无病毒植物的培养培训课件

无病毒植物的培养第一节植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义病病毒毒之之所所以以致致病病不不是是由由于于消消耗耗细细胞胞养养分分或或通通过过毒毒素素杀杀死死细细胞胞，而而是是利利用用细细胞胞内内物物质质占占领领空空间间，干干扰扰细细胞胞的的代代谢谢过过程程，促促使使细细胞胞产产生生一一些些对对细细胞胞或或生生物物的的生生命命和和正正常常功功能能有有害害的的异异常常物物质质和和条条件件，这这使使得得植植物物病病毒毒病病的的防防治治较较其其他他植植物物病病害害防防治治更更为为困困难难，常常给给生生产产带带来来灾灾难难的的损损失失，被称为被称为“植物的癌症植物的癌症”。2无病毒植物的培养一、植物病毒的危害一、植物病毒的危害植植物物病病毒毒已已超超过过600种种，严严重重危危害害着着农农业业生生产。产。在在果果树树、蔬蔬菜菜、花花卉卉、林林木木以以及及农农作作物物上上皆皆有有发发现现。随随着着生生产产栽栽培培时时间间的的推推移移，危危害害越越来来越越严严重重，发发现现的的病病毒毒种种类类也也越越来越多。来越多。3无病毒植物的培养病毒调查4无病毒植物的培养5无病毒植物的培养危害园艺植物的病毒数目危害园艺植物的病毒数目6无病毒植物的培养如侵染菊花的病毒和类病毒有如侵染菊花的病毒和类病毒有19种之多种之多 如如 无子病毒无子病毒(CAV)潜隐病毒潜隐病毒(CLV)B病毒病毒(CVB)轻斑驳病毒轻斑驳病毒(CMMV)矮化病毒矮化病毒(CSV)脉斑驳病毒脉斑驳病毒(CVMV)退绿斑驳类病毒退绿斑驳类病毒(CCMV)等等 7无病毒植物的培养4种对草莓生产造成重大种对草莓生产造成重大影响影响:斑驳病毒（斑驳病毒（SMoV）草莓黄边病毒（草莓黄边病毒（SMYEV）草莓镶脉病毒（草莓镶脉病毒（SVBV）草莓皱缩病毒草莓皱缩病毒（SCrV）、）、8无病毒植物的培养甘薯根腐病.甘薯叶点病甘薯枯萎病甘薯黑痣病9无病毒植物的培养2.病毒的特性及其侵染病毒的特性及其侵染多植物病毒多植物病毒不经种子不经种子传播，多数以种子繁殖后代的传播，多数以种子繁殖后代的植物，可以从轻度罹病植株上采集种子，播种繁植物，可以从轻度罹病植株上采集种子，播种繁殖，不会将病毒传至下一代殖，不会将病毒传至下一代。（专化性强的病毒。（专化性强的病毒除外，如豆类病毒除外，如豆类病毒由一种专化性强的蚜虫传由一种专化性强的蚜虫传播播)可随着种子传播。）可随着种子传播。）对于有性生殖退化，仅能用无性繁殖方法繁殖的植对于有性生殖退化，仅能用无性繁殖方法繁殖的植物，一旦罹病则毫无办法。母株一旦染病，病毒物，一旦罹病则毫无办法。母株一旦染病，病毒在其细胞内增殖，并在其细胞内增殖，并通过插条、接穗、种薯、球通过插条、接穗、种薯、球根、鳞片传至下一代。根、鳞片传至下一代。通过通过昆虫昆虫作为媒介加速传播。作为媒介加速传播。10无病毒植物的培养.植株脱病毒的意义植株脱病毒的意义植物组织培养脱病毒技术是植物细胞工程的重植物组织培养脱病毒技术是植物细胞工程的重要组成部分，脱毒种苗的生产在要组成部分，脱毒种苗的生产在提高作物质量提高作物质量和产量和产量方面已显示出极大潜力，方面已显示出极大潜力，良种、新品种良种、新品种的脱毒组培苗的大面积推广和应用的脱毒组培苗的大面积推广和应用，有效地解，有效地解决了因病毒引起的品种决了因病毒引起的品种退化退化问题。因此，植物问题。因此，植物组培脱毒技术在农业生产的科学化、现代化中组培脱毒技术在农业生产的科学化、现代化中具有巨大的应用价值和经济效益，还可减少农具有巨大的应用价值和经济效益，还可减少农药的施用，药的施用，改善生态环境条件，防止病害的蔓改善生态环境条件，防止病害的蔓延与扩散，延与扩散，该方法已成为农业中应用最广泛的该方法已成为农业中应用最广泛的生物技术。生物技术。11无病毒植物的培养甘薯脱毒甘薯脱毒苗苗12无病毒植物的培养脱毒区13无病毒植物的培养第二节二节 脱除植物病毒的原理及方法脱除植物病毒的原理及方法一、物理学方法：一、物理学方法：X射线射线 紫外线紫外线 超短波超短波 高温高温 都能使病素钝化，其中以热处理最常用。都能使病素钝化，其中以热处理最常用。14无病毒植物的培养1.热处理脱除植物病毒的原理热处理脱除植物病毒的原理病毒是病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后；随植大分子，病毒进入植物细胞后；随植物细胞的物细胞的DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能只能钝化病毒的活性钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。缓或增殖停止，而失去侵染的能力。热处理是一种物理效应，与冷处理一样，它可热处理是一种物理效应，与冷处理一样，它可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。殖的竞争中取胜。15无病毒植物的培养（1）温温汤汤浸浸渍渍处处理理法法：将将剪剪下下的的接接穗穗或或种种植植材材料料，在在50左左右右的的温温水水中中，浸浸渍渍3-15分钟至数小时。分钟至数小时。（2）热热风风处处理理法法：让让盆盆载载植植物物在在35-40高高温温下下生生长长发发育育，热热处处理理空空气气温温度度应应逐逐渐渐升升高高，然然后后达达到到所所需需温温度度，同同时时必必须须保保持持一一定定的的湿湿度度和和光光照照，以以后后可可切切取取处处理理后后新新长长出出的的枝枝条条作作接接穗穗和和砧砧木木，或或将将热处理与组织培养结合效果更好。热处理与组织培养结合效果更好。热处理脱毒热处理脱毒16无病毒植物的培养2、愈伤组织热处理脱毒法、愈伤组织热处理脱毒法方方法法：从从患患病病植植株株上上取取叶叶片片(茎茎片片、鳞鳞片片、花花器器亦亦可可)进进行行离离体体培培养养，诱诱导导形形成成愈愈伤伤组组织织，然然后后将将愈愈伤伤组织反复继代培养同时兼用热处理。组织反复继代培养同时兼用热处理。