生化析之免疫析培训ppt课件

生化析之免疫析生化析之免疫析1 1定义n nLaboratory methods to determine the composition of biological samples.n n生命活性物质的分析和利用生物化学技术所进行的分析.生化析之免疫析2定义Laboratory methods to determ主讲内容n n免疫分析(3)n n氨基酸分析(1)n n蛋白质分析(2)n n酶法分析(2)n n糖的分析(1)n n核酸分析(3)n n生物大分子分离纯化技术(2)生化析之免疫析3主讲内容免疫分析(3)生化析之免疫析3参考书目:n n生化分析生化分析,李元宗李元宗,常文保常文保,高等教育出社高等教育出社,2003.,2003.n nAnalytical Biochemistry,D.J.Holme,H.Analytical Biochemistry,D.J.Holme,H.peck,peck,世界图书出版公司世界图书出版公司,1999.,1999.生化析之免疫析4参考书目:生化分析,李元宗,常文保,高等教育出社,200免疫分析n n利用抗原抗体之间特异性反应实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法n n历史:JennerBehring,北里(1890)Yallow,Berson(1959)生化析之免疫析5免疫分析利用抗原抗体之间特异性反应实现对抗体、抗原或相关物质一、基本概念、抗原（Antigen,Ag)能引起动物机体特异性免疫应答，并能和抗体发生特异性结合反应的物质。n n免疫原性免疫原性(Immunogenicity):(Immunogenicity):引起免疫应答的性质。引起免疫应答的性质。n n抗原性抗原性(Antigenicity):(Antigenicity):与抗体反应的性质。与抗体反应的性质。n n半抗原半抗原(Hapten)(Hapten)：不能引起免疫应答，却能和抗体反不能引起免疫应答，却能和抗体反应的一类小分子。应的一类小分子。n n抗原决定簇抗原决定簇(Antigen Determinant):(Antigen Determinant):决定或控制抗原决定或控制抗原特异性的特殊化学基团。特异性的特殊化学基团。生化析之免疫析6一、基本概念、抗原（Antigen,Ag)生化析之免疫析免疫原性的化学基础免疫原性的化学基础生化析之免疫析7免疫原性的化学基础生化析之免疫析7、抗体 通过免疫应答产生的，能够与抗原发生特异性反应的蛋白质就是抗体。a:抗体的结构 b:免疫球蛋白的种类 c:免疫球蛋白的抗原决定簇 d:抗体的制备 e:单克隆抗体 生化析之免疫析8、抗体生化析之免疫析8 a:抗体的结构(1)生化析之免疫析9 a:抗体的结构(1)生化析之免疫析9 a:抗体的结构(2)生化析之免疫析10 a:抗体的结构(2)生化析之免疫析10 a:抗体的结构(3)抗原结合段(Fragment AntigenBinding,Fab)结晶段(Fragment Crystalization,Fc)F(ab)2 生化析之免疫析11 a:抗体的结构(3)抗原结合段(Fragment Anb:免疫球蛋白的种类Ig G、Ig A、Ig M、Ig D、Ig E重链类型:、轻链类型:、生化析之免疫析12b:免疫球蛋白的种类Ig G、Ig A、生化析之免免疫球蛋白的种类(2)生化析之免疫析13免疫球蛋白的种类(2)生化析之免疫析13c:免疫球蛋白的抗原决定簇n n免疫球蛋白本身是良好的抗原免疫球蛋白本身是良好的抗原,其分子之间的结构其分子之间的结构差异表现为抗原性的不同差异表现为抗原性的不同,表现在各免疫球蛋白表现在各免疫球蛋白 分子的抗原决定簇中氨基酸的组成和序列的不同分子的抗原决定簇中氨基酸的组成和序列的不同.