第五章-经典免疫学技术课件

第五章 经典免疫学技术第五章 经典免疫学技术第五章 经典免疫学技术第五章 经典免疫第一节第一节 沉淀反应沉淀反应 第二节第二节 凝集反应凝集反应第三节第三节 补体参及的抗原补体参及的抗原 抗体反应抗体反应第四节第四节 中和反应中和反应 第五章第五章经典免疫学技术经典免疫学技术 2第一节沉淀反应第五章 经典免疫学技术2第一节第一节 沉淀反应沉淀反应 第二节第二节 凝集反应凝集反应第三节第三节 补体参及的抗原补体参及的抗原 抗体反应抗体反应第四节第四节 中和反应中和反应 第五章第五章经典免疫学技术经典免疫学技术 3第一节沉淀反应第五章 经典免疫学技术3第一节第一节 沉淀反应沉淀反应 根据抗原及抗体反应的条件及附加因素，沉淀反应可分为两种主要形式：1溶液中沉淀反应 2凝胶中沉淀反应 4第一节沉淀反应根据抗原及抗体反应的条件及附加因第一节第一节 沉淀反应沉淀反应 根据抗原及抗体反应的条件及附加因素，沉淀反应可分为两种主要形式：1溶液中沉淀反应 2凝胶中沉淀反应 5第一节沉淀反应根据抗原及抗体反应的条件及附加因1 1溶液中沉淀反应溶液中沉淀反应（Precipitation reaction in solution）是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的抗原及抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。61溶液中沉淀反应（Precipitationreact溶液中沉淀反应溶液中沉淀反应 盐溶液抗原抗原 +抗体抗体 沉淀沉淀 2056、pH68 抗原：沉淀原 抗体：沉淀素7溶液中沉淀反应1 1溶液中沉淀反应溶液中沉淀反应（Precipitation reaction in solution）（1）环状沉淀试验（2）免疫比浊法（3）免疫沉淀技术81溶液中沉淀反应（Precipitationreact（1 1）环状沉淀试验）环状沉淀试验环状沉淀试验 （ring precipitation test）或毛细管内沉淀反应（precipitation in capillary tube）9（1）环状沉淀试验环状沉淀试验91010（2 2）免疫比浊法）免疫比浊法(immunonephelomytry）可溶性的抗原、抗体在液相中特异结合，形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浑浊。复合物的量及浊度成正比。及标准品比较即可计算出样品中的抗原或抗体含量。11（2）免疫比浊法(immunonephelomytry）1212免免疫疫沉沉淀淀技技术术13免疫沉淀技术131414免疫共沉淀免疫共沉淀15免疫共沉淀15GST pull-downGST pull-down技术技术 16GSTpull-down技术16第一节第一节 沉淀反应沉淀反应 根据抗原及抗体反应的条件及附加因素，沉淀反应可分为两种主要形式：1溶液中沉淀反应 2凝胶中沉淀反应 17第一节沉淀反应根据抗原及抗体反应的条件及附加因2 2凝胶中沉淀反应凝胶中沉淀反应（Precipitation reaction in gel）1968年Ouchterlong发明的。即将抗原抗体溶液放在琼脂凝胶板上的小孔中，使它们彼此对向扩散，在抗原抗体相遇的地方形成沉淀线。182凝胶中沉淀反应（Precipitationreacti2 2凝胶中沉淀反应凝胶中沉淀反应 此沉淀线的突出性质性质是：特异性抗原抗体不能通过；及沉淀线无关的抗原和抗体分子则可自由通过此沉淀线。