水中细菌总数和大肠菌群的测定培训课件

水中细水中细菌总数菌总数和大肠和大肠菌群的菌群的测定测定水中细菌总数和大肠菌群的测定1 1一一 实验目的实验目的n1、掌握、掌握细菌菌总数的数的测定方法定方法n2、掌握大、掌握大肠杆菌的杆菌的鉴定和定和计数数方法方法n3、巩固无菌操作技、巩固无菌操作技术一 实验目的1、掌握细菌总数的测定方法2 1.1.细菌总数测定细菌总数测定原理原理 用用营养养琼脂脂倾注平板，注平板，测定被定被检物在物在单位重量或体位重量或体积（g g或或mlml）内所含有的活）内所含有的活细菌菌数量，以判明被数量，以判明被检物被物被细菌菌污染的程度。染的程度。二二 实验原理实验原理 1.细菌总数测定原理 用营养琼脂倾注平板，测32 大肠杆菌鉴定原理大肠杆菌鉴定原理n大大肠菌群：一群能菌群：一群能发酵乳糖、酵乳糖、产酸酸产气、需气、需氧和兼性氧和兼性厌氧的革氧的革兰氏阴性无芽氏阴性无芽孢杆菌。杆菌。该菌主要来源于人畜菌主要来源于人畜粪便，故以此作便，故以此作为粪便便污染指染指标来来评价食品的价食品的卫生生质量，推断食品中量，推断食品中有否染有否染肠道致病菌的可能。道致病菌的可能。n 样品中大品中大肠菌群系以菌群系以100mL100mL（g g）检样内大内大肠菌群最大可能数（菌群最大可能数（MPN)MPN)表示。表示。2 大肠杆菌鉴定原理大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧4 细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序 样品样品 细菌总数细菌总数 大肠菌群大肠菌群 水样稀释或不稀释水样稀释或不稀释 水样稀释或不稀释水样稀释或不稀释 第一步第一步-初步发酵试验初步发酵试验 倾注平板培养倾注平板培养 （乳糖发酵）（乳糖发酵）37 24小时小时 37 24小时小时 菌落计数菌落计数 第二步第二步-平板分离培养平板分离培养（取平均数报告）（取平均数报告）（转种鉴别培养基）（转种鉴别培养基）37 24小时小时 革兰染色镜检革兰染色镜检 第三步第三步-乳糖复发酵试验乳糖复发酵试验 报告结果报告结果 细 菌 学 5 三、实验器材三、实验器材 1 1、恒温培养箱（、恒温培养箱（361361）、恒温水浴）、恒温水浴锅（461461）、天平、天平、灭菌培养皿、菌培养皿、试管。管。22、培养基及、培养基及试剂：n 乳糖胆乳糖胆盐发酵管、伊酵管、伊红美美蓝琼脂平板脂平板（EMBEMB）、牛肉膏蛋白）、牛肉膏蛋白胨培养基培养基 三、实验器材61.以以1ml无菌吸管吸取无菌吸管吸取样品品1ml加入加入9ml 无菌生理无菌生理盐水，水，使使样品（自来水、品（自来水、饮用水、用水、饮料等）成料等）成 1：10 、1：100 、1：1000 等几个稀等几个稀释度；度；样品（下水道水、品（下水道水、牛奶）稀牛奶）稀释度要适当高。度要适当高。2.分分别在无菌平皿内加入在无菌平皿内加入1：100、1：10、原、原样的的样品各品各1ml，每个稀，每个稀释度均做一个平板。度均做一个平板。注意注意 ：先加：先加浓度低的度低的样品，再加品，再加浓度高的度高的样品品3.将冷却将冷却45的的营养养琼脂脂倾注于平皿中，注于平皿中，摇匀，置匀，置37 培养培养24小小时。四、实验步骤四、实验步骤-细菌总数测定细菌总数测定1.以1ml无菌吸管吸取样品1ml加入9ml 无菌生理盐水，7平皿分平皿分4部分点数（部分点数（见图）求同一求同一稀释度的平均菌落数稀释度的平均菌落数 如：如：A1数数+A2数数+A3 3 4、菌落计数：、菌落计数：4、菌落计数：8 1）平板菌落数的）平板菌落数的选择 2）稀）稀释度的度的选择 3）菌落数的）菌落数的报告告 菌落数菌落数100 按按实有数有数报告告 菌落数菌落数100 采用两位有效数，后面采用两位有效数，后面数数值 四舍五入（也可用四舍五入（也可用10的指数表示）的指数表示）无法无法计数数 无法无法计数数报告告 （注明水注明水样的稀的稀释倍倍数）数）5.菌落计数的报告：菌落计数的报告：1）平板菌落数的选择 5.菌落计数的报告：9 稀释度的选择：稀释度的选择：1.1.应选择平均菌落数在平均菌落数在30-30030-300之之间的稀的稀释度，乘度，乘以稀以稀释倍数倍数报告之告之2.2.若有两个稀若有两个稀释度其生度其生长之菌落数均在之菌落数均在30-30030-300，则应视二者之比如何来决定，若其比二者之比如何来决定，若其比值小于小于2 2，应报告平均数。告平均数。若其比若其比值大于大于2 2则报告其中告其中较小的数字。小的数字。3.3.若所有平均菌落数均大于若所有平均菌落数均大于300300，则应按稀按稀释度最度最高的平均菌落数乘以稀高的平均菌落数乘以稀释倍数倍数报告之。