血清学上据此将免疫球蛋白分子的抗原决定簇分血清学上据此将免疫球蛋白分子的抗原决定簇分为以下三种类型为以下三种类型:n n同种同型同种同型(Isotype):(Isotype):同一种属所有个体共同具有的免同一种属所有个体共同具有的免疫球蛋白分子抗原特异性疫球蛋白分子抗原特异性.n n同种异型同种异型(Allotype):(Allotype):同一物种不同个体间免疫球蛋白同一物种不同个体间免疫球蛋白具有不同的抗原特异性具有不同的抗原特异性.n n独特型独特型(Idiotype):(Idiotype):不同个体的每一抗体产生克隆不同个体的每一抗体产生克隆,针针对不同抗原时对不同抗原时,产生的不同特异性抗体的高变区之氨基酸产生的不同特异性抗体的高变区之氨基酸种类和排列各异种类和排列各异,因此表现出各自独特的抗原特异性因此表现出各自独特的抗原特异性.生化析之免疫析14c:免疫球蛋白的抗原决定簇免疫球蛋白本身是良好的抗原,其分d:抗体的制备(1)(1)(1)、抗原的制备、抗原的制备、抗原的制备、抗原的制备（半抗原与载体蛋白的偶联（半抗原与载体蛋白的偶联）：重氮盐偶联法、重氮盐偶联法、碳二亚胺法、碳二亚胺法、戊二醛法、戊二醛法、混合酸酐法混合酸酐法生化析之免疫析15d:抗体的制备(1)(1)、抗原的制备（半抗原与载体蛋白的偶重氮盐偶联法生化析之免疫析16重氮盐偶联法生化析之免疫析16 碳二亚胺法生化析之免疫析17 碳二亚胺法生化析之免疫析17戊二醛法生化析之免疫析18戊二醛法生化析之免疫析18混合酸酐法生化析之免疫析19混合酸酐法生化析之免疫析19d:抗体的制备(2)(2)、影响免疫应答的因素影响免疫应答的因素:遗传因素、抗原给予方式、佐剂的影响生化析之免疫析20d:抗体的制备(2)(2)、影响免疫应答的因素:生化析之免d:抗体的制备(3)(3)(3)、抗体产生的细胞理论抗体产生的细胞理论抗体产生的细胞理论抗体产生的细胞理论生化析之免疫析21d:抗体的制备(3)(3)、抗体产生的细胞理论生化析之免疫析d:抗体的制备(4)n n(4)(4)、抗体产生的动力学、抗体产生的动力学、抗体产生的动力学、抗体产生的动力学生化析之免疫析22d:抗体的制备(4)(4)、抗体产生的动力学生化析之免疫析2d:单克隆抗体次黄嘌呤(Hypoxanthine)氨基碟呤(Aminopterin)胸腺嘧啶(Thymidine)次黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶核苷激酶(TK)生化析之免疫析23d:单克隆抗体次黄嘌呤(Hypoxanthine)生化析之免二、免疫分析方法n n1 1、分析方法基础：抗原抗体反应、分析方法基础：抗原抗体反应n n2 2、基于免疫沉淀反应的经典方法、基于免疫沉淀反应的经典方法n n3 3、标记免疫分析方法、标记免疫分析方法生化析之免疫析24二、免疫分析方法1、分析方法基础：抗原抗体反应生化析之免疫析、分析方法基础：抗原抗体反应 a a、结合力：、结合力：离子键（静电）疏水力离子键（静电）疏水力 范德华力范德华力 氢键氢键 b b、价态：、价态：可以与一个抗体分子反应的抗原的数目可以与一个抗体分子反应的抗原的数目 c c、特点、特点：高度特异性可逆性高度特异性可逆性生化析之免疫析25、分析方法基础：抗原抗体反应生化析之免疫析25、基于免疫沉淀反应的经典方法n n凝聚反应（Agglutination Reaction)Agglutination Reaction)颗粒性抗原（细菌血球等）与相应抗体在适颗粒性抗原（细菌血球等）与相应抗体在适当条件下相当条件下相 互作用，经过一定时间出现肉眼可见互作用，经过一定时间出现肉眼可见的凝聚现象的凝聚现象 直接凝集反应直接凝集反应:颗粒性抗原与相应抗体直接作用颗粒性抗原与相应抗体直接作用.