192凝胶中沉淀反应此沉淀线的突出性质是：特异性抗原2 2凝胶中沉淀反应凝胶中沉淀反应（1）单相免疫扩散试验（2）双相免疫扩散试验（3）免疫电泳（4）火箭电泳试验（5）免疫印迹技术202凝胶中沉淀反应（1）单相免疫扩散试验20单相免疫扩散试验21单相免疫扩散试验212222双相免疫扩散试验23双相免疫扩散试验23（3 3）免疫电泳）免疫电泳（immunoelectrophoresis）24（3）免疫电泳（immunoelectrophoresis）2525（4 4）火箭电泳试验）火箭电泳试验26（4）火箭电泳试验2627272828又称Western blotting电泳印渍及检测（5 5）免疫印渍技术）免疫印渍技术（immunoblottingimmunoblotting）29又称Westernblotting（5）免疫印渍技术（im免疫印渍30免疫印渍303131第一节第一节 沉淀反应沉淀反应 第二节第二节 凝集反应凝集反应第三节第三节 补体参及的抗原补体参及的抗原 抗体反应抗体反应第四节第四节 中和反应中和反应 第五章第五章经典免疫学技术经典免疫学技术 32第一节沉淀反应第五章 经典免疫学技术32第二节第二节 凝集反应凝集反应 1直接凝集反应 2间接凝集反应3桥梁凝集反应 4共同凝集反应 33第二节凝集反应1直接凝集反应33第二节第二节 凝集反应凝集反应 1直接凝集反应 2间接凝集反应3桥梁凝集反应 4共同凝集反应 34第二节凝集反应1直接凝集反应341 1直接凝集反应直接凝集反应（direct agglutinationdirect agglutination）是将细菌或红细胞及其相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。351直接凝集反应（directagglutination1 1直接凝集反应直接凝集反应（1）微生物凝集反应如诊断伤寒病的肥达氏 （Widal reaction）反应（2）同种红细胞凝集反应 如检查血型的血细胞凝集现象361直接凝集反应（1）微生物凝集反应363737第二节第二节 凝集反应凝集反应 1直接凝集反应 2间接凝集反应3桥梁凝集反应 4共同凝集反应 38第二节凝集反应1直接凝集反应382 2间接凝集反应间接凝集反应（indirect agglutination）用可溶性抗原（或抗体）包被在一种及免疫无关的、具一定大小的不溶性颗粒（即载体颗粒，如：乳胶颗粒或红细胞）的表面，然后及相应抗体（或抗原）作用，在有适宜电解质存在的条件下，结合产生的凝集现象。392间接凝集反应（indirectagglutinati2 2间接凝集反应间接凝集反应正向间接凝集反应：将抗原先吸附在载体表面，然后及相应抗体结合产生的凝集反应。反向间接凝集反应：将特异性抗体先吸附在载体表面，然后及相应抗原结合产生的凝集反应。既可检测抗原，也可检测抗体；方法简便、敏感。402间接凝集反应正向间接凝集反应：将抗原先吸附在载体表面，然正向间接凝集反应正向间接凝集反应41正向间接凝集反应41 此方法对检测微量抗原具有较高的敏感性。而且由于相关病原体的抗原成分一般情况下比血清抗体出现早，所以可用于某些传染病如钩端螺旋体抗原和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或原发性肝癌AFP的检测等。反向间接凝集反应反向间接凝集反应42此方法对检测微量抗原具有较高的敏感性。而且由于相关4343第二节第二节 凝集反应凝集反应 1直接凝集反应 2间接凝集反应3桥梁凝集反应 4共同凝集反应 44第二节凝集反应1直接凝集反应443 3桥梁凝集反应桥梁凝集反应 又称Coombs抗球蛋白试验。此试验用于检测不完全抗体。453桥梁凝集反应又称Coombs抗球蛋白试验。此46464747第二节第二节 凝集反应凝集反应 1直接凝集反应 2间接凝集反应3桥梁凝集反应 4共同凝集反应 48第二节凝集反应1直接凝集反应484 4共同凝集反应共同凝集反应 又称协同凝集反应。