常用处理温度及处理时间：常用处理温度及处理时间：温度：温度：37-38 时间：处理时间：处理2周、周、4周或周或8周周 温度：温度：50 时间：时间：3-15min。反反复复继继代代兼兼热热处处理理，经经历历一一定定的的时时间间(继继代代次次数数需需试试验验)后后，将将热热处处理理过过的的愈愈伤伤组组织织转转移移到到分分化化培培养养基基中，诱导器官分化。中，诱导器官分化。17无病毒植物的培养果树作物：果树作物：桃桃(无黄萎病无黄萎病)、苹果、苹果(花叶病花叶病)、葡萄葡萄(扇叶病毒扇叶病毒)、甜橙、香蕉、李子、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、树莓、红莓苔子、草莓等。醋栗、梨、树莓、红莓苔子、草莓等。蔬菜作物：蔬菜作物：马铃薯、番茄、菠菜。马铃薯、番茄、菠菜。花卉植物：花卉植物：蔓生长春花、康乃馨、菊花等。蔓生长春花、康乃馨、菊花等。其他植物：其他植物：曼陀罗等。曼陀罗等。18无病毒植物的培养例：烟草愈伤组织兼热处理钝化烟草花叶病毒例：烟草愈伤组织兼热处理钝化烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒和黄瓜花叶病毒(CMV)获得无病毒株效果做法：获得无病毒株效果做法：A：从从患患病病烟烟草草植植株株上上取取5mm叶叶片片培培养养，在在MS附附加加IAA 2+KT 0.2的培养基上诱导愈伤组织。的培养基上诱导愈伤组织。B：将将其其中中一一部部分分愈愈伤伤组组织织反反复复继继代代培培养养，继继代代培培养中分别兼用养中分别兼用25、30和和37温度热处理温度热处理8周周。C：将将热热处处理理后后的的愈愈伤伤组组织织，转转到到MS附附加加IAA 2+KT 2的分化培养基中诱导芽分化。的分化培养基中诱导芽分化。D：将将1cm长长的的芽芽转转移移到到MS附附加加IAA 2+KT 0.02生生根培养基，诱导根分化。根培养基，诱导根分化。E：完完整整植植株株获获得得后后，移移植植到到无无毒毒土土壤壤栽栽培培并并进进行行鉴定。鉴定。结果表明：反复继代培养可获得无病毒株。结果表明：反复继代培养可获得无病毒株。19无病毒植物的培养3.低温处理脱出病毒菊花植株菊花植株-5,4-7.5个月处理后个月处理后进行茎尖培养进行茎尖培养,可以除去矮化病毒可以除去矮化病毒(CSV)和褪绿班驳病毒和褪绿班驳病毒(CCMV),而单而单独的茎尖培养无此效果。独的茎尖培养无此效果。20无病毒植物的培养二、化学方法二、化学方法使使用用农农药药是是防防治治植植物物真真细细菌菌病病害害的的主主要要方方法法，理论上讲，也应该是防治病毒的有效途径。理论上讲，也应该是防治病毒的有效途径。有有不不少少化化学学物物质质能能抑抑制制病病毒毒复复制制，例例如如孔孔雀雀绿绿、硫尿嘧啶、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、以及某些病毒抑制剂。氮鸟嘌呤、以及某些病毒抑制剂。如如Viraz01e(病病毒毒唑唑)和和一一些些蛋蛋白白质质、核核酸酸合合成成抑抑制制剂剂等等。由由于于病病毒毒的的复复制制和和寄寄主主的的代代谢谢过过程程关关系系非非常常密密切切，因因此此，要要找找出出既既干干扰扰病病毒毒复复制制，又又不不影影响响寄寄主主细细胞胞正正常常代代谢谢的的药药剂剂十十分分困难。困难。21无病毒植物的培养利利用用这这些些化化合合物物处处理理整整株株植植物物去去病病毒毒的的效效果果虽虽不不理理想想，但但培培养养离离体体的的组组织织、细细胞胞和原生质体等却可能有良好效果和原生质体等却可能有良好效果。如如在在培培养养基基中中加加入入2硫硫尿尿嘧嘧啶啶可可以以除除去去烟烟草草愈愈伤伤组组织织中中的的PVY病病毒毒，加加入入放放线线菌菌素素D可以抑制原生质体中的病毒复制等。可以抑制原生质体中的病毒复制等。22无病毒植物的培养钝化、抑制和清除植物病毒的一些化合物23无病毒植物的培养三、生物学方法三、生物学方法1.茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒（1）茎尖培养脱毒的理论基础）茎尖培养脱毒的理论基础a、病病毒毒在在植植物物体体内内的的转转移移是是通通过过维维营营束束系系统统完完成成的的，在在分分生生组组织织区区域域内内没没有有维维管管束束组组织织，病病毒毒只只能能通通过过胞胞间间连连丝丝传传递递赶赶不不上上细细胞胞的的不不断断分分裂裂和和活活跃跃的的生长速度；生长速度；b、在在分分裂裂旺旺盛盛的的分分生生组组织织内内，病病毒毒的的复复制制受受到到旺旺盛盛代谢活动的限制；代谢活动的限制；c、在在植植物物分分生生区区域域内内，“病病毒毒钝钝化化体体系系”的的活活性性较较其他部位的活性高；其他部位的活性高；d、茎尖分生组织内高浓度的植物内源激素可能会抑、茎尖分生组织内高浓度的植物内源激素可能会抑制病毒的增殖。制病毒的增殖。24无病毒植物的培养（2）茎尖培养脱毒苗的方法）茎尖培养脱毒苗的方法在在解解剖剖镜镜下下剥剥取取茎茎尖尖。考考虑虑到到脱脱毒毒效效果果及及提提高高成成活活率率，一一般般切切取取0.20.5mm的的茎茎尖尖为为组组织织材材料料进进行行培养，不同的植物茎尖对外源激素的反应不同。培养，不同的植物茎尖对外源激素的反应不同。茎茎尖尖大大小小:过过大大时时接接种种易易成成活活，但但脱脱毒毒效效果果差差，过过小小时时难难成成活活，但但脱脱毒毒效效果果好好。一一般般以以带带有有1-2片片叶叶原原基基为为好好，大大小小为为0.2-0.3mm为为宜宜，超超过过0.5mm时时，脱毒效果差。脱毒效果差。培培养养基基:只只要要能能使使茎茎尖尖快快速速生生长长，分分化化快快的的培培养养基基均均适适于于脱脱毒毒。一一般般以以MS较较好好，添添加加一一定定比比例例的的细细胞胞分裂素就行。分裂素就行。25无病毒植物的培养马铃薯马铃薯的芽的芽26无病毒植物的培养茎尖的结构茎尖的结构27无病毒植物的培养微茎尖微茎尖普通茎普通茎尖尖28无病毒植物的培养马铃薯脱马铃薯脱毒苗毒苗29无病毒植物的培养30无病毒植物的培养康乃馨不同茎尖培养与康乃馨斑驳病毒的脱除情况康乃馨不同茎尖培养与康乃馨斑驳病毒的脱除情况31无病毒植物的培养(3)茎尖培养法脱除植物病毒的技茎尖培养法脱除植物病毒的技术关关键同一种病毒在不同植物体内分布部位不同。