间接凝集反应间接凝集反应:可溶性抗原或抗体与无关载体可溶性抗原或抗体与无关载体(颗粒颗粒)结合结合后后 再与相应抗体作用出现凝集再与相应抗体作用出现凝集.n n沉淀反应（Precipitation Reaction)Precipitation Reaction)可溶性抗原与相应抗体在适当条件下反应，经可溶性抗原与相应抗体在适当条件下反应，经过一定时间出现可见的沉淀现象过一定时间出现可见的沉淀现象生化析之免疫析26、基于免疫沉淀反应的经典方法凝聚反应（Agglutina沉淀反应（Precipitation Reaction)生化析之免疫析27沉淀反应（Precipitation Reaction)生化凝胶沉淀反应(免疫扩散)单向琼脂扩散实验单向琼脂扩散实验(Simple Diffusion Test):(Simple Diffusion Test):定量检测各种免疫球蛋白及亚类及其它血清蛋白定量检测各种免疫球蛋白及亚类及其它血清蛋白 双向扩散实验双向扩散实验(Double Diffusion Test):(Double Diffusion Test):复杂抗原成分的精细分析及抗原抗体纯度测量复杂抗原成分的精细分析及抗原抗体纯度测量生化析之免疫析28凝胶沉淀反应(免疫扩散)单向琼脂扩散实验(Simple D双向扩散实验(Double Diffusion Test):A:同一性反应B:非同一性反应C:部分同一性反应生化析之免疫析29双向扩散实验(Double Diffusion Test):免疫电泳n n免疫电泳免疫电泳 Immunoelectrophoresis Immunoelectrophoresis 抗原样品在凝胶中电泳分离后抗原样品在凝胶中电泳分离后,在抗原谱带旁开槽加入抗在抗原谱带旁开槽加入抗体进行双向扩散体进行双向扩散,在适当处出现沉淀线在适当处出现沉淀线.常用于鉴定提出物纯度常用于鉴定提出物纯度n n对流免疫电泳对流免疫电泳 Counter Immunoelectrophoresis Counter Immunoelectrophoresis 电泳缓冲液的电泳缓冲液的pHpH值界于抗原抗体值界于抗原抗体pIpI之间之间,抗原抗体在电抗原抗体在电场作用下向相反方向泳动场作用下向相反方向泳动,两者相遇于合适比例处形成沉淀线两者相遇于合适比例处形成沉淀线.灵敏度比双向扩散提高灵敏度比双向扩散提高3-43-4倍倍.n n火箭电泳火箭电泳 Rocket Immunoelectrophoresis Rocket Immunoelectrophoresis 在单向扩散的基础上进行电泳的方法在单向扩散的基础上进行电泳的方法.实验快速实验快速.生化析之免疫析30免疫电泳免疫电泳 Immunoelectrophoresis火箭电泳 Rocket Immunoelectrophoresis生化析之免疫析31火箭电泳 Rocket Immunoelectrophore3、标记免疫分析方法n n均相免疫分析均相免疫分析 (Homogeneous Immunoassay):(Homogeneous Immunoassay):不需要结合与游离相的分离不需要结合与游离相的分离n n异异(多多)相免疫分析相免疫分析 (Heterogeneous Immunoassay):(Heterogeneous Immunoassay):需需要固要固液两相的分离液两相的分离n n非竞争性免疫分析非竞争性免疫分析(Non-competitive