告之。稀释度的选择：10 4.4.若所有稀若所有稀释度的平均菌落数均小于度的平均菌落数均小于3030，则应按按稀稀释度最低的平均菌落数乘以稀度最低的平均菌落数乘以稀释倍数倍数报告之。告之。5.5.若所有稀若所有稀释度的平均菌落数均不在度的平均菌落数均不在30-30030-300之之间，其中一其中一 部分大于部分大于300300或小于或小于3030时，则以最接近以最接近3030或或300300的平均菌的平均菌 落数乘以稀落数乘以稀释倍数倍数报告之。告之。6.6.若所有稀若所有稀释度的菌落数均不可度的菌落数均不可计数，数，则以最高以最高稀稀释倍数无法倍数无法计数数 报告之。告之。4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度11稀释度选择及细菌总数报告方法稀释度选择及细菌总数报告方法 稀释液及菌落数稀释液及菌落数 10-1 10-2 10-3 1 1,365 164 20 16，400 16，000或或1.6104 2 2,760 295 46 1.6 37，750 38，000或或3.8 104 3 2,890 271 60 2.2 27，100 27，000或或2.7104 4 不可计不可计 4，650 513 513，000 510，000或或5.1 105 5 27 11 5 270 270或或2.7 102 6 不可计不可计 305 12 30，500 31，000或或3.1 104 7 不可计不可计 不可计不可计 不可计不可计 10-3无法计数无法计数 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌落菌落数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml)报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)稀释度选择及细菌总数报告方法 稀释 平均 菌落数例 12菌落菌落计数的数的报告告:菌落数菌落数 报告告结果果1、30300 之之间 平均菌落数平均菌落数 X 稀稀释倍数倍数 2、求比求比值 2 取取较小稀小稀释倍数倍数 在在30300之之间 300 最高稀最高稀释度平均菌落数度平均菌落数 X 最高稀最高稀释倍数倍数 4、300 30 6、无法无法计数数 报告无法告无法计数数 取最接近的取最接近的 X 稀稀释倍数倍数(若有两个稀若有两个稀释度度)菌落计数的报告:取最接近的 X 稀释倍数(若有两个13五、大五、大肠菌群的菌群的检测 检品品 胆胆盐乳糖乳糖发酵管酵管 伊伊红美美兰平板平板 大大肠杆菌菌落杆菌菌落纯培养培养 乳糖复乳糖复发酵管（酵管（-）乳糖复乳糖复发酵管（酵管（）五、大肠菌群的检测14n1、检样稀释、检样稀释n以无菌操作将以无菌操作将检样1mL1mL放于含有放于含有9mL9mL灭菌生理菌生理盐水或水或其他稀其他稀释液的液的灭菌玻璃瓶内，菌玻璃瓶内，经充分振充分振摇或研磨做成或研磨做成1 1：1010的均匀稀的均匀稀释液。液。n用用1ml1ml灭菌吸管吸取菌吸管吸取1 1：1010稀稀释液液1mL1mL，注入含有，注入含有9mL9mL生理生理盐水或其他稀水或其他稀释液的液的试管内，振管内，振摇试管混匀，做管混匀，做成成1 1：100100的稀的稀释液。液。n另取另取1ml1ml灭菌吸管，按上述操作依次作菌吸管，按上述操作依次作1010倍倍递增稀增稀释液。液。n根据食品根据食品卫生要求或生要求或对检验样品品污染情况估染情况估计，选择三个稀三个稀释度，每个稀度，每个稀释度，接种度，接种3 3管，每支管，每支试管接管接种种1ml1ml。1、检样稀释15n2.乳糖发酵试验乳糖发酵试验n 将待将待检样品接种于乳糖胆品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在酵管内，接种量在1mL1mL以上者，用双料乳糖胆以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；酵管；1mL1mL及及1mL1mL以以下者，用下者，用单料乳糖料乳糖发酵管。每一个稀酵管。每一个稀释度接种度接种3 3管，管，置置36361温箱内，培养温箱内，培养24h2h，如所有乳糖，如所有乳糖胆胆盐发盐发酵管都不酵管都不产产气，气，则则可可报报告告为为大大肠肠菌群阴性，菌群阴性，如有如有产产生者，生者，则则按下列程按下列程续进续进行。行。2.乳糖发酵试验163.3.分离培养分离培养n 将将产气的气的发酵管分酵管分别转种在伊种在伊红美美蓝琼脂平板上，置脂平板上，置36361温箱内，培养温箱内，培养18h24h，然后取出，然后取出，观观察菌察菌落形落形态态并做革并做革兰兰氏染色和氏染色和证实试验证实试验。