显微镜的七种观察方法-课件(同名1161)

）1-显微微镜的七种的七种观察方法察方法2-按按观察方法分七种察方法分七种明场暗场荧光偏光相差DIC霍夫曼3-显微微观察方式察方式4-按按观察方法分察方法分 7-11.1.明明场:照明光直接通过聚光镜入射于试样，并透过试样后进入物镜并最终被观察到。5-明明 场6-明明场观察方式察方式常常规观察方式察方式应用用领域：域：常规镜检、病理、染色标本优点：点：视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单，价格低，物镜适用于荧光观察缺点：缺点：透明标本对比度低，标本没有立体感7-按按观察方法分察方法分 7-22.2.暗暗场:照明光通过物镜外围射于试样，来自试样的干涉及衍射光进入物镜并最终被观察到。8-暗暗 场9-1 原理原理丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。2 特点特点观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 0.004 um(明场0.4um)”超显微“。3 缺点缺点只能观察到物体存在、运动和外部形态不方便调节标本要求高（灰尘、盖片、载片）10-4 应用：用：微小粒子、细菌形态观察、细菌记数，透明标本观察等11-按按观察方法分察方法分 7-33.3.荧光光:利用某些物质在受到了紫外光或短波长的光激发照射以后能够发射出比激发光波长长的荧光的特性的观察方法12-荧 光光13-什么是什么是荧光光?l 物物质中的中的电子吸收光的能量由低能状子吸收光的能量由低能状态转变为高能状高能状态，再回到低能状，再回到低能状态时释放出的光，是非放出的光，是非温度温度辐射光射光冷光。即：物冷光。即：物质吸收短波光，吸收短波光，发射出的射出的长波光。波光。l显微微镜荧光利用光源激光利用光源激发光化光化荧光光14-荧光的种光的种类自自发（固有）（固有）荧光光 二次二次荧光光15-荧光的性光的性质v吸收光，必需有激吸收光，必需有激发光源光源v荧光波光波长激激发波波长（损失失热能）能）v荧光光强度极小于激度极小于激发光的光的强度度v有不同程度的衰减有不同程度的衰减v荧光光强度取决于激度取决于激发光光强度、被度、被检物物浓度、度、荧光效率光效率16-荧光光显微微镜的的优点和用途点和用途优点：点：v检出能力高（放大作用）出能力高（放大作用）v对细胞的刺激小（可以活体染色）胞的刺激小（可以活体染色）v能能进行多重染色行多重染色用途：用途：v物体构造的物体构造的观察察荧光素光素v荧光的有无、色光的有无、色调比比较进行物行物质判判别抗体抗体荧光等光等v发荧光量的光量的测定定对物物质定性、定量分析定性、定量分析17-荧光光显微微镜的种的种类 透射式透射式18-荧光光显微微镜的种的种类落射式落射式19-荧光光显微微镜的主要部件的主要部件 透射式透射式v汞灯光源汞灯光源v激激发滤色色镜v吸收吸收滤色色镜v暗暗场聚光聚光镜 落射式落射式v汞灯光源汞灯光源v激激发滤色色镜v分色分色镜v吸收吸收滤色色镜20-落射落射荧光光显微微镜的构造的构造吸收吸收吸收吸收滤滤色色色色镜镜激激激激发滤发滤色色色色镜镜21-落射落射荧光光显微微镜的构造的构造22-荧光光显微微镜光源光源 汞灯光源汞灯光源:提供激提供激发光光(U(U、V V、B B、G)G)氙灯光源：氙灯光源：高峰高峰值更更宽，更，更稳定定23-荧光光显微微镜激激发透透镜组 激激发滤色色镜:激激发波波长选择 激激发透透镜组（激（激发块）:T%nmBAND PASS入射光入射光发射光射光激激发 滤色色镜分光分光 滤色色镜吸收吸收 滤色色镜24-落射落射荧光光显微微镜各部件特性和各部件特性和作用作用 吸收吸收滤色色镜:荧光透光透过,阻阻挡杂光光 分色分色镜:反射激反射激发光光,荧光透光透过A 透透过AA 反射反射BB 透透过B 阻阻挡nmnmT%T%A25-落射落射荧光光显微微镜各部件特性和各部件特性和作用作用 吸收吸收滤色色镜:荧光透光透过,阻阻挡杂光光 分色分色镜:反射激反射激发光光,荧光透光透过A 透透过AA 反射反射BB，C 透透过nmnmT%T%AC26-滤色色镜的的选择荧荧光素的特性光素的特性光素的特性光素的特性滤滤色色色色镜镜的特性的特性的特性的特性激激激激发发分色分色分色分色吸收吸收吸收吸收27-带宽对图象的影响象的影响SWB:BP420-480SWB:BP420-480WB:BP450-480WB:BP450-480WIB:BP460-490WIB:BP460-490NB:BP470-490NB:BP470-490FITC+PIFITC+PI28-多重染色多重染色标本的多色本的多色观察察FITC+Texas FITC+Texas Red+DAPIRed+DAPI29-三色三色滤色色镜的特性曲的特性曲线激激激激发发分色分色分色分色吸收吸收吸收吸收30-双重染色双重染色标本的本的单色和双色色和双色观察察 WUWU WIBWIBDUALDUAL BANDBANDWIBAWIBAWIGWIGWIBWIBDAPI+FITCDAPI+FITCFITC+PIFITC+PI31-单色色滤色色镜的特性曲的特性曲线32-双色双色滤色色镜的特性曲的特性曲线33-现行行显微微镜特点和各种特点和各种滤色色镜34-自由自由组合合 激激发块吸收吸收吸收吸收滤滤色色色色镜镜激激激激发滤发滤色色色色镜镜分色分色分色分色镜镜35-油油镜应使使用用荧光光油油36-物物镜光光栏的运用的运用光光栏全开启全开启光光栏适当关小适当关小减少减少杂散光干散光干扰37-荧光的衰减光的衰减 防衰减的方法防衰减的方法v使用抗衰减使用抗衰减剂v选择衰减小的衰减小的荧光素光素v降低激降低激发光光强度度v降低降低标本中氧的本中氧的浓度度有衰减的有衰减的标本本38-使用抗衰减使用抗衰减剂的效果的效果39-汞灯灯箱构造汞灯灯箱构造灯室，上下、左右旋灯室，上下、左右旋钮，聚光，聚光镜旋旋钮40-按按观察方法分察方法分 7-44.4.