同一种病毒在不同植物体内分布部位不同。例：烟草花叶病毒例：烟草花叶病毒(TMV)在如下植物中的荧光反应。在如下植物中的荧光反应。烟草：烟草：l-4片叶原基中未见片叶原基中未见TMY特异荧光特异荧光 撞羽矮牵牛：一两片叶原基未见撞羽矮牵牛：一两片叶原基未见TMV特异荧特异荧 光，而在三四片叶原茎中可见光，而在三四片叶原茎中可见TMV荧光。荧光。番茄：番茄：1片叶原茎中未见片叶原茎中未见TMV特异荧光。特异荧光。所所以以在在用用茎茎尖尖培培养养脱脱毒毒时时，必必须须认认真真确确定定病病毒毒在在植植物茎尖中的分布部位，然后确定培养茎尖的大小物茎尖中的分布部位，然后确定培养茎尖的大小.32无病毒植物的培养如：番茄：只能取生长锥或仅带一片叶原基的茎如：番茄：只能取生长锥或仅带一片叶原基的茎 尖进行培养；尖进行培养；撞羽矮牵牛：可取生长锥或带一两片叶原基撞羽矮牵牛：可取生长锥或带一两片叶原基 的茎尖进行培养；的茎尖进行培养；烟草：可取带烟草：可取带4片叶原基的茎尖进行培养。片叶原基的茎尖进行培养。利利用用茎茎尖尖堵堵养养法法脱脱除除植植物物病病毒毒时时，最最好好找找出出茎茎原原基基所所带带叶叶原原基基的的数数目目与与生生长长点点(茎茎尖尖)大大小小的的相相关关性性，这样在取材时就方便多了。这样在取材时就方便多了。33无病毒植物的培养 茎原基茎原基 0.050.08mm 茎原基带茎原基带2片叶原基片叶原基 0.10.2mm 茎原基带茎原基带4片叶原基片叶原基 0.30.4mm 茎原基带茎原基带6片叶原基片叶原基 0.60.8mm34无病毒植物的培养不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同。35无病毒植物的培养甘薯甘薯 斑纹花叶病毒、缩叶花叶病毒：斑纹花叶病毒、缩叶花叶病毒：分布于分布于1.0-2.0mm以内的茎尖中以内的茎尖中 羽毛状花叶病毒：羽毛状花叶病毒：分布于分布于0.3-1.0mm以内茎尖中以内茎尖中 马铃薯马铃薯 马铃薯卷叶病毒、马铃薯卷叶病毒、Y病毒：病毒：分布于分布于1.0-3.0mm以内的茎尖中；以内的茎尖中；X病毒：病毒：分布于分布于0.2-0.5mm以内的茎尖以内的茎尖 G病毒：病毒：分布于分布于0.2-0.3mm以内的茎尖以内的茎尖 S病毒：病毒：0.2mm以下以下 36无病毒植物的培养2.愈伤组织培养脱毒愈伤组织培养脱毒植植物物各各部部位位器器官官和和组组织织培培养养去去分分化化诱诱导导产产生生愈愈伤伤组组织织，然然后后从从愈愈伤伤组组织织再再分分化化产产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。说说明明病病毒毒颗颗粒粒会会在在愈愈伤伤组组织织的的培培养养过过程程中中逐渐消失。逐渐消失。37无病毒植物的培养愈伤组织脱病毒的机理愈伤组织脱病毒的机理可能的原因有：可能的原因有：病毒在植物体内不同器官或同一器官的不同组织病毒在植物体内不同器官或同一器官的不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞增殖产生的愈中分布不均匀，由那些无病毒细胞增殖产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。伤组织就是获得无病毒苗的基础。有些愈伤组织细胞中病毒浓度较低，在愈伤组织有些愈伤组织细胞中病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂过程中，病毒的复制能力衰退或丢细胞快速分裂过程中，病毒的复制能力衰退或丢失。失。继代培养的愈伤组织容易产生抗性变异细胞，因继代培养的愈伤组织容易产生抗性变异细胞，因而可能出现不带病毒的愈伤组织。但经愈伤组织而可能出现不带病毒的愈伤组织。但经愈伤组织产生无病毒苗的脱毒途径容易产生变异，可能导产生无病毒苗的脱毒途径容易产生变异，可能导致植株丧失其原有的优良性状，当然也有可能产致植株丧失其原有的优良性状，当然也有可能产生有益的变异，但频率极低。生有益的变异，但频率极低。38无病毒植物的培养3.茎尖微体嫁接脱毒茎尖微体嫁接脱毒先先将将砧砧木木种种子子进进行行表表面面消消毒毒，以以后后再再接接到到1%琼琼脂脂以以MS无无机机盐培养基培养发芽，用苗龄约盐培养基培养发芽，用苗龄约2周的幼嫩实生苗作砧木。周的幼嫩实生苗作砧木。把把实实生生苗苗从从试试管管中中取取出出，在在无无菌菌条条件件下下切切去去顶顶部部，留留下下1-1.5cm的的上上胚胚轴轴部部分分，将将子子叶叶和和液液芽芽除除去去，把把根根切切短短至至46cm长。长。从从田田间间或或温温室室旺旺盛盛生生长长的的成成年年树树剪剪取取一一小小段段新新梢梢，经经消消毒毒后后在在超超净净台台上上用用显显微微操操作作法法取取出出仅仅带带1-3个个叶叶原原基基的的茎茎尖尖约约1mm大小作穗用。采用倒大小作穗用。采用倒T字形的水平切口。字形的水平切口。嫁嫁接接苗苗用用液液体体滤滤低低桥桥培培养养基基培培养养。成成活活率率30%50%，嫁嫁接接成功的植株移植到土壤之前至少要有两片展开的真叶。成功的植株移植到土壤之前至少要有两片展开的真叶。39无病毒植物的培养苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率40无病毒植物的培养苹果不同取材时期对微体嫁接成功率苹果不同取材时期对微体嫁接成功率的影响的影响41无病毒植物的培养苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率42无病毒植物的培养试管微体嫁接在果树方面发展最快(1)嫁嫁接接植植物物不不受受与与珠珠心心及及有有性性实实生生苗苗相相关关的幼年阶段的影响。的幼年阶段的影响。(2)许许多多栽栽培培品品种种通通过过嫁嫁接接繁繁殖殖了了许许多多世世代代，因因此此果果树树研研究究者者和和种种植植者者关关于于这这些些品品种种的的自自根根苗苗的的根根冠冠大大小小、病病虫虫害害情情况况以以及及耐寒性等了解得很少。