指由两种颗粒成分相互作用而发生的凝集反应。494共同凝集反应又称协同凝集反应。指由两种颗粒成4 4共同凝集反应共同凝集反应（1）细菌抗体及携带蛋白A的金黄色葡萄球菌Cowan 系致敏，即通过其IgG的Fc段及蛋白A结合，再及相应细菌发生凝集反应。（2）玫瑰花结试验：主要用于研究各种淋巴细胞特性。504共同凝集反应（1）细菌抗体及携带蛋白A的金黄色葡萄球菌C5151E花环形成示意图 52E花环形成示意图52B细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图53B细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图53淋巴细胞的分离54淋巴细胞的分离54玫瑰花结55玫瑰花结55淋巴细胞及红细胞形成玫瑰花结的主要模式 玫瑰花结玫瑰花结的类型的类型 红细胞的类红细胞的类型及处理型及处理 淋巴细胞类型淋巴细胞类型 E花结花结 绵羊红细胞 T、50%NK EA花结花结 抗体致敏的红细胞 B、T、NK、粒细胞、单核细胞及巨噬细胞 EAC花结花结 补体致敏的红细胞 B 56淋巴细胞及红细胞形成玫瑰花结的主要模式玫瑰花结的类型红第一节第一节 沉淀反应沉淀反应 第二节第二节 凝集反应凝集反应第三节第三节 补体参及的抗原补体参及的抗原 抗体反应抗体反应第四节第四节 中和反应中和反应 第五章第五章经典免疫学技术经典免疫学技术 57第一节沉淀反应第五章 经典免疫学技术57第三节第三节补体参及的抗原抗体反应补体参及的抗原抗体反应 1补体参及直接的抗原抗体反应 2补体参及间接的抗原抗体反应 58第三节补体参及的抗原抗体反应1补体参及直接的抗原抗第三节第三节补体参及的抗原抗体反应补体参及的抗原抗体反应 1补体参及直接的抗原抗体反应 2补体参及间接的抗原抗体反应 59第三节补体参及的抗原抗体反应1补体参及直接的抗原抗1 1补体参及直接的补体参及直接的抗原抗体反应抗原抗体反应 （1）溶血反应（2）溶菌反应601补体参及直接的抗原抗体反应（1）溶血反应60（1 1）溶血反应）溶血反应（hemolytic assay）溶血反应常作为是否存在游离补体的指示系统。61（1）溶血反应（hemolyticassay）（1 1）溶血反应）溶血反应 1942年 Rutstein和 Walker根据补体能使兔抗羊红细胞抗体致敏的羊红细胞发生溶血的特点，建立了测定血清中总补体活性的方法（即50%溶血反应CH50 测定方法）62（1）溶血反应1942年Rutstein和Walk（2 2）溶菌反应）溶菌反应 溶菌反应常作为某血清中是否存在相应抗体的检测方法。63（2）溶菌反应溶菌反应常作为某血清中是否存在相应第三节第三节补体参及的抗原抗体反应补体参及的抗原抗体反应 1补体参及直接的抗原抗体反应 2补体参及间接的抗原抗体反应 64第三节补体参及的抗原抗体反应1补体参及直接的抗原抗2 2补体参及间接的补体参及间接的抗原抗体反应抗原抗体反应（1）补体结合试验（2）被动红细胞溶解试验（3）溶血空斑试验 652补体参及间接的抗原抗体反应（1）补体结合试验65（1 1）补体结合试验）补体结合试验（complement fixation test）1901年由Bordet和Gengou首先应用溶血反应作为指示系统，建立的检测抗原抗体反应的方法。66（1）补体结合试验（complementfixation6767补补体体结结合合试试验验原原理理68补体结合试验原理686969（2 2）被动红细胞溶解试验）被动红细胞溶解试验 即吸附抗原的红细胞在有相应抗体和补体存在时，出现红细胞溶解反应。