Immunoassay)(Non-competitive Immunoassay)n n竞争性免疫分析竞争性免疫分析 (Competitive Immunoassay)(Competitive Immunoassay)生化析之免疫析323、标记免疫分析方法均相免疫分析(Homogeneous 均相免疫分析均相免疫分析 (Homogeneous Immunoassay):(Homogeneous Immunoassay):生化析之免疫析33均相免疫分析(Homogeneous Immunoassa异异(多多)相免疫分析相免疫分析 (Heterogeneous Immunoassay):(Heterogeneous Immunoassay):n n固相载体固相载体:微粒固定相微粒固定相:非磁性非磁性(乳胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖乳胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝胶凝胶)及磁性两类及磁性两类 固体表面固定相固体表面固定相 涂覆试管涂覆试管 微孔板微孔板生化析之免疫析34异(多)相免疫分析(Heterogeneous Immun非竞争性免疫分析非竞争性免疫分析(Non-competitive Immunoassay)(Non-competitive Immunoassay)生化析之免疫析35非竞争性免疫分析(Non-competitive Immun竞争性免疫分析竞争性免疫分析 (Competitive Immunoassay)(Competitive Immunoassay)生化析之免疫析36竞争性免疫分析(Competitive Immunoass竞争性免疫分析分析条件的优化(1)经验性方法a)确定标记抗原的浓度:Ag*=1/5Ag2Agb)抗体稀释曲线c)工作曲线生化析之免疫析37竞争性免疫分析分析条件的优化(1)经验性方法生化析之免疫析3竞争性免疫分析分析条件的优化(2)n n求最高灵敏度的优化法求最高灵敏度的优化法(1)(1)生化析之免疫析38竞争性免疫分析分析条件的优化(2)求最高灵敏度的优化法(1)n n求最高灵敏度的优化法求最高灵敏度的优化法(2)(2)生化析之免疫析39求最高灵敏度的优化法(2)生化析之免疫析39主要的标记免疫分析方法生化析之免疫析40主要的标记免疫分析方法生化析之免疫析40酶免疫分析方法（）酶标试剂酶的选择酶的选择 碱性磷酸酯酶、过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、过氧化物酶、-D-D-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、尿素酶葡萄糖氧化酶、尿素酶 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶、溶菌酶、马来酸脱氢酶磷酸脱氢酶、溶菌酶、马来酸脱氢酶酶的标记酶的标记 酶标记反应要尽可能小地影响酶和免疫反应的活性；酶标记反应要尽可能小地影响酶和免疫反应的活性；酶与连接物之间的化学键在酶与连接物之间的化学键在EIAEIA条件下稳定；条件下稳定；酶的标记率要低，高的标记率会影响酶的标记率要低，高的标记率会影响EIA EIA 的灵敏度；的灵敏度；自由态酶及被标记物应尽可能完全地与结合物分离；自由态酶及被标记物应尽可能完全地与结合物分离；抗原与抗体上所标记的酶数目要一致，且能控制抗原与抗体上所标记的酶数目要一致，且能控制生化析之免疫析41酶免疫分析方法（）酶标试剂生化析之免疫析41酶免疫分析方法（）n n固定相的选择 