耐寒性等了解得很少。43无病毒植物的培养(3)茎茎尖尖组组织织培培养养繁繁殖殖结结合合热热处处理理可可产产生生无无病病毒毒植植物物，因因此此，许许多多研研究究者者认认为为对对通通常常采采用用嫁嫁接接繁繁殖殖的的果果树树进进行行试试管管嫁嫁接接是是很适宜的。很适宜的。(4)试试管管微微体体嫁嫁接接除除了了可可培培育育无无病病毒毒植植株株外外，还还可可解解决决难难以以生生根根的的园园艺艺植植物物的的生生根根问问题和进行嫁接亲和力的研究。题和进行嫁接亲和力的研究。44无病毒植物的培养4.珠心胚培养脱毒珠心胚培养脱毒柑柑桔桔类类80%以以上上的的种种类类具具有有多多胚胚性性,而而单单胚胚占占的的比比例很小。例很小。柑橘类植物中有不少多胚品种，一颗种子内除一柑橘类植物中有不少多胚品种，一颗种子内除一个合子胚外，还有数个至数十个由珠心细胞形成个合子胚外，还有数个至数十个由珠心细胞形成的无性胚，称做的无性胚，称做珠心胚。珠心胚。因因为为病病毒毒通通常常是是经经维维管管束束的的韧韧皮皮组组织织传传播播的的，而而珠珠心心与与维维管管束束系系统统无无直直接接联联系系。由由珠珠心心组组织织诱诱导导产产生的植株就可免除病素毒的危害。生的植株就可免除病素毒的危害。45无病毒植物的培养它与合子胚不同，不是受精的产物，而是由体它与合子胚不同，不是受精的产物，而是由体细胞产生的，因此具有和母体相同的遗传组成；细胞产生的，因此具有和母体相同的遗传组成；与合子胚一样，在珠心胚和植株之间无维管组与合子胚一样，在珠心胚和植株之间无维管组织连系，因此即使母体植株感染了病毒，珠心织连系，因此即使母体植株感染了病毒，珠心胚也是无毒的；胚也是无毒的；在自然条件下，珠心胚一般都不能发育成熟，在自然条件下，珠心胚一般都不能发育成熟，只有适时从种子中剥离出来，接种在人工培养只有适时从种子中剥离出来，接种在人工培养基上，珠心胚才能长成植株，而这些植株应当基上，珠心胚才能长成植株，而这些植株应当是不带病毒的母体无性系。是不带病毒的母体无性系。珠心胚具有珠心胚具有3个特征个特征46无病毒植物的培养5.花花药培养脱毒培养脱毒花花药药培培养养的的最最初初目目的的，是是培培育育起起源源于于花花药药内内部部花花粉粉粒粒的的单单倍倍体体植植株株，并并使使单单倍倍体体加加倍倍，作作为为育育种种材材料的来源。料的来源。但但经经大大量量实实验验表表明明花花药药培培养养所所得得的的植植株株有有95%以以上上是是能能开开花花结结果果的的多多倍倍体体，而而且且生生长长发发育育都都优优于于母母株。株。已已证证明明，经经愈愈伤伤组组织织培培养养出出来来的的花花药药植植株株是是不不带带病病毒毒的的，借借此此方方法法，不不仅仅可可快快速速培培育育出出大大量量的的无无毒毒植植株株，并并可可省省去去病病毒毒鉴鉴定定工工作作，对对基基层层生生产产应应用用实为一举两得的事情。实为一举两得的事情。47无病毒植物的培养三、分离茎尖的培养情况三、分离茎尖的培养情况第第一一种种：是是生生长长停停止止，接接种种的的组组织织并并有有扩扩大大，颜颜色色逐逐渐渐变变褐褐而而枯枯死死，这这种种情情况况大大多多是是生生长长点点在在分离接种过程中受伤分离接种过程中受伤而造成的；而造成的；第二种：第二种：是生长太慢是生长太慢，茎尖接种后颜色逐渐变绿，茎尖接种后颜色逐渐变绿，但不见增大，最后成绿色小点。这是由于但不见增大，最后成绿色小点。这是由于生长生长素浓度偏低，或培养温度过低素浓度偏低，或培养温度过低所造成的，如果所造成的，如果立即转入较高浓度生长素的培养基中，或提高立即转入较高浓度生长素的培养基中，或提高培养温度，即能促进茎尖生长；培养温度，即能促进茎尖生长；48无病毒植物的培养第第三三种种：是是生生长长过过旺旺，接接种种后后茎茎尖尖明明显显增增大大，约约培培养养一一同同后后即即在在茎茎尖尖基基部部产产生生愈愈伤伤组组织织，但但不不易易见见到到茎茎尖尖的的伸伸长长，组组织织颜颜色色也也较较浇浇。这这是是由由于于培培养养茎茎生生长长素素浓浓度度偏偏高高，或或光光照照弱弱，温温度度高高而而造造成成的的。为为此此应应将将培培养养材材料料转转入入生生长长素素浓浓度度较较低低的的培培养养基基中中，或或降降低低温温度度，提提高高光光照照强强度度来来解解决决。否否则则时时间长了愈伤组织会表换生长分化能力；间长了愈伤组织会表换生长分化能力；第第四四种种：是是生生长长正正常常、在在营营养养、激激素素、温温度度、光光照照等等各各方方面面条条件件正正常常的的情情况况下下，接接种种的的茎茎尖尖颜颜色色逐逐渐渐变变绿绿，基基部部逐逐渐渐增增大大，有有时时形形成成少少量量的的愈愈伤伤组组织织，茎茎尖尖也也逐逐渐渐伸伸长长，培培养养一一个个月月左左右右转转入入无无基基素素的的基基本本培培养养基基，茎茎尖尖继继续续伸伸长长，并并产产生生根根系系，最后发育成完整植株。最后发育成完整植株。49无病毒植物的培养第三节第三节 无病毒植株脱毒程序无病毒植株脱毒程序一、材料准备一、材料准备1决定植物种类及品种。选用生长健壮，遗传性决定植物种类及品种。选用生长健壮，遗传性一致的品种为材料，并探明该品种除所脱除一致的品种为材料，并探明该品种除所脱除 的病毒在寄主中的位置。的病毒在寄主中的位置。2了解该植物体内所具有的病毒种类及危害的程了解该植物体内所具有的病毒种类及危害的程 度。根据植物所带病毒种类，选择指示植物度。根据植物所带病毒种类，选择指示植物(敏敏感植物感植物)。3决定脱除病毒的方法：决定脱除病毒的方法：“茎尖培养茎尖培养”还是还是“热热处理处理”还是还是“微体嫁接微体嫁接”。50无病毒植物的培养二、生长点分离和培养二、生长点分离和培养(茎尖培养为例茎尖培养为例)1从罹病的植株上切取顶芽或腋芽。从罹病的植株上切取顶芽或腋芽。2材料表面灭菌、决定灭菌药剂、浓度、时间。材料表面灭菌、决定灭菌药剂、浓度、时间。3根据病毒在寄主内分布位置决定切取茎尖大小。根据病毒在寄主内分布位置决定切取茎尖大小。如果热处理，那么决定热处理的温度、时间。如果热处理，那么决定热处理的温度、时间。