反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究课件

皖南医学院硕士学位论文答辩会皖南医学院硕士学位论文答辩会1survivinsurvivin反反义寡核苷酸寡核苷酸诱导白血病白血病细胞凋亡的研究胞凋亡的研究TheeffectofsurvivinantisenseoligonucleotideonapoptosisofHL-60cells研 究 生:陈艳萍 导师:毕富勇 副教授汪萌芽 教 授 学科专业:生理学 研究方向:肿瘤生化 survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究The2前 言1997年耶鲁大学的Altieri博士用EPR-1的cDNA在人类基因组库的杂交筛选实验中发现了一段15kb大小的基因片段，它编码了142个氨基酸组成的Survivin蛋白；Survivin的编码基因 位 于 染 色 体 17q25，是 凋 亡 抑 制 蛋 白（IAP）家族的新成员前言1997年耶鲁大学的Altieri博士用E3StructureofhumanStructureofhumanIAPproteinfamilyIAPproteinfamily17q25BIR:baculoviralIAPrepeatRZF:ringzinc-fingleCARD:caspaserecruitmentdomainInhibitorofApoptosisLocationinhumanchromosomeStructureofhuma4Survivin分子结构长螺旋BIR区Survivin分子结构长螺旋BIR区5Survivin分子结构长螺旋BIR区Survivin分子结构长螺旋BIR区6Survivin分子结构Survivin形成二聚体Survivin分子结构Survivin形成二聚体7Survivin表达肺癌肝癌膀胱癌皮肤癌神经母细胞瘤乳腺癌食管癌胃癌白血病Survivin表达肺癌肝癌膀胱癌皮肤癌神经母细胞瘤乳腺癌8Survivin表达SURVIVIN选择性表达于绝大多数肿瘤组织在正常成人分化组织中不表达（包括癌旁组织）普遍性独特性 Survivin表达SURVIVIN选择性表达于绝大多数肿瘤9Survivin作用!Survivin作用!10Survivin作用Survivin抗凋亡肿瘤细胞分裂增加凋亡减少Survivin作用Survivin肿瘤细胞分裂增加凋亡减11研究内容研究内容12反义Survivinsurvivin表达受抑表达受抑活化细胞凋亡反义Survivinsurvivin表达受抑活化细胞凋亡13技术路线技术路线技术路线14HL-60细胞细胞体外悬浮培养体外悬浮培养掺入反义寡核苷酸掺入反义寡核苷酸48 h48 h后后分别于分别于24h24h、48 48 h h形态学观察、形态学观察、死活细胞计数死活细胞计数收获细胞、检测收获细胞、检测指标指标RT-PCRTUNELFCMHL-60细胞体外悬浮培养掺入反义寡核苷酸48h后分别于15材料 细胞株HL-60细胞株（急性早幼粒细胞系）由中国科学院上海细胞所提供材料细胞株16RNAgentsTotalRNAIsolationSystemPromega公司AccessQuickTMRT-PCRSystemPromega公司PropidumIodide(PI,碘化丙啶)Sigma公司主要药品与试剂材料主要药品与试剂材料17研究方法研究方法18反义寡核苷酸的序列survivin反义硫代寡聚脱氧核苷酸(Aspo)序列5GGCAACGTCGGGGCACCCAT39非特异性对照硫代寡聚脱氧核苷酸(Nspo)序列5GCCATCGTAGGGGATCGCTT39上海SANGON公司合成与纯化反义寡核苷酸的序列survivin反义硫代寡聚脱氧核苷酸(19 培养箱培养箱20%新生新生小牛血清小牛血清RPMI-1640液液100U/ml青霉素青霉素100ug/ml链霉链霉素素37o oC5%CO2饱和湿度饱和湿度倒置显微倒置显微镜观察镜观察23天传天传代一次代一次细胞系的培养和传代HL-60细胞细胞培养箱20%新生小牛血清RPMI-1640液100U20Photo1.HL-60cells（100）Photo1.HL-60cells（100）21Tab1.Theexperimentgroupinggroup factor concentrationControlRPMI-1640mixtureNspo Nspo 15.0umol/LAspo5.0Aspo5.0umol/LAspo10.0Aspo 10.0umol/LAspo15.0 