细胞：体积小，核染色体致密，核/细胞比例大形态学计数法转化细胞：体积大，染色质疏松呈细网状，核/细胞比57转化率=转化细胞数/淋巴细胞总数评价标准：60-80%为正常，50-59%为偏低，2淋巴细胞+刺激物培养56h加入3H-TdR24h后收集细59第十二章机体免疫功能的检测技术ppt课件60MTT法u 3-4,4-二甲基噻唑2，5二苯基四氮唑溴盐，简称MTT；u 线粒体的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，经盐酸异丙醇溶解后为蓝色溶液；u 比色测定间接反映活细胞数量。返回刺激指数(SI)=刺激孔OD值/对照孔OD值MTT法 3-4,4-二甲基噻唑2，5二苯基四氮唑溴6151Cr释放法释放法杀伤率（%）=实验孔cpm-自发释放孔cpm最大释放孔cpm-自发释放孔cpm10051Cr释放法杀伤率（%）=实验孔cpm-自发释放孔cpm最62返回返回63返回乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（LDH）释放法释放法CTL+靶细胞释放LDH碘硝基氯化四氮唑（INT）红色甲臜（farmazan）比活性测定（OD值）杀伤率（%）=实验孔OD值-自发释放孔OD值最大释放孔OD值-自发释放孔OD值100返回乳酸脱氢酶（LDH）释放法CTL+靶细胞释放LDH碘硝基64靶细胞细胞凋亡检测杀伤率%=（靶细胞对照孔细胞数-共培养孔靶细胞数）/靶细胞对照孔细胞数100%效应细胞+靶细胞细胞凋亡检测法细胞凋亡检测法返回靶细胞细胞凋亡检测杀伤率%=（靶细胞对照孔细胞数-共培养孔靶65三、其他免疫细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测1.巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测3.NK细胞和细胞和LAK细胞功能的检测细胞功能的检测返回2.嗜中性粒细胞功能的检测嗜中性粒细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测1.巨噬细胞功能的检测3.661.巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测炭粒廓清试验吞噬功能的检测巨噬细胞表面受体的检测1.巨噬细胞功能的检测炭粒廓清试验67炭粒廓清试验炭粒廓清试验小鼠静脉注射炭粒悬液测定血中炭粒的浓度血液中炭粒被廓清的速度炭粒廓清试验小鼠静脉注射炭粒悬液测定血中炭粒的浓度血液中炭粒68巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测吞噬率吞噬率=吞噬指数=吞噬红细胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞数 100%吞噬红细胞的总数 计数的巨噬细胞数37保温0.51h 巨噬细胞功能的检测吞噬率=吞噬指数=吞噬红细胞的巨噬细69返回 巨噬细胞巨噬细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图玫瑰花环形成示意图 MM返回 巨噬细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图 MM70第十二章机体免疫功能的检测技术ppt课件71 炎症反应的过程炎症反应的过程红、肿、热、痛 炎症反应的过程红、肿、热、痛72嗜中性粒细胞趋化功能检测嗜中性粒细胞趋化功能检测返回嗜中性粒细胞趋化功能检测返回73第十二章机体免疫功能的检测技术ppt课件74u 外周血淋巴细胞在体外经过IL-2培养 后，诱导产生的一类新型杀伤细胞u 杀伤肿瘤细胞不需抗原致敏u 不受MHC限制性，无特异性LAK（lymphokine activated killer cells）外周血淋巴细胞在体外经过IL-2培养LAK（lymphok75NK细胞和细胞和LAK细胞功能的检测细胞功能的检测NK细胞的靶细胞：K562LAK细胞的靶细胞：LiBr返回NK细胞和LAK细胞功能的检测NK细胞的靶细胞：K562返回76皮肤试验皮肤试验返回皮肤试验返回77第四节第四节 细胞因子细胞因子及其及其受体受体的检测技术的检测技术一、一、细胞因子测定的基本原理及方法细胞因子测定的基本原理及方法二、二、细胞因子受体测定的基本原理及方法细胞因子受体测定的基本原理及方法返回第四节 细胞因子及其受体的检测技术一、细胞因子测定的基本原理78第十二章机体免疫功能的检测技术ppt课件79返回返回80 细胞因子受体 细胞因子受体81返回返回82一、细胞因子测定的基本原理及方法一、细胞因子测定的基本原理及方法1.生物活性检测技术（生物活性检测技术（依赖性细胞株依赖性细胞株、功能测定功能测定等）等）2.免疫学检测技术（免疫学检测技术（ELISA、RIA、FACS）3.分子生物学技术（分子杂交技术、分子生物学技术（分子杂交技术、PCR）4.单个细胞产生细胞因子的测定技术单个细胞产生细胞因子的测定技术（ELISPOT,反向溶血空斑试验反向溶血空斑试验）返回一、细胞因子测定的基本原理及方法1.生物活性检测技术（依赖83返回返回84第十二章机体免疫功能的检测技术ppt课件85第十二章机体免疫功能的检测技术ppt课件86返回TNF-Control返回TNF-Control87细胞内细胞因子染色法细胞内细胞因子染色法（intracellular cytokine staining）BFA阻滞细胞因子释放细胞的固定和破膜荧光抗体染色流式细胞仪检测PMA+Inomycin刺激细胞细胞内细胞因子染色法BFA阻滞细胞因子释放细胞的固定和破膜荧88