4.4.证实试验n在上述平板上，挑取可疑大在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落菌群菌落1212个个进行革行革兰氏氏染色，同染色，同时接种乳糖接种乳糖发酵管，置酵管，置36361的温箱内培养的温箱内培养24h2h，观观察察产产气情况。气情况。n凡乳糖管凡乳糖管产产气、革气、革兰兰氏染色氏染色为为阴性无芽胞杆菌，即阴性无芽胞杆菌，即报报告告为为大大肠肠菌群阳性。菌群阳性。5.5.报告告n根据根据证实为大大肠菌群阳性的管数，菌群阳性的管数，查MPNMPN检索表，索表，报告每告每100mL100mL（g g）食品中大）食品中大肠菌群的菌群的MPNMPN值。3.分离培养17表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 MPN 100mL(g）95%可信限 1mL(g)3 0.1mL(g)3 0.01mL(g)3 下限 上限 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 30 30 60 90 5 90 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 2 3 30 60 90 120 5 130 0 0 0 0 2 2 2 2 0 1 2 3 60 90 120 160 0 0 0 0 3 3 3 3 0 1 2 3 90 130 160 190 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2 3 40 70 110 150 5 10 200 210 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 70 110 150 190 10 30 230 360 1 1 1 1 2 2 2 2 0 1 2 3 110 150 200 240 30 360 1 1 1 1 3 3 3 3 0 1 2 3 160 200 240 290表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 18 2 2 2 200000123901402002601030360370 2 2 2 2111101231502002703403070440890 2 2 2 222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000 2009010360 21015030440 22021019大肠菌群测定大肠菌群测定 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。产酸判断：紫色培养液变成黄色产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。需进一步试验。大肠菌群测定 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；抑制20水中细菌总数和大肠菌群的测定培训课件2121 饮用饮用水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标 指指 标标 细菌总数细菌总数 大肠菌群大肠菌群 饮用饮用水水 100个个/ml 3个个/L 消毒牛奶消毒牛奶 30，000个个/ml 40个个/100ml 瓶装汽水、果味水瓶装汽水、果味水 及果汁类饮料及果汁类饮料 品品 种种 100个个/ml 5个个/100ml 饮用水、乳、冷饮食品卫生标准的细22五、实验报告五、实验报告（一）、列表（一）、列表记录并并计算算实验结果果（二）、思考（二）、思考题1 1、怎、怎样判断分离到的微生物是大判断分离到的微生物是大肠杆菌杆菌？2 2、接种了微生物的培养皿、接种了微生物的培养皿为什么要倒置什么要倒置培养？培养？五、实验报告（一）、列表记录并计算实验结果23实验准备（实验准备（2个样品）个样品）n培养皿：培养皿：1010套套/组n无菌水：无菌水：1010支（支（9 9毫升毫升/支）支）n乳糖胆乳糖胆盐发酵培养基：酵培养基：1818支支试管、管、5ml/5ml/支支100ml100mln伊伊红美美蓝琼脂培养基（脂培养基（EMBEMB）:100ml:100ml，4 4个平板个平板n牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨培养基培养基:150ml:150ml，6 6个平板个平板实验准备（2个样品）培养皿：10套/组24