Aspo15.0umol/LTab1.Theexperimentgroupingg22实验分组及寡核苷酸的掺入1000r/min离心5minRPMI-1640洗1次 细胞起始浓度4106/ml 取细胞悬液1000ul接种至24孔板 核酸100 ul 置CO2培养箱中孵育 HL-60细胞 实验分组及寡核苷酸的掺入1000r/minRPMI-164023细胞增殖能力及活力观察 HL-60细胞于24、48h 取50 ul细胞悬液 0.4%台盼蓝染色 计数死活细胞 着色为死细胞拒染为活细胞 计算细胞存活率细胞增殖能力及活力观察HL-60细胞于24、48h取5024细胞增殖能力及活力观察细胞增殖能力及活力观察25HL-60细胞survivinmRNA的表达总总RNARNA的提取的提取HL-60细胞survivinmRNA的表达总RNA的提取26细胞细胞沉淀沉淀加入加入300300ul Dul D液液加入加入30ulSodiumAcetate加入苯酚:氯仿:异戊醇300 ul冰浴冰浴 15min 10000g4离心离心20min20min 转移转移上清上清加入等量加入等量异丙醇异丙醇2020放放置置10min10min10000g4离心离心10min10min75%冷乙醇冷乙醇洗涤洗涤RNA10000g4离心离心10min10min以无以无RNaseRNase的的纯水溶解纯水溶解沉淀沉淀RNARNA纯度纯度检验和定检验和定量量RNA细胞加入300加入30ulSodiumAcetate27HL-60细胞细胞survivinmRNA的表达的表达 RT-PCRRT-PCR HL-60细胞survivinmRNA的表达RT-PCR28反应体反应体系系50l l48延伸延伸4545min 95预预变性变性2minPCR循环循环9545sec611min721min共共30个循环个循环72延伸延伸5min模板模板RNA1ulAMV逆转录酶逆转录酶1ul上游引物上游引物3ul下游引物下游引物3ulAccessQuickTMMasterMix25ul反应体系50l48延伸45min95预变性2mi29Tdt酶介导的缺口末端标记法 具体操作按试剂盒说明书进行具体操作按试剂盒说明书进行 结果与判定：细胞核为棕褐色者为阳性细胞，结果与判定：细胞核为棕褐色者为阳性细胞，即凋亡细胞即凋亡细胞 凋亡细胞指数=凋亡细胞数细胞总数100%Tdt酶介导的缺口末端标记法具体操作按试剂盒说明书进行凋30DNA倍体分析及凋亡率的检测实验流程实验流程DNA倍体分析及凋亡率的检测实验流程31单细单细胞悬胞悬液液不含不含Ca2+或或Mg2+的的PBS洗细胞洗细胞2次次1000g离心离心5minmin弃上清弃上清计数计数细胞细胞总数总数500lPBS重悬重悬5ml冷乙醇冷乙醇4过夜过夜离离心心洗洗细细胞胞2次次含含1%小牛血小牛血清的清的800llPBS重悬重悬避光避光孵育孵育1h100l煮煮沸过的沸过的RNA酶酶A3730分钟分钟FCMFCM分析分析加入加入100lPI单细胞悬液不含Ca2+或Mg2+的PBS洗细胞2次10032统计分析结果均以“均数标准差”表示，组间比较用单因素方差分析，以P0.05确定有显著性意义。统计分析结果均以“均数标准差”表示，组间比较用单因素33结果结果(1)(1)细胞增殖能力及活力观察结果(1)细胞增殖能力及活力观察34Tab2.EffectofAspoonHL-60cellssurvivalrate(xs,n=3)*p0.05,*p0.01vsCcontrol,p0.05,p0.01vsNspoGroupSurvivalrate(%)24h48hControl98.700.70 98.280.45Nspo 98.590.6097.470.47Aspo5.096.770.47*95.050.24*Aspo10.092.631.16*89.081.20*Aspo15.082.610.85*77.710.77*Tab2.EffectofAspoonHL-6035Fig1.EffectofAspoonHL-60cellssurvivalrate(xs)Fig1.EffectofAspoonHL-6036结果结果(2)(2)TUNEL法检测的HL-60凋亡细胞及其凋亡指数结果(2)TUNEL法检测的HL-60凋亡细胞及其凋亡指数37Photo2.control group(DAB400)Photo2.controlgroup(DAB400)38Photo3.Nspo group(DAB400)Photo3.Nspogroup(DAB400)39Photo4.Aspo5.0 group(DAB400)Photo4.Aspo5.0group(DAB400)40Photo5.Aspo10.0 