第二十一章免疫学所有实验课件

第二十一章第二十一章 免疫学检测原理免疫学检测原理 u 免免疫疫学学检检测测乃乃借借助助免免疫疫学学、细细胞胞生生物物学学和和分分子子生生物物学学理理论论或或技技术术，对对抗抗原原、抗抗体体、免免疫疫细细胞胞及及其其分分泌泌的的细细胞胞因因子子等等进进行行定定性性或或定定量量检检测测。免免疫疫学学检检测测技技术术在在医医学学生生物物学学研研究究领领域域得得到到广广泛泛应应用用，并并在在临临床床实实践践中中用用于于探探讨讨免免疫疫相相关关疾疾病病的的发发病病机机制制及及其其诊诊断断、病病情情监监测测与与疗疗效效评评价价等等。随随着着现现代代免免疫疫学学以以及及细细胞胞生生物物学学、分分子子生生物物学学等等相相关学科的进展，免疫学检测技术不断发展和更新。关学科的进展，免疫学检测技术不断发展和更新。u第一节第一节 基于抗原基于抗原-抗体反应的检测方法抗体反应的检测方法u第二节第二节 免疫细胞的检测免疫细胞的检测u第三节第三节 免疫分子的检测免疫分子的检测 第二十一章 免疫学检测原理 免疫学检测乃借助免疫学、细胞学习指导学习指导u1、掌握凝集反应和沉淀反应的概念、掌握凝集反应和沉淀反应的概念u2、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称u3、熟悉三大标记技术的原理和方法及其应用、熟悉三大标记技术的原理和方法及其应用u4、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的应用、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的应用学习指导1、掌握凝集反应和沉淀反应的概念第一节第一节 基于抗原基于抗原-抗体反应的检测方法抗体反应的检测方法u一、抗原抗体结合反应的特点（熟悉）一、抗原抗体结合反应的特点（熟悉）u （一）特异性和交叉反应（一）特异性和交叉反应u （二）抗原（二）抗原-抗体结合的带现象与可见性抗体结合的带现象与可见性u抗体反应中，可能出现抗原或抗体过剩的情况，由于过抗体反应中，可能出现抗原或抗体过剩的情况，由于过剩一方的结合价不能被完全占据，多呈游离的小分子复剩一方的结合价不能被完全占据，多呈游离的小分子复合物形式，或所形成的复合物易解离，不能被肉眼察见，合物形式，或所形成的复合物易解离，不能被肉眼察见，此为前带现象（此为前带现象（prozone）即抗体过剩，或）即抗体过剩，或后带现象后带现象(postzone)即抗原过剩。即抗原过剩。u （三）可逆性（三）可逆性u抗原抗原-抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但可逆。可逆。第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法一、抗原抗体结合反第一节第一节 二、抗原二、抗原-抗体反应的影响因素（熟悉）抗体反应的影响因素（熟悉）u （一）电解质（一）电解质u （二）酸碱度抗原抗体反应的最适（二）酸碱度抗原抗体反应的最适pH是是68。u （三）温度（三）温度 抗体抗体-抗原反应的最适温度为抗原反应的最适温度为37。u （四）抗原和抗体的性质四）抗原和抗体的性质u抗体的特异性和亲和力是决定抗原抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。抗体反应的关键因素。u抗原和抗体的浓度、比例对抗原抗原和抗体的浓度、比例对抗原-抗体反应的影响最大，抗体反应的影响最大，是决定性因素是决定性因素 第一节 二、抗原-抗体反应的影响因素（熟悉）（一第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（一）凝集反应（图（一）凝集反应（图21-1）（掌握）（掌握）u 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，此为定条件下出现肉眼可见的凝集物，此为凝集反应凝集反应(agglutination)。u 1直接凝集直接凝集 u 2间接凝集间接凝集 u3间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验 第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（一）凝集反应（各种凝集反应示意图各种凝集反应示意图各种凝集反应示意图第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（二）沉淀反应（掌握）（二）沉淀反应（掌握）u 可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各种微生物蛋白分子等）与相应抗体结合后，在一定条件种微生物蛋白分子等）与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀，此为下出现肉眼可见的沉淀，此为沉淀反应沉淀反应(precipitation)。