抗原致敏红细胞加入待测血清和补体判断结果（阳性对照：加入相应抗体和补体）70（2）被动红细胞溶解试验即吸附抗原的红细胞在有相（3 3）溶血空斑试验）溶血空斑试验 是测定B淋巴细胞产生和分泌抗体功能的一种体外试验方法。71（3）溶血空斑试验是测定B淋巴细胞产生和分泌抗体72727373溶血空斑试验74溶血空斑试验74第一节第一节 沉淀反应沉淀反应 第二节第二节 凝集反应凝集反应第三节第三节 补体参及的抗原补体参及的抗原 抗体反应抗体反应第四节第四节 中和反应中和反应 第五章第五章经典免疫学技术经典免疫学技术 75第一节沉淀反应第五章 经典免疫学技术75第四节第四节 中和反应中和反应 中和反应（neutralization）：是免疫学和病毒学中常用于检测中和抗体是否存在及其效价的试验，反映抗体中和病毒感染性或细菌毒素的生物学效应。76第四节中和反应中和反应（neutralization）中和抗体：病原微生物侵入机体后，使之产生能中和相应微生物及其毒性产物（毒素），从而使病原微生物丧失感染能力或毒力的抗体。（中和抗体：能及病毒结合，使其失去感染力的抗体。抗毒素：能及细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体。）77 中和抗体：病原微生物侵入机体后，使之产生能中和相中和反应的原理中和反应的原理 即将被检血清及病原微生物混合，经适当时间作用后，接种于宿主系统（包括动物、鸡胚或培养细胞），按照对其产生的保护效果的差异，可判断该微生物或毒素是否已被中和，并计算出中和的程度（中和指数），即代表中和抗体效价。78中和反应的原理即将被检血清及病原微生物混合，经适当时间中和反应的特点：中和反应的特点：（1）检测机体内是否存在中和抗体以及中和抗体的效价，直接反应机体抗病毒的能力，有利于临床诊断；（2）中和抗体在体内存留时间一般较长，可用于流行病学调查；（3）中和反应有严格的种、型特异性，可对分离的病毒进行准确的分类鉴定。缺点缺点：操作麻烦，试验时间较长。79中和反应的特点：（1）检测机体内是否存在中和抗体以及中和抗中和反应的类型：中和反应的类型：1终点法中和反应 2蚀斑减少法中和反应 80中和反应的类型：1终点法中和反应801 1终点法中和反应终点法中和反应 根据滴定被血清中和后的残余毒力，来判断血清中中和抗体的效价。（1）固定病毒稀释血清法 （2）固定血清稀释病毒法 811终点法中和反应根据滴定被血清中和后的残余毒力（1 1）固定病毒稀释血清法）固定病毒稀释血清法 先固定病毒的毒价，再及等量的递进稀释的待测血清混合，置37 1小时，每一稀释度接种36只动物（或鸡胚、培养细胞），接种后记录每组动物（或鸡胚）的存活数和死亡数（或培养细胞破坏程度），然后计算其半数保护率（PD50），即该血清的中和效价。82（1）固定病毒稀释血清法先固定病毒的毒价，再及（2 2）固定血清稀释病毒法）固定血清稀释病毒法 将病毒原液作10倍递进稀释，分别及等量正常血清（对照组）、待测血清（试验组）混合，置37 1小时，每一稀释度接种36只动物（或鸡胚、培养细胞），接种后记录每组动物（或鸡胚）的死亡数（或培养细胞破坏程度），然后计算其半数致死率（LD50）和中和指数。83（2）固定血清稀释病毒法将病毒原液作10倍递进稀（2 2）固定血清稀释病毒法）固定血清稀释病毒法 中和指数=试验组LD50/对照组LD5084（2）固定血清稀释病毒法中和指数=842蚀斑减少法中和反应是血清中和抗体的一种较为敏感的检测方法，抗体效价是以蚀斑数减少50的血清稀释度表示。试验使用定量的病毒(100PFU)及不同稀释度的等量血清混合后感染细胞，再及营养琼脂混合后铺板并培养，数天后统计蚀斑数。852蚀斑减少法中和反应是血清中和抗体的一8686谢谢大家！结结 语语谢谢大家！结 语