group(DAB400)Photo5.Aspo10.0group(DAB400)41Photo6.Aspo15.0 group(DAB400)Photo6.Aspo15.0group(DAB400)42GroupApoptoticindex(%)PC NControl2.160.29Nspo2.210.25Aspo5.04.770.42*Aspo10.010.630.99*Aspo15.0 21.671.95*p0.05,*p0.01vsCcontrol；p0.05,p0.01vsNspoTab3.ApoptosisindexofHL-60cells(xs,n=3)Group Apoptoticindex(%)43结果结果(3)(3)Aspo处理HL-60细胞survivinmRNA表达的变化 结果(3)Aspo处理HL-60细胞survivinmRNA44Fig2.survivinmRNAexpressionofHL-60cellstreatedbyAspofor48hoursdetectedbyRT-PCR1:100bpDNAladder;2:Control;3:Nspogroup;4:Aspo5.0group;5:Aspo10.0group;6:Aspo15.0group.Fig2.survivinmRNAexpress45Tab4.effectofAspoonsurvivinmRNAexpressionofHL-60cells(xs,n=3)*p0.05,*p0.01vsCcontrol；p0.05,p0.01vsNspoGroupsurvivin/-actinPCNC C NspoNspoAspo5.0Aspo5.0Aspo10.0Aspo10.0Aspo15.0Aspo15.00.8120.0060.8180.0050.7800.0050.5980.0080.4960.012*Tab4.effectofAspoonsurvivi46结果结果(4)(4)流式细胞仪凋亡率的检测结果(4)流式细胞仪凋亡率的检测47Tab.5EffectofdifferentdosesofAspoonHL-60cellsapoptosis(xs,n=3)*p0.05,*p0.01vsCcontrol；p0.05,p0.01vsNspoGroupApoptosisrate(%)PCNC NspoAspo5.0Aspo10.0Aspo15.01.090.491.620.342.670.565.750.9019.800.30*Tab.5Effectofdifferentdos48Fig.5ApoptosispeakmeasuredbyflowcytometryofHL-60treatedwithsurvivinAspoA:controlB:survivinNspoC:survivinAspoFig.5Apoptosispeakme49讨讨 论论讨论50细胞凋亡机制的研究进展：细胞凋亡:又称程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）由Caspases（即含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶）家族成员介导的蛋白酶级联反应过程凋亡机制细胞凋亡机制的研究进展：细胞凋亡:又称程序性细胞死亡（pr51Survivin与白血病的关系Survivin在各种白血病中均有表达，随着病情的缓解survivin表达也降低。且有研究发现survivin低表达的白血病患者，其完全缓解率及存活率高，而survivin高表达患者不易缓解，且易复发survivinmRNA表达与白血病诊断、治疗转归及预后判断密切相关Survivin与白血病的关系Survivin在各种白血病53急性早幼粒细胞白血病的简介白血病是常见的恶性肿瘤之一，发病率2.7610万。在恶性肿瘤的死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下成人中则居第 1位26急性早幼粒细胞白血病（APL）的构成比约占急性白血病的1015%其临床特征之一是严重出血，因此早期病死率高。急性早幼粒细胞白血病的简介白血病是常见的恶性肿瘤之一，发病率54急性早幼粒细胞白血病的治疗现状联合化疗：缓解率可达6080%非特异性细胞毒性，抑制患者造血功能和免疫功能 其毒副作用不但造成患者治疗的相关性死亡，而且影响其“治愈”剂量的临床应用。此外，由于白血病细胞对化疗药物的耐药，多数病人最终复发。随着分子生物学技术的发展和对白血病发生、发展分子机理认识的深入，使白血病的研究进入了基因治疗新阶段。