u1单向免疫扩散单向免疫扩散(single immunodiffusion)u2双向免疫扩散双向免疫扩散(double immunodiffusion)u3免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis)u 4免疫比浊免疫比浊(immunonephelometry)第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（二）沉淀反应（单向免疫扩散单向免疫扩散(single immunodiffusion)单向免疫扩散(single immunodiffusion)双向免疫扩散双向免疫扩散(double immunodiffusion)双向免疫扩散(double immunodiffusion)免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis)免疫电泳(immunoelectrophoresis)对流免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（三）补体参与的反应（了解）（三）补体参与的反应（了解）u应用抗体与红细胞表面抗原结合，激活反应体系中的补应用抗体与红细胞表面抗原结合，激活反应体系中的补体成分，根据溶血现象判定试验结果。补体结合试验和体成分，根据溶血现象判定试验结果。补体结合试验和溶血空斑试验（后叙）均属此类反应。补体结合试验曾溶血空斑试验（后叙）均属此类反应。补体结合试验曾用于检测多种细菌、病毒的抗原或抗体，因易受多种试用于检测多种细菌、病毒的抗原或抗体，因易受多种试验条件影响，已渐被其他方法取代。此外，补体依赖的验条件影响，已渐被其他方法取代。此外，补体依赖的微量细胞毒实验曾用于微量细胞毒实验曾用于HLA的血清学分型，方法是：将的血清学分型，方法是：将标准分型血清与待检淋巴细胞反应，再加入兔补体，若标准分型血清与待检淋巴细胞反应，再加入兔补体，若细胞表面表达相应细胞表面表达相应HLA抗原，则被溶解。溶解细胞可被抗原，则被溶解。溶解细胞可被台盼蓝或伊红染料着色，而活细胞不着色，藉此判定结台盼蓝或伊红染料着色，而活细胞不着色，藉此判定结果。果。第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（三）补体参与的第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（四）免疫标记技术（熟悉）（四）免疫标记技术（熟悉）u 免疫标记技术（免疫标记技术（immunolabelling technique）乃用）乃用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目前应用最为广泛抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。定量、定位等优点。u。第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（四）免疫标记第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术u1免疫荧光法免疫荧光法(immunofluorescence，IF)此法乃用此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。借此对抗原进行定性或定位。u （1）直接荧光法：）直接荧光法：u （2）间接荧光法：）间接荧光法：第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（四）免疫标记免疫荧光法免疫荧光法(immunofluorescence，IF)免疫荧光法(immunofluorescence，IF)第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术u2酶免疫测定酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA)u （1）酶联免疫吸附试验）酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)：是酶免疫测定中应是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。其基本方用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。其基本方法是：将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微法是：将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原量反应板）表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，借抗体反应在固相表面进行，借助洗涤将固相上的抗原助洗涤将固相上的抗原-抗体复合物与液相中游离成分分抗体复合物与液相中游离成分分离（图离（图21-6）。）。ELISA的操作方法很多，以下简介几种的操作方法很多，以下简介几种基本方法。基本方法。