4接种成功率与茎形状结构有关。接种成功率与茎形状结构有关。例例 马铃薯、百合生长点呈半圆形较大、好分离。马铃薯、百合生长点呈半圆形较大、好分离。番薯、矮牵牛、香石竹呈半圆形，也比较好分离。番薯、矮牵牛、香石竹呈半圆形，也比较好分离。大丽花、菊花生长点扁平、并被对生叶原基夹住难分离。大丽花、菊花生长点扁平、并被对生叶原基夹住难分离。草莓，叶原基上生有密集茸毛，生长点埋在肉质凹形槽草莓，叶原基上生有密集茸毛，生长点埋在肉质凹形槽 内，不仅难分离且容易污染。内，不仅难分离且容易污染。51无病毒植物的培养三、无病毒植物的鉴定三、无病毒植物的鉴定通过茎尖分生组织培养、热处理脱毒法、微体嫁通过茎尖分生组织培养、热处理脱毒法、微体嫁接法而培养成的植株，不一定都是无病毒植株。接法而培养成的植株，不一定都是无病毒植株。当前用于病毒检测的方法有如下当前用于病毒检测的方法有如下3种：种：血清鉴定法；血清鉴定法；生物鉴定法生物鉴定法(敏感植物或指示植物敏感植物或指示植物)；电子显微镜鉴定法。电子显微镜鉴定法。采用单一鉴定法并不十分可靠。特别是对一些特采用单一鉴定法并不十分可靠。特别是对一些特异性病毒，单一鉴定方法可靠性更差。最好三异性病毒，单一鉴定方法可靠性更差。最好三种方法同时鉴定，可以获得理想的结果。种方法同时鉴定，可以获得理想的结果。52无病毒植物的培养(一一)指示植物鉴定法指示植物鉴定法1、原理、原理 指指示示植植物物法法是是利利用用病病毒毒在在其其它它植植物物上上产产生生的的枯枯斑斑作作为为病病毒毒种种类类鉴鉴别别的的标标准准，也也即即枯枯斑斑和和空空斑斑测测定定法。法。53无病毒植物的培养2、指示植物两种类型、指示植物两种类型一一种种是是接接种种后后产产生生系系统统性性症症状状，出出现现在在病病毒毒扩扩展展到到的的植植物物非非接接合合部部位位，通通常常没没有有局局部部明显病斑；明显病斑；另另一一种种是是只只产产生生局局部部病病斑斑，常常由由坏坏死死、褪褪绿绿或环斑构成。或环斑构成。常常用用的的指指示示植植物物：千千日日红红、曼曼陀陀罗罗、豇豇豆豆、心叶烟、辣椒、莨菪等心叶烟、辣椒、莨菪等。54无病毒植物的培养每种病毒都有自己的敏感植物如：每种病毒都有自己的敏感植物如：马铃薯病毒的敏感植物：马铃薯病毒的敏感植物：千日红、黄花烟、心叶千日红、黄花烟、心叶烟、烟、毛叶曼陀罗；毛叶曼陀罗；大蒜病毒的敏感植物：大蒜病毒的敏感植物：藜、千日红；藜、千日红；草莓病毒的敏感植物：草莓病毒的敏感植物：威州草莓威州草莓(从八倍体野生种从八倍体野生种选出选出)、野草莓、野红草莓野草莓、野红草莓等。等。桃红叶病毒的敏感植物：桃红叶病毒的敏感植物：旱金莲旱金莲。大丽花病毒的敏感植物：大丽花病毒的敏感植物：昆落阿藜、苋色藜、心昆落阿藜、苋色藜、心叶烟、克里芙兰烟、矮牵牛、黄瓜。叶烟、克里芙兰烟、矮牵牛、黄瓜。香石竹病毒的敏感植物：香石竹病毒的敏感植物：昆落阿藜、苋色藜昆落阿藜、苋色藜。菊花病毒的敏感植物：矮牵牛、豇豆。菊花病毒的敏感植物：矮牵牛、豇豆。55无病毒植物的培养3、敏感植物鉴定病毒的方法：敏感植物鉴定病毒的方法：A、摩擦接种法：、摩擦接种法：取培养植株的叶片榨汁，将其汁用摩擦法接取培养植株的叶片榨汁，将其汁用摩擦法接种到各自的敏感植物上，然后视其病斑有种到各自的敏感植物上，然后视其病斑有无，来判断是否脱除了病毒。无，来判断是否脱除了病毒。接种后如若敏感植物叶片表现病斑，可根据接种后如若敏感植物叶片表现病斑，可根据病斑类型判断，还有哪种病毒没有脱除。病斑类型判断，还有哪种病毒没有脱除。56无病毒植物的培养例：马铃薯体内各种病毒在其敏感植物上表现的例：马铃薯体内各种病毒在其敏感植物上表现的症状症状：X病毒侵染千日红病毒侵染千日红(叶片呈枯斑叶片呈枯斑)；M、S病毒侵染千日红病毒侵染千日红(叶片呈突起枯斑叶片呈突起枯斑)；X病毒侵染黄花烟病毒侵染黄花烟(叶片呈花叶叶片呈花叶)；Y病毒侵染黄花烟病毒侵染黄花烟(叶片花叶或条斑或呈明显脉绿带叶片花叶或条斑或呈明显脉绿带)；X病毒侵染心叶烟病毒侵染心叶烟(叶片呈花叶叶片呈花叶)；Y病毒侵染心叶烟病毒侵染心叶烟(叶片呈条斑叶片呈条斑)；PG带毒体侵染心叶带毒体侵染心叶烟烟(叶片呈花叶叶片呈花叶)；M、Y病毒侵染毛叶曼陀罗病毒侵染毛叶曼陀罗(叶片呈枯斑叶片呈枯斑)。植物汁液摩擦接种后，如使千日红叶片呈枯斑，使黄花植物汁液摩擦接种后，如使千日红叶片呈枯斑，使黄花烟、心叶烟叶片呈花叶证明，该植物体内具有马铃薯烟、心叶烟叶片呈花叶证明，该植物体内具有马铃薯X病毒。病毒。57无病毒植物的培养B嫁接法：嫁接法：有些病毒有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播门的介体传播。如草莓黄化病毒、草莓。如草莓黄化病毒、草莓丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播。进行传播。这种病毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接这种病毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植物的病症表在敏感植物上，根据敏感植物的病症表现来判断是否脱除了病毒。现来判断是否脱除了病毒。58无病毒植物的培养木本多年生植物及草莓等无性繁殖的草本木本多年生植物及草莓等无性繁殖的草本植物通常采用嫁接接种的方法植物通常采用嫁接接种的方法以以指指示示植植物物作作砧砧木木，被被鉴鉴定定植植物物作作接接穗穗，可可采采用用劈劈接接、靠靠接接、芽芽接接等等方方法法嫁嫁接接，其其中中以以劈劈接接法法为多。为多。