急性早幼粒细胞白血病的治疗现状联合化疗：缓解率可达60855Survivin作为靶基因的思考作为白血病反义治疗的理想靶基因必须具备以下两个条件：在肿瘤发生过程中起关键作用；只有在肿瘤中表达，而在正常组织中不表达。survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性Survivin作用于细胞凋亡中的关键酶-Caspase-3Survivin表达的普遍性和独特性 Survivin作为靶基因的思考作为白血病反义治疗的理想靶56反义核酸序列的选定针对survivin基因的翻译起始密码子和前几位编码序列设计并合成的磷酸二酯键受核酸酶作用，容易被降解，虽能用病毒载体将其转入细胞内，但考虑到安全性和临床的应用，采取的是对磷酸二酯键的磷原子进行硫代修饰，硫代磷酸寡核苷酸有好的溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导RnaseH反义核酸序列的选定针对survivin基因的翻译起始密码子和58survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用凋亡特征TUNEL法能在3，-OH末端通过产生很强的颜色反应（棕褐色）准确定位凋亡的细胞；特异性高，敏感性强，可量化凋亡细胞。细胞凋亡时染色体断裂，DNA被裂解，细胞膜通透性增加，在细胞洗染过程中，DNA碎片逸出，胞内DNA含量明显降低，DNA组方图上在G1/G0峰前出现了特征性的亚二倍体峰，即凋亡峰。survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用凋亡特征59经Aspo处理后的HL-60细胞经TUNEL染色均可见到阳性凋亡细胞，DNA组方图上在G1/G0峰前出现了特征性的亚二倍体峰，表明survivinAspo能够特异性诱导HL-60细胞的凋亡,RT-PCR实验显示本实验所选取的这段反义核酸特异性的抑制survivin基因的表达，提示可能由于降低了HL-60细胞内survivinmRNA的 含 量，从 而 诱 导HL-60细 胞的 凋 亡survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用经Aspo处理后的HL-60细胞经TUNEL染色均可见到阳61survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用台盼兰拒染试验、TUNEL凋亡指数的分析与流式细胞术所检测出的细胞凋亡率均提示Aspo浓度的不同，所导致的细胞凋亡程度亦有不同,随着Aspo浓度的升高，细胞凋亡程度增高,其Aspo对HL-60细胞survivin基因表达的抑制效果也呈递加趋势。survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用台盼兰拒染试62反义survivin可能的作用机制激活核糖核酸酶H，剪切靶mRNA；占领抑制survivin mRNA的翻译阻碍前体mRNA的成熟其向胞浆转运妨碍DNA双链的复制与转录反义survivin可能的作用机制激活核糖核酸酶H，剪切63 本实验证实了survivin基因在急性早幼粒细胞系HL-60细胞的再开放与重新表达，靶向survivin的一段特定的反义硫代寡聚脱氧核苷酸可以降低HL-60细胞中survivinmRNA的表达，从而诱导HL-60细胞的凋亡，其作用有浓度和时间依赖性的特点。为临床应用靶向survivin的反义核酸疗法提供了理论支持。小结与展望本实验证实了survivin基因在急性早幼粒细胞系HL64小结与展望动物实验临床实验靶向Survivin的基因治疗细胞实验小结与展望动物实验临床实验靶向Survivin的基因治疗65致 谢感谢恩师毕富勇毕富勇教授。感谢您对我学业上的指导和生活上的关心。本论文从选题设计、科研实践到论文撰写的全过程倾注了您大量心血；您严谨的治学精神、正直的为人将是我终生学习的楷模，您循循善诱的教诲、父亲般的关心将使我永远难忘感谢导师汪萌芽教授，您在科研工作上一丝不苟的认真态度将使我受益终生致谢感谢恩师毕富勇教授。感谢您对我学业上的指导66致 谢感谢吕俊、吴明彩、方基勇、陈祥攀等老师在实验中对我的大力支持感谢陈文魁教授和唐小牛老师对实验给予的热心指导感谢赵向中、刘正同学、齐世美师妹在实验完成过程中给予的帮助感谢郭平实老师为我付出的时间和精力致谢感谢吕俊、吴明彩、方基勇、陈祥攀等老师67致 谢感谢父母二十六年的养育之恩！致谢感谢父母二十六年的养育之恩！68ThanksThanks69