第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（四）免疫标记第一节第一节 基本检测方法基本检测方法-（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术u1）双抗体夹心法：）双抗体夹心法：u2）间接法：）间接法：u 3)酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(ELISPOT):其原理是：其原理是：u4）BAS-ELISA：uELISA技术的优点是灵敏度高、操作简便、稳定性强，技术的优点是灵敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等 第一节 基本检测方法-（四）免疫标记技术1）双抗体间接法间接法间接法第二十一章免疫学所有实验课件第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术u（2）免疫组化技术）免疫组化技术(immunohitochemistry techenique)：u应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。常用技术包括酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）、免常用技术包括酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）、免疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）等胶体金、过氧化物酶标记）等 第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（四）免疫标记第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术u3放射免疫测定法放射免疫测定法(radioimmunoassay，RIA)u 乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，抗体反应的特异性，检测灵敏度达检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为水平。常用于标记的放射性核素为125I和和131I，分为液相和固相两种方法。该法常用于测定微，分为液相和固相两种方法。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、吗啡、地高辛、IgE等。等。第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（四）免疫标记第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术u4化学发光免疫分析化学发光免疫分析 u将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。质（甲状腺素等激素）。第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（四）免疫标记第一节第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法u（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术u5免疫印迹法免疫印迹法(immunoblot)u 该法又称该法又称Western印迹法印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。该法能对分子应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原（图测多种病毒抗体或抗原（图21-10）。）。第一节 三、抗原抗体反应的基本检测方法（四）免疫标记第二节第二节 免疫细胞的检测免疫细胞的检测u一、免疫细胞及其亚类计数（了解）一、免疫细胞及其亚类计数（了解）u （一）外周血单个核细胞的分离（一）外周血单个核细胞的分离u体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，常用，常用的方法是葡聚糖的方法是葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。梯度离心法。第二节 免疫细胞的检测一、免疫细胞及其亚类计数（了解）第二节第二节 一、免疫细胞及其亚类计数（了解）一、免疫细胞及其亚类计数（了解）u（二）淋巴细胞亚群的分离（二）淋巴细胞亚群的分离 u1尼龙棉分离法尼龙棉分离法u2E花结分离法花结分离法 u3洗淘法洗淘法u4流式细胞术流式细胞术(flow cytometry，FCM)u 5磁分离技术磁分离技术第二节 一、免疫细胞及其亚类计数（了解）（二）淋巴细胞亚第二十一章免疫学所有实验课件第二十一章免疫学所有实验课件第二节第二节 一、免疫细胞及其亚类计数一、免疫细胞及其亚类计数u（三）淋巴细胞亚群计数（三）淋巴细胞亚群计数u1免疫荧光技术免疫荧光技术 u2微量细胞毒试验微量细胞毒试验 u在补体存在下，针对淋巴细胞在补体存在下，针对淋巴细胞CD分子的分子的McAb与相应与相应CD分子结合，可激活补体而使细胞溶解，通过活细胞和死分子结合，可激活补体而使细胞溶解，通过活细胞和死细胞对染料着色的不同，即可判断待检细胞是否表达特细胞对染料着色的不同，即可判断待检细胞是否表达特定定CD分子，从而对淋巴细胞亚群进行计数分子，从而对淋巴细胞亚群进行计数 第二节 一、免疫细胞及其亚类计数（三）淋巴细胞亚群计数第二节第二节 二、淋巴细胞功能测定（了解）二、淋巴细胞功能测定（了解）（一）淋巴细胞功能测定的体外试验（一）淋巴细胞功能测定的体外试验u1.淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验u（1）3H-TdR掺入法：掺入法：u（2）MTT法：法：u（3）形态学计数法：）形态学计数法：第二节 二、淋巴细胞功能测定（了解）（一）淋巴细胞功能测第二节第二节 二、淋巴细胞功能测定（了解）二、淋巴细胞功能测定（了解）u2细胞毒试验细胞毒试验 u CTL、NK细胞可直接杀伤不同靶细胞（如肿瘤细胞、移细胞可直接杀伤不同靶细胞（如肿瘤细胞、移植供体细胞等）。通过检测杀伤活性可用于肿瘤免疫、植供体细胞等）。通过检测杀伤活性可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面研究。移植排斥反应、病毒感染等方面研究。u（1）51Cr释放法：（图释放法：（图21-11）。）。u（2）乳酸脱氢酶（）乳酸脱氢酶（LDH）酶释放法：）酶释放法：u（3）细胞凋亡检查法：）细胞凋亡检查法：第二节 二、淋巴细胞功能测定（了解）2细胞毒试验 第二节第二节 二、淋巴细胞功能测定二、淋巴细胞功能测定u3分泌功能测定（了解）分泌功能测定（了解）u（1）细胞因子分泌细胞的测定：）细胞因子分泌细胞的测定：u（2）抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验）抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验(hemolytic plaque assay)，即测定针对，即测定针对SRBC表面已知抗原的抗体表面已知抗原的抗体形成细胞数目。其原理是：抗体形成细胞分泌的形成细胞数目。其原理是：抗体形成细胞分泌的Ig与与SRBC表面抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。每表面抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数（图成细胞数（图21-12）。亦可采用）。亦可采用RHPA和和ELISPOT法检法检测抗体分泌细胞。测抗体分泌细胞。u 图图21-12 溶血空斑试验溶血空斑试验第二节 二、淋巴细胞功能测定3分泌功能测定（了解）第二节第二节 二、淋巴细胞功能测定二、淋巴细胞功能测定u（二）淋巴细胞功能测定的体内试验（了解）（二）淋巴细胞功能测定的体内试验（了解）u正常机体对特定抗原产生细胞免疫应答后，再用相同抗正常机体对特定抗原产生细胞免疫应答后，再用相同抗原作皮肤试验，即出现以局部红肿为特征的迟发型超敏原作皮肤试验，即出现以局部红肿为特征的迟发型超敏反应，细胞免疫低下者呈阴性反应。皮肤试验方法简便，反应，细胞免疫低下者呈阴性反应。皮肤试验方法简便，可辅助诊断某些病原微生物感染（结核杆菌、麻风杆菌）可辅助诊断某些病原微生物感染（结核杆菌、麻风杆菌）、免疫缺陷病等。皮肤试验常用的生物性抗原多从病原、免疫缺陷病等。皮肤试验常用的生物性抗原多从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素、链激酶体中提取，如结核菌素、麻风菌素、链激酶-链道酶、念链道酶、念珠菌素、腮腺炎病毒等。珠菌素、腮腺炎病毒等。第二节 二、淋巴细胞功能测定（二）淋巴细胞功能测定的体第三节第三节 免疫分子的检测免疫分子的检测u一、免疫球蛋白的测定（了解）一、免疫球蛋白的测定（了解）u 免疫球蛋白的测定有两类方法：免疫球蛋白的测定有两类方法：在体外用已知抗原在体外用已知抗原检测相应抗体，用于多种感染性疾病的辅助诊断与流行检测相应抗体，用于多种感染性疾病的辅助诊断与流行病学调查（前已述及）；病学调查（前已述及）；用已知抗体对各类免疫球蛋用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定。检测血清含量高的白作定性、定量测定。检测血清含量高的IgG、IgA、IgM时，可用免疫比浊法；检测时，可用免疫比浊法；检测IgD、IgE选用选用ELISA、RIA等灵敏度高的方法。诊断免疫球蛋白异常性疾病（如等灵敏度高的方法。诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法方法 第三节 免疫分子的检测一、免疫球蛋白的测定（了解）第三节第三节 二、补体测定（熟悉）二、补体测定（熟悉）u测定血清补体含量与活性有助于了解体内补体激活状况，测定血清补体含量与活性有助于了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断。对血清含量高的辅助有关疾病的诊断。对血清含量高的C3、C4、B因子因子等，可用免疫比浊法，其他含量低的成分则借助等，可用免疫比浊法，其他含量低的成分则借助ELISA、RIA等方法。血清总补体活性测定常采用等方法。血清总补体活性测定常采用50%补体溶血法补体溶血法（CH50），其原理是：用），其原理是：用SRBC和兔抗和兔抗SRBC作为抗原作为抗原抗体复合物，通过经典途径激活待检血清中的补体，导抗体复合物，通过经典途径激活待检血清中的补体，导致致SRBC溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，则影响溶血结果，通常以则影响溶血结果，通常以50%溶血所需的最小补体量表溶血所需的最小补体量表示总补体活性示总补体活性 第三节 二、补体测定（熟悉）测定血清补体含量与活性有助于第三节第三节 三、细胞因子检测三、细胞因子检测（了解）（了解）细胞因子检测可分为免疫学测定法、生物学活性测定法细胞因子检测可分为免疫学测定法、生物学活性测定法及分子生物学测定法。