如如草草莓莓以以对对病病毒毒敏敏感感的的欧欧洲洲草草莓莓（野野草草莓莓）和和深深红红莓莓作作指指示示植植物物，从从经经脱脱毒毒得得到到的的植植株株上上仅仅取取成成龄龄叶叶片片顶顶端端一一小小叶叶作作接接穗穗，叶叶柄柄用用刀刀片片削削成成楔楔形形，削削面面长长810 mm，然然后后迅迅速速将将接接穗穗小小叶叶的的叶叶柄柄插插入入切切口口，用用塑塑料料绑绑缚缚接接合合部部，嫁嫁接接后后4周周，若若带带有有病病毒毒，则则在在新新展展开开的的叶叶片片、匍匍匐匐茎或老叶上会出现病征茎或老叶上会出现病征59无病毒植物的培养（二）抗血清鉴定法二）抗血清鉴定法1、基本原理：基本原理：当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时，在动物体内会产生一种特异性丙种球时，在动物体内会产生一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白，即所谓蛋白称为免疫球蛋白，即所谓“抗体抗体”。引起形成抗体的物质引起形成抗体的物质(病毒或异体蛋白病毒或异体蛋白)称称为为“抗原抗原”。60无病毒植物的培养抗原和抗体结合，表现为很强的特抗原和抗体结合，表现为很强的特异性。即由一种病毒产生的抗体，异性。即由一种病毒产生的抗体，只能结合该种病毒。抗体在特殊细只能结合该种病毒。抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。体液内。这种含有特异性这种含有特异性“抗体抗体”的血清称的血清称为为“抗血清抗血清”。抗原和抗体相结合抗原和抗体相结合的反应称为的反应称为“血清反应血清反应”。61无病毒植物的培养2.病毒抗血清在诊断上的价值病毒抗血清在诊断上的价值。A.病毒抗血清具有高度的专化性。即由一种病毒病毒抗血清具有高度的专化性。即由一种病毒产生的产生的“抗体抗体”，只能结合该种病毒，只能结合该种病毒(抗原抗原)。如由注射如由注射(感染感染)TMV而产生的抗体而产生的抗体(免疫球蛋白免疫球蛋白)，只能检测，只能检测TMV病毒病毒(才可能发生血清反应才可能发生血清反应)。B由于由于“抗血清抗血清”法具有高度专化性，因此对法具有高度专化性，因此对于那些受感染而没有症状的带毒植物，也能诊于那些受感染而没有症状的带毒植物，也能诊断，故在实用上具有很高的价值。断，故在实用上具有很高的价值。C由于病毒与由于病毒与“抗血清抗血清”的的“反应量反应量”与病毒与病毒浓度成正比。只要知道其中一种浓度，可根据浓度成正比。只要知道其中一种浓度，可根据反应量来测定另一种的浓度。故此可以用来作反应量来测定另一种的浓度。故此可以用来作病毒的定量分析。病毒的定量分析。62无病毒植物的培养3.病毒抗血清在诊断上的局限性：病毒抗血清在诊断上的局限性：A.不是所有病毒都能制成抗血清，一般不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黄化型黄化型”病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如马铃薯卷叶病毒极难或不能获得马铃薯卷叶病毒极难或不能获得“抗血清抗血清”。B病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了失又太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必备的抗原结构。必备的抗原结构。C植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质。使病毒丧失了抗原性质。63无病毒植物的培养4.方法方法 抗血清鉴定首先要进行抗原的制备，包括病毒抗血清鉴定首先要进行抗原的制备，包括病毒的繁殖、病叶研磨、汁液的澄清、病毒悬浮液的繁殖、病叶研磨、汁液的澄清、病毒悬浮液的提纯、病毒的沉淀等过程。只有获得高纯度的提纯、病毒的沉淀等过程。只有获得高纯度的抗原，才有可能获得高度纯净的抗血清。的抗原，才有可能获得高度纯净的抗血清。一一般般采采用用家家兔兔制制备备抗抗植植物物病病毒毒的的抗抗血血清清，以以924个个月月大大小小的的家家兔兔为为好好，注注射射病病毒毒悬悬浮浮液液，在在家家兔兔饥饥饿饿12 h后后采采血血，再再进进行行抗抗血血清清的的分分离离和和吸吸收收等等过过程程。血血清清可可分分装装在在小小玻玻璃璃瓶瓶中中，贮贮存存在在1520 的的冰冰冻冻条条件件下下，也也可可以以分分装装在在安安瓶中，冷冻干燥，然后密封，有效保存。瓶中，冷冻干燥，然后密封，有效保存。64无病毒植物的培养具体测定可采用沉淀反应、凝集反应、具体测定可采用沉淀反应、凝集反应、免疫扩散、免疫电泳、荧光抗体技术和免疫扩散、免疫电泳、荧光抗体技术和酶联免疫吸附试验等多种方法。酶联免疫吸附试验等多种方法。65无病毒植物的培养酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(enzyme1inkedimmunOsOrbentassay，EL工SA)酶联免疫吸附法是把抗原酶联免疫吸附法是把抗原抗体的免疫抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术，来的一种综合性技术，它的灵敏度高，它的灵敏度高，特异性强，特异性强，特别是当寄主体内病毒浓度特别是当寄主体内病毒浓度很低或同时存在病毒钝化物或抑制剂时，很低或同时存在病毒钝化物或抑制剂时，它的优势尤为明显，因而是近年来病毒它的优势尤为明显，因而是近年来病毒检测方法中发展最快、应用最广的一种检测方法中发展最快、应用最广的一种方法。方法。66无病毒植物的培养酶联免疫吸附法的原理酶联免疫吸附法的原理利用以酶标记的特异抗体来指示抗原利用以酶标记的特异抗体来指示抗原抗体的抗体的结合，从而检出样品中的抗原。结合，从而检出样品中的抗原。具体操作程序是：具体操作程序是：将待检植物汁液将待检植物汁液(抗原抗原)注入酶联板注入酶联板(聚苯乙烯多孔微量反应板聚苯乙烯多孔微量反应板)中，使抗原吸附于它的孔中，使抗原吸附于它的孔壁，然后加入以酶标记的特异抗体，待抗原与抗体充壁，然后加入以酶标记的特异抗体，待抗原与抗体充分反应后，洗去未与抗原结合的多余酶标记抗体，于分反应后，洗去未与抗原结合的多余酶标记抗体，于是在固相载体酶联板表面就只留下以酶标记的抗原是在固相载体酶联板表面就只留下以酶标记的抗原抗体复合物。这时加入酶的无色底物，复合物上的酶抗体复合物。这时加入酶的无色底物，复合物上的酶催化底物降解，生成有色产物。