偏光偏光:有些物质在两个呈一定夹角的偏光滤片之间可现呈鲜明的对比，或根据双折射性能和定向呈现颜色41-偏偏 光光42-1 原理原理依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜自然光（多自然光（多振振动面）面）偏振器偏振器1偏振器偏振器2偏振光（偏振光（单一振一振动面）面）各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同，晶体、纤维等43-应用：用：矿物质、化学物品鉴别鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体植物病理检验鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等44-v偏光显微镜主要用于检测矿石,地质大学会用到,特别是可以用来鉴定珠宝,另外可以检测生物内骨骼,这个我还没有遇见实例,还可以检测生物化学结晶,化学院用来观察结晶液像,其他在纺织物品化学成分上检测上,物理芯片上等,凡是观察双折射晶体会使用偏光显微镜。45-按按观察方法分察方法分 7-55.5.相相衬（差）（差）:利用光线通过分别处于聚光镜与物镜的一对互补的光环后产生干涉（强度叠加或减弱），即相位差转变成了光强差，从而可清楚观察到使原来不易看清的透明类样品（即相位物体，如活细胞）。46-相相 差（差（衬）47-相相 差（差（衬）48-1 原理原理利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差共共轭面：吸收光面：吸收光线，直射光通，直射光通过补偿面：相位推面：相位推迟，衍射光通，衍射光通过物物镜相相板板 聚光聚光镜环状光状光阑49-2 特点特点鉴定活体细胞最实用、最经济的方法3 缺点缺点需要光强高切片不能太厚(510um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜50-4 应用：用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)51-按按观察方法分察方法分 7-66.DIC:6.DIC:照明光由微分干涉照明光由微分干涉对比棱比棱镜变为两束衍射光，并使两束衍射光，并使样品高度品高度差异造成在光路上的微小差异，而差异造成在光路上的微小差异，而光路差异光路差异变为利用微分干涉利用微分干涉对比棱比棱镜和和检偏振器的明暗偏振器的明暗对比。有比。有时也也利用敏感色板（波利用敏感色板（波长补偿片），加片），加强了高度差异的了高度差异的颜色色变化。化。52-DIC相衬DIC微分干涉相微分干涉相衬53-1 原理原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。54-2 特点特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。55-3 缺点缺点需要光强高，双折射物质不能达到DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂56-4 应用：用：无色透明活体无色透明活体标本的本的细微微结构，无色构，无色荧光光标本，本，染色染色标本，本，显微操作等微操作等57-按按观察方法分察方法分 7-77.7.霍夫曼:光线穿过设于聚光镜内的狭缝光阑后并经“相位物体”（透明体）折射，再经过专用物镜内的具有暗、灰、明三个区的一块滤光片，而最终使光线按折射角的不同呈明暗的变化，其所成的像也类似DIC那样具有浮雕效果。58-霍霍 夫夫 曼曼59-1 原理原理斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。60-2.历史史1975年，Robert Hoffman 博士发明2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品3.特点特点提高未染色标本的可见性和对比度；图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕；可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头)；可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织；聚光镜的工作距离可以设计的更长；RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察61-4.缺点缺点观察效果与标本方向密切相关操作较复杂必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜观察荧光效果不如明场物镜5.应用用所有类型的细胞，组织（无论活体，染色，未染色），晶体表面细节，透明聚合物，玻璃和其它类似材料，尤其适用于显微操作62-63-