及分子生物学测定法。u（一）免疫学测定法（一）免疫学测定法u1分泌性细胞因子检测分泌性细胞因子检测 常用方法为双抗体夹心法、常用方法为双抗体夹心法、ELISA、免疫斑点法、放射免疫法（、免疫斑点法、放射免疫法（RIA）、）、ELISPOT、免疫印迹法等。某些细胞因子含量甚微的样品（如脑脊免疫印迹法等。某些细胞因子含量甚微的样品（如脑脊液）可用免疫聚合酶链反应（液）可用免疫聚合酶链反应（immuno-PCR）。）。u2胞内细胞因子检测胞内细胞因子检测 采用采用FCM免疫荧光技术可从单细免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的细胞因子，用两种不同的胞水平检测不同细胞亚群中的细胞因子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同细胞因子的抗体，可在同一细胞荧光素分别标记抗不同细胞因子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的细胞因子，也可用多参数流式细内同时检测两种不同的细胞因子，也可用多参数流式细胞术对胞内多种细胞因子进行检测。胞术对胞内多种细胞因子进行检测。第三节 三、细胞因子检测（了解）细胞因子检测第三节第三节 三、细胞因子检测三、细胞因子检测u（二）生物活性测定法（二）生物活性测定法u1促进细胞增殖和增殖抑制法促进细胞增殖和增殖抑制法u2抗病毒活性测定法抗病毒活性测定法u3直接杀伤法直接杀伤法u4趋化活性测定法趋化活性测定法 u此外，某些细胞因子能诱导靶细胞表达某些膜分子或可此外，某些细胞因子能诱导靶细胞表达某些膜分子或可溶性蛋白质，可用荧光素标记抗体检测表达相应分子的溶性蛋白质，可用荧光素标记抗体检测表达相应分子的细胞数，或测定细胞所分泌的蛋白质，间接了解细胞因细胞数，或测定细胞所分泌的蛋白质，间接了解细胞因子活性。子活性。第三节 三、细胞因子检测（二）生物活性测定法第三节第三节 三、细胞因子检测三、细胞因子检测u（三）分子生物学测定法（三）分子生物学测定法u具体方法为聚合酶链反应（具体方法为聚合酶链反应（PCR）、实时定量）、实时定量PCR、RNA印迹法、核酸酶保护分析法和原位杂交法等，例如：印迹法、核酸酶保护分析法和原位杂交法等，例如：根据细胞因子基因核苷酸序列设计相应引物，借助逆转根据细胞因子基因核苷酸序列设计相应引物，借助逆转录录PCR测定待检细胞中特异性测定待检细胞中特异性mRNA。第三节 三、细胞因子检测（三）分子生物学测定法第三节第三节 四、四、CD分子、表面受体和黏附分子的检测（了解）分子、表面受体和黏附分子的检测（了解）u检测细胞表面检测细胞表面CD分子、表面受体和黏附分子可用于鉴别分子、表面受体和黏附分子可用于鉴别免疫细胞及其亚类，并了解其分化、活化状况。用已知免疫细胞及其亚类，并了解其分化、活化状况。用已知的抗的抗CD分子、表面受体或黏附分子抗体可鉴定细胞表面分子、表面受体或黏附分子抗体可鉴定细胞表面相应膜分子，常用的方法有间接免疫荧光法、流式细胞相应膜分子，常用的方法有间接免疫荧光法、流式细胞术等。某些术等。某些CD分子、受体分子和黏附分子还存在可溶性分子、受体分子和黏附分子还存在可溶性形式，可采用形式，可采用ELISA等免疫学方法测定其含量。等免疫学方法测定其含量。第三节 四、CD分子、表面受体和黏附分子的检测（了解第三节第三节 五、五、HLA型别分析（了解）型别分析（了解）u以往主要借助血清学和细胞学方法进行以往主要借助血清学和细胞学方法进行HLA型别分析，型别分析，目前基因分型已成为主流技术，常用者为指纹图谱技术、目前基因分型已成为主流技术，常用者为指纹图谱技术、聚合酶链反应聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)、聚合酶链反应聚合酶链反应-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、）、聚合酶链反应聚合酶链反应-单链构象多态性单链构象多态性(PCR-SSCP)、聚合酶链聚合酶链反应反应-序列特异性引物序列特异性引物（PCR-SSP）、）、单核苷酸多态性单核苷酸多态性分析分析（SNP）等。等。HLA分型技术在同种移植供、受者配分型技术在同种移植供、受者配型、亲子鉴定和某些疾病研究中已被广泛应用。型、亲子鉴定和某些疾病研究中已被广泛应用。第三节 五、HLA型别分析（了解）以往主要借助血清学和本章小结本章小结1、掌握凝集反应和沉淀反应的概念、掌握凝集反应和沉淀反应的概念2、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称3、熟悉三大标记技术的原理和方法及其应用、熟悉三大标记技术的原理和方法及其应用4、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的应用、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的应用本章小结1、掌握凝集反应和沉淀反应的概念