这一结果可用肉眼识催化底物降解，生成有色产物。这一结果可用肉眼识别，也可用分光光度计对底物的降解量进行测定。别，也可用分光光度计对底物的降解量进行测定。67无病毒植物的培养血清鉴定血清鉴定法法68无病毒植物的培养血清鉴定的基本方法血清鉴定的基本方法A.玻璃片凝集法玻璃片凝集法在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加5滴滴稀稀“抗血清抗血清”，另一端滴加等量对照血，另一端滴加等量对照血清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置20-50min，然后在，然后在40-60倍显微镜下观察。倍显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。69无病毒植物的培养玻璃片玻璃片凝集法凝集法70无病毒植物的培养B微量凝集试验微量凝集试验(MAT)在培养皿底部，铺上一层火棉胶或聚乙在培养皿底部，铺上一层火棉胶或聚乙烯醇缩甲醛薄膜，然后将抗血清滴入薄烯醇缩甲醛薄膜，然后将抗血清滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆盖一层石蜡膜上，再在血清液滴上方覆盖一层石蜡油。在油。在2025下保温，下保温，20-50min后观后观察。察。此法优点：此法优点：鉴定时可以完全避免蒸发，鉴定时可以完全避免蒸发，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培养皿可以鉴定几十个样品。对次，每培养皿可以鉴定几十个样品。对某些病毒某些病毒(马铃薯马铃薯M病毒病毒)引起的细微病引起的细微病毒凝聚现象均可识别。毒凝聚现象均可识别。71无病毒植物的培养（三）电子显微镜检查法（三）电子显微镜检查法采用电子显微镜，可以通过直接观察，检查出有无采用电子显微镜，可以通过直接观察，检查出有无病毒存在，并可以得知有关病毒颗粒的大小、形病毒存在，并可以得知有关病毒颗粒的大小、形状和结构状和结构,又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。先进的方法，但需一定的设备和技术。病毒病毒 形态形态 长长(nm)宽（宽（nm）X 线线 状状 515 13 Y 线线 状状 730 11 A 线线 状状 730 11 S 线线 状状 650 1213 M 线线 状状 650 121372无病毒植物的培养(四四)分子生物学方法分子生物学方法在植物病毒鉴定中采用的分子生物学方法主要是在植物病毒鉴定中采用的分子生物学方法主要是检测病毒的核酸。检测病毒的核酸。一般都具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等一般都具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等特点。特点。核酸杂交技术的原理核酸杂交技术的原理:采用带有放射性或非放射采用带有放射性或非放射性物质标记的已知序列核酸单链作为探针，在性物质标记的已知序列核酸单链作为探针，在一定条件下与靶病毒的核酸单链退火形成杂交一定条件下与靶病毒的核酸单链退火形成杂交双链。通过杂交信号的检测，鉴定样本中有无双链。通过杂交信号的检测，鉴定样本中有无相应病毒的基因。相应病毒的基因。74无病毒植物的培养19世纪末以来，许多国家开始用聚合酶链式反世纪末以来，许多国家开始用聚合酶链式反应应(PCR)技术检测果树病毒，并取得很好的效技术检测果树病毒，并取得很好的效果。果。常用的有聚合酶链式反应常用的有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，技术，即利用已知病毒的核苷即利用已知病毒的核苷酸序列或同组病毒的相似序列区域来设计引物，酸序列或同组病毒的相似序列区域来设计引物，将待测样品用将待测样品用PCR技术体外扩增技术体外扩增DNA，扩增后，扩增后的产物可进行限制性片段长度多态性的产物可进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA RAPD)、扩增片、扩增片段长度多态性段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、变性梯度凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳(denaturing grade gel electrophoresis，DGGE)、单链构象多态性、单链构象多态性(single-strandconformation polymorphism，SSCP)、探针交叉杂交等技术分析检测病毒是否存在。探针交叉杂交等技术分析检测病毒是否存在。75无病毒植物的培养由于多数植物病毒核酸是由于多数植物病毒核酸是RNA，在进行，在进行PCR检测检测前，需以前，需以RNA为模板，经逆转录生成为模板，经逆转录生成cDNA后，后，再利用病毒核酸特有的序列设计的引物进行再利用病毒核酸特有的序列设计的引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒存在。反应，即可知道在寄主中是否有病毒存在。RNA病毒和类病毒等在寄主体内可形成双链病毒和类病毒等在寄主体内可形成双链RNA(dsRNA)，而一般情况下植物体内不存在，而一般情况下植物体内不存在dsRNA，因此，因此dsRNA分析也可用于植物病毒鉴分析也可用于植物病毒鉴定。定。76无病毒植物的培养利用利用DNA杂交和荧光标记技术相结合杂交和荧光标记技术相结合的基因芯片技术也是植物病毒快速的基因芯片技术也是植物病毒快速检测的重要发展方向。检测的重要发展方向。在实际应用中，为了提高检测的可靠在实际应用中，为了提高检测的可靠性，往往用几种方法同时鉴定。最性，往往用几种方法同时鉴定。最后选择出的无毒苗即可进行扩增繁后选择出的无毒苗即可进行扩增繁殖，用于生产。但在无毒种苗的扩殖，用于生产。