对免疫反应试剂具有高的重现性和容量对免疫反应试剂具有高的重现性和容量 抗原与抗体间的反应速度快抗原与抗体间的反应速度快 容易使用容易使用 解离小解离小 可固定化多种不同类型的免疫反应试剂可固定化多种不同类型的免疫反应试剂生化析之免疫析42酶免疫分析方法（）固定相的选择生化析之免疫析42酶免疫分析方法（）影响酶免疫分析的因素影响免疫反应的因素：影响免疫反应的因素：PBS PBS 缓冲液、时间、温度缓冲液、时间、温度影响酶分析的因素：影响酶分析的因素：底物的选择，例如底物的选择，例如,硝基苯磷酸酯（硝基苯磷酸酯（ALP,NaOH,405 nm)ALP,NaOH,405 nm)，邻苯二胺（邻苯二胺（OPD)(OPD)(过氧化物酶，硫酸，过氧化物酶，硫酸，492 nm492 nm）抗体的影响抗体的影响:抗体亲和性高，分析灵敏度高抗体亲和性高，分析灵敏度高桥基的影响：桥基的影响：酶标记抗原与产生抗血清的免疫原在结构上比较接酶标记抗原与产生抗血清的免疫原在结构上比较接 近，因而产生对桥基的识别近，因而产生对桥基的识别(半抗原半抗原)生化析之免疫析43酶免疫分析方法（）影响酶免疫分析的因素生化析之免疫析43酶免疫分析方法实例Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)分析人血清中分析人血清中HbsAgHbsAg：酶标板中每孔加酶标板中每孔加200uL200uL鼠抗人乙肝表面抗原单克隆抗体溶液，鼠抗人乙肝表面抗原单克隆抗体溶液，置冰箱中（置冰箱中（）过夜）过夜用用PBS-Tween 20PBS-Tween 20缓冲溶液洗次（每次分钟）缓冲溶液洗次（每次分钟）每孔加样品每孔加样品100100LL，并设阴阳空白对照孔，并设阴阳空白对照孔每孔加入酶标抗体每孔加入酶标抗体50L50L，置振荡器上振荡，置振荡器上振荡min,37min,37温育温育60 min,60 min,弃去孔内液体，洗涤液（含弃去孔内液体，洗涤液（含0.05%Tween-20 0.05%Tween-20 的的PBSPBS）注满每孔，）注满每孔，静置静置3 min3 min，甩干，重复次，甩干，重复次每孔加入底物溶液每孔加入底物溶液(OPD/TMB,H(OPD/TMB,H2 2OO2 2)100)100L,L,振荡混匀，振荡混匀，3737反应反应15 min.15 min.每孔加入每孔加入50ul50ul硫酸溶液终止反应；光度检测硫酸溶液终止反应；光度检测生化析之免疫析44酶免疫分析方法实例Enzyme Linked Immunos荧光免疫分析(1)荧光标记物荧光素类标记物荧光素类标记物罗丹明类标记物罗丹明类标记物香豆素类标记物香豆素类标记物藻胆蛋白类标记物藻胆蛋白类标记物生物体液中荧光检测的局限性散射：散射：瑞利散射、拉曼散射、丁道尔散射瑞利散射、拉曼散射、丁道尔散射背景荧光：背景荧光：生物体液含有多种荧光物质，主要影响均相生物体液含有多种荧光物质，主要影响均相FIA.FIA.淬灭效应：淬灭效应：血清中的蛋白质胆红素等可以吸收激发或发射光的能量而产生淬血清中的蛋白质胆红素等可以吸收激发或发射光的能量而产生淬灭现象灭现象光漂白作用：光漂白作用：荧光分子受到激发光连续照射时会产生光分解而使得荧光强荧光分子受到激发光连续照射时会产生光分解而使得荧光强度减小度减小生化析之免疫析45荧光免疫分析(1)荧光标记物生化析之免疫析45荧光标记物异硫氰基荧光素(FITC)四甲基罗丹明异硫氰酸酯散形酮生化析之免疫析46荧光标记物异硫氰基荧光素(FITC)四甲基罗丹明异硫氰酸酯生化析之免疫析培训ppt课件47均相荧光免疫分析（）n