但在无毒种苗的扩增繁殖和应用过程中应注意防止再增繁殖和应用过程中应注意防止再度感染。度感染。77无病毒植物的培养78无病毒植物的培养植物脱毒苗生产应用尚不普遍，原因如下：植物脱毒苗生产应用尚不普遍，原因如下：基础研究跟不上，诸如病毒特性与寄主的基础研究跟不上，诸如病毒特性与寄主的关系，各植物种体内都有什么病毒等。关系，各植物种体内都有什么病毒等。脱毒培养后如何快速检测。脱毒培养后如何快速检测。得到脱毒原种苗后，如何保存得到脱毒原种苗后，如何保存?如何防止再如何防止再度侵染等。度侵染等。79无病毒植物的培养四、无毒原种苗的繁殖四、无毒原种苗的繁殖经茎尖培养法，热处理法、微体嫁接法获得经茎尖培养法，热处理法、微体嫁接法获得的无病毒株数量是很有限的，需扩大繁殖才的无病毒株数量是很有限的，需扩大繁殖才能满足生产需要。能满足生产需要。一方面充分发挥组织培养作用，在室内加速一方面充分发挥组织培养作用，在室内加速繁殖；另一方面加速田间繁殖。繁殖；另一方面加速田间繁殖。与此同时对脱毒株系进行植物学性状鉴定，与此同时对脱毒株系进行植物学性状鉴定，遗传稳定性鉴定，并根据病毒鉴定结果，淘遗传稳定性鉴定，并根据病毒鉴定结果，淘汰有毒株系，保留性状优良无毒株系。汰有毒株系，保留性状优良无毒株系。80无病毒植物的培养五、无毒原种的保存无毒植株并不具有额外的抗病性，它们有可能无毒植株并不具有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。为了解决这个问题，应将很快又被重新感染。为了解决这个问题，应将无毒原种种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中。无毒原种种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中。在大规模繁殖这些植物的时候，应把它们在大规模繁殖这些植物的时候，应把它们种在种在田间的隔离区内田间的隔离区内，其中应很少有或完全没有重，其中应很少有或完全没有重新感染的机会。新感染的机会。另外一种更容易也是更便宜的方法，是把由另外一种更容易也是更便宜的方法，是把由茎茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖养进行繁殖 81无病毒植物的培养六、脱毒植株的应用六、脱毒植株的应用在研究特定病毒对寄主植物的影响时，无毒植在研究特定病毒对寄主植物的影响时，无毒植株是非常有用的实验材料。株是非常有用的实验材料。更重要的是，主要是通过茎尖培养所得到的无更重要的是，主要是通过茎尖培养所得到的无毒植株的发育情况表明，很多病毒能在寄主植毒植株的发育情况表明，很多病毒能在寄主植物中造成生活力、品质和产量的严重损失。物中造成生活力、品质和产量的严重损失。通过把已知病毒引入无毒植株，并比较同一个通过把已知病毒引入无毒植株，并比较同一个无性系的感病株和无毒株的表现，可以对病毒无性系的感病株和无毒株的表现，可以对病毒造成的产量损失做出更精确的估计。造成的产量损失做出更精确的估计。82无病毒植物的培养通过茎尖培养的方法，通过茎尖培养的方法，Stone(1973)由由个品种个品种的水仙中获得了一个无阿拉伯花叶病毒和水仙的水仙中获得了一个无阿拉伯花叶病毒和水仙退化病毒的无性系。退化病毒的无性系。这种无毒鳞茎比普通原种长得快，生活力强，这种无毒鳞茎比普通原种长得快，生活力强，比受侵染的植株花大，颜色丰富，每个茎的花比受侵染的植株花大，颜色丰富，每个茎的花多。大黄脱毒后叶柄产量增加了多。大黄脱毒后叶柄产量增加了6090。天竺葵的很多品种带有不表现症状的病毒。据天竺葵的很多品种带有不表现症状的病毒。据报道，由其茎尖培养产生的植株比未受过处理报道，由其茎尖培养产生的植株比未受过处理的植株生活力强，产生插条的数目多的植株生活力强，产生插条的数目多20一一30，而且这些插条很容易生根。，而且这些插条很容易生根。83无病毒植物的培养七、病毒以外病原菌的离体消除七、病毒以外病原菌的离体消除方法方法茎尖培养和愈伤组织培养主要用于消除茎尖培养和愈伤组织培养主要用于消除病毒，但有些证据表明，也可通过培养病毒，但有些证据表明，也可通过培养消除其他病原菌如类菌质体、细菌和真消除其他病原菌如类菌质体、细菌和真菌。菌。jacoli(1978)指出，胡萝卜外植体经过反指出，胡萝卜外植体经过反复转管后，其中感染的星黄菌复转管后，其中感染的星黄菌(类菌质体类菌质体状小体状小体)逐渐退化并在逐渐退化并在80d内消失。内消失。84无病毒植物的培养培养的植物组织内带有的细菌和真菌，培养的植物组织内带有的细菌和真菌，由于在培养基上增殖很快，在一般情况由于在培养基上增殖很快，在一般情况下很容易表现出来。下很容易表现出来。通过茎尖培养已经在花叶通过茎尖培养已经在花叶万年青和天竺万年青和天竺葵葵中消除了这类周身侵染的中消除了这类周身侵染的细菌细菌。在在康乃馨康乃馨中已经消除了由中已经消除了由蔷薇镰孢霉蔷薇镰孢霉引引起的茎腐病。起的茎腐病。85无病毒植物的培养无毒种苗在实际应用中的问题是再度感无毒种苗在实际应用中的问题是再度感染，如何防止再度感染，必须建立一种染，如何防止再度感染，必须建立一种体系。体系。在这种体系中应做到：在这种体系中应做到：研究、繁殖、生研究、繁殖、生产严格分工。产严格分工。原原种和原种的繁殖，必原原种和原种的繁殖，必须在隔离的网室中进行；良种的繁殖，须在隔离的网室中进行；良种的繁殖，可采用集团隔离即在无毒源和其他病虫可采用集团隔离即在无毒源和其他病虫害的大田中进行。良种提供农家生产，害的大田中进行。良种提供农家生产，经经23年后再度感染，可全部更新。年后再度感染，可全部更新。86无病毒植物的培养(1)热处理为什么可以去除部分植物病热处理为什么可以去除部分植物病毒毒?热处理方法分为几种，常用的是热处理方法分为几种，常用的是哪一种哪一种?(2)如何鉴定茎尖培养而成的脱毒苗确如何鉴定茎尖培养而成的脱毒苗确实是无毒的实是无毒的?(3)为什么用微茎尖组织培养形成的试为什么用微茎尖组织培养形成的试管苗一般是无毒的管苗一般是无毒的?思考题思考题87无病毒植物的培养