n荧光偏振免疫分析荧光偏振免疫分析(FPIA)(FPIA)荧光偏振值p生化析之免疫析48均相荧光免疫分析（）荧光偏振免疫分析(FPIA)荧光偏振值均相荧光免疫分析（）n n荧光激发共振能量转移免疫分析荧光激发共振能量转移免疫分析(FETIA)(FETIA)生化析之免疫析49均相荧光免疫分析（）荧光激发共振能量转移免疫分析(FETI均相荧光免疫分析（）n n荧光淬灭免疫分析荧光淬灭免疫分析(FQIA)(FQIA)荧光素标记的标样（抗原）用作示踪剂示踪剂和被分析物与特异性抗体结合时并不影响示踪剂发荧光在免疫反应后加入抗荧光素抗体，该抗体与游离示踪剂结合使其与荧光淬灭由于空间阻碍，抗荧光素抗体不能和与抗体结合的示踪剂结合生化析之免疫析50均相荧光免疫分析（）荧光淬灭免疫分析(FQIA)荧光素标均相荧光免疫分析（）n n底物标记荧光免疫分析底物标记荧光免疫分析(SLFIA)(SLFIA)生化析之免疫析51均相荧光免疫分析（）底物标记荧光免疫分析(SLFIA)生非均相荧光免疫分析（）n n时间分辨荧光免疫分析（）时间分辨荧光免疫分析（）生化析之免疫析52非均相荧光免疫分析（）时间分辨荧光免疫分析（）生化析之时间分辨荧光免疫分析（）生化析之免疫析53时间分辨荧光免疫分析（）生化析之免疫析53时间分辨荧光免疫分析（时间分辨荧光免疫分析（3 3）生化析之免疫析54时间分辨荧光免疫分析（3）生化析之免疫析54非均相荧光免疫分析（）酶联荧光免疫分析酶联荧光免疫分析生化析之免疫析55非均相荧光免疫分析（）酶联荧光免疫分析生化析之免疫析55非均相荧光免疫分析（）多重免疫分析多重免疫分析多重免疫分析指对一个样品同时可进行两个或两个以多重免疫分析指对一个样品同时可进行两个或两个以上成分分析的系统进行多重免疫分析可采用两种原理，上成分分析的系统进行多重免疫分析可采用两种原理，一种是采用光谱不重叠的标记物，另一种则是单一的标记一种是采用光谱不重叠的标记物，另一种则是单一的标记物，但采用空间上的分离物，但采用空间上的分离生化析之免疫析56非均相荧光免疫分析（）多重免疫分析生化析之免疫析56免疫分析发展的趋势n n基因工程抗体n n生物素亲和素（Biotin-(Streptavidin)Avidin Couple,简称ABC）体系n n自动化和实用化的免疫分析方法生化析之免疫析57免疫分析发展的趋势基因工程抗体生化析之免疫析57基因工程抗体抗独特型抗体抗独特型抗体:抗独特型抗体的特点是其结合位置是独特型抗体的抗原结抗独特型抗体的特点是其结合位置是独特型抗体的抗原结合位点合位点(Fab(Fab端端).).抗独特型抗体的结合反应性质类似抗原抗独特型抗体的结合反应性质类似抗原.双特异型抗体双特异型抗体:通过两个不同单克隆抗体细胞系的二次融合杂交和抗体筛通过两个不同单克隆抗体细胞系的二次融合杂交和抗体筛选可得到具有两个不同抗原结合位点的抗体选可得到具有两个不同抗原结合位点的抗体(L(L1 1H H1 1-L-L2 2H H2 2型型)双功能抗体双功能抗体:双功能抗体的重链的恒定区部分是酶的结构双功能抗体的重链的恒定区部分是酶的结构,其其FabFab端有两端有两个抗原结合位点个抗原结合位点.生化析之免疫析58基因工程抗体抗独特型抗体:生化析之免疫析58生物素亲和素体系（Biotin-(Streptavidin)Avidin Couple,ABC）生化析之免疫析59生物素亲和素体系（Biotin-(Streptavid自动化和实用化的免疫分析方法自动化免疫分析仪自动化免疫分析仪大众化免疫分析试剂大众化免疫分析试剂免疫分析法和其它技术的联用免疫分析法和其它技术的联用生化析之免疫析60自动化和实用化的免疫分析方法自动化免疫分析仪生化析之免疫析大众化免疫分析试剂示例生化析之免疫析61大众化免疫分析试剂示例生化析之免疫析61