临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法培训ppt课件

临床床PCRPCR检验标本的采本的采集集处理保存及核酸提理保存及核酸提取方法取方法临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法1检验误差的发生率检验误差的发生率n n1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期，而来自检验中期和检验后期的误差率分别为13.3%和18.5%。n n2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法2检验误差的发生率1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验正确采集、运送、保存临床标本正确采集、运送、保存临床标本的重要性的重要性n n质量保证关键性环节质量保证关键性环节n n解决涉及实验室检验的医患纠纷的方解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一法之一临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法3正确采集、运送、保存临床标本的重要性质量保证关键性环节临床核酸提取的重要性核酸提取的重要性n n核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分n n核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否n n临床PCR检验操作中最易出问题的环节临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法4核酸提取的重要性核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分临床P标本采集标本采集n n标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或（过早或过晚都可能会出现假阴性结果）过晚都可能会出现假阴性结果）n n标本采集部位的准备（适度消毒）（适度消毒）n n标本的类型和采集量（衣原体（衣原体 上皮细胞）上皮细胞）n n采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化学分析）学分析）n n采样及运输容器（一次性无菌器材（一次性无菌器材,防腐剂防腐剂,抗凝剂）抗凝剂）n n标本采集中的防污染（一次性无菌容器（一次性无菌容器，防止混入操作防止混入操作者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法5标本采集标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或过晚都可能会标本运送标本运送 n n样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。n n样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。n n实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法6标本运送 样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。临床P临床标本的处理和保存临床标本的处理和保存n n血清（浆）血清（浆）n n全血全血n n外周血单个核细胞外周血单个核细胞n n痰痰n n棉拭子棉拭子n n脓液脓液n n体液体液n n乳汁乳汁n n组织组织临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法7临床标本的处理和保存血清（浆）临床PCR检验标本的采集处理保血清（浆）血清（浆）n nDNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。n nRNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对严禁使用肝素，因其对PCRPCR扩增有抑制，扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（12周）保存可在-20下，较长期保存应在-70下。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法8血清（浆）DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影全血全血n n以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。n n全血样本如用于DNA提取检测,可4下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法9全血以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用ED外周血单个核细胞外周血单个核细胞 n n外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。n n外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70下.临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法10外周血单个核细胞 外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两痰痰n n痰痰属属于于分分泌泌物物,临临床床上上常常用用作作为为结结核核杆杆菌菌DNADNA测测定定标本。标本。n n痰痰标标本本中中含含有有大大量量粘粘蛋蛋白白和和杂杂质质,故故在在核核酸酸提提取取时时,需需对对样样本本进进行行初初步步处处理理，即即用用1 1 mol/L mol/L NaOHNaOH或或变变性剂液化。性剂液化。n n如如用用于于非非结结核核杆杆菌菌如如肺肺炎炎支支原原体体的的PCRPCR检检测测，痰痰标标本本只只能能室室温温悬悬浮浮于于生生理理盐盐水水中中，充充分分振振荡荡混混匀匀，促促使使大大块块粘粘状状物物下下沉沉，取取上上清清离离心心，所所得得到到的的沉沉淀物即可用于核酸提取。淀物即可用于核酸提取。n n液液化化标标本本如如不不立立即即用用于于核核酸酸提提取取,可可保保存存于于-70-70下。下。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法11痰痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本。临床P痰标本处理的基本模式痰标本处理的基本模式n n通用模式n n简单模式临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法12痰标本处理的基本模式临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提痰标本处理通用模式痰标本处理通用模式（1 1）通用标本处理（）通用标本处理（Universal sample processing,Universal sample processing,USPUSP）溶液：）溶液：4-6 mol/L 4-6 mol/L盐酸胍（盐酸胍（GuHClGuHCl）50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5 50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5 25 mmol/L EDTA 25 mmol/L EDTA 0.5%0.5%十二烷基肌酸钠十二烷基肌酸钠十二烷基肌酸钠十二烷基肌酸钠（SarkosylSarkosyl ）0.10.2 mol/L-0.10.2 mol/L-巯基乙醇。巯基乙醇。（2 2）0.05%Tween 800.05%Tween 80。（3 3）10%Chelex-100(10%Chelex-100(含含0.03%Triton X-1000.03%Triton X-100和和0.3%0.3%Tween 20)Tween 20)临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法13痰标本处理通用模式（1）通用标本处理（Universal s一定体积的痰1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min5000g室温离心10-15min，弃上清500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬20000g室温离心10-15min，弃上清加入5倍10%chelex-100，混匀，90温育40min20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法14一定体积的痰1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s10-痰标本处理简单模式痰标本处理简单模式 n n试剂：（试剂：（1 1）裂解液）裂解液:含终浓度含终浓度0.1 mol/L NaOH0.1 mol/L NaOH、50g50g蛋白蛋白酶酶K K和和0.05%Triton X-1000.05%Triton X-10050ul痰6000g离心10分钟，弃上清加入裂解液50ul，60温育30min90温育30min加入Tris-HCl中和以上反应混合物取5ul用于PCR检测临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法15痰标本处理简单模式 试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mo痰标本处理中要注意的问题痰标本处理中要注意的问题n n痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法提取。采用这种方法提取，有可能会在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶，在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑制其后的扩增。n n在PCR主反应混合液中，加入-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制物产生的效果。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法16痰标本处理中要注意的问题痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情棉拭子棉拭子n n在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置510分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。n n如不立即用于核酸提取,则需保存于-70下.临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法17棉拭子在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子脓液脓液n n脓脓液液的的处处理理依依情情况况而而定定,如如用用于于分分枝枝杆杆菌菌(如如结结核核杆杆菌菌)核核酸酸测测定定的的标标本本,粘粘稠稠的的脓脓液液可可采采用用痰痰标标本本的的处处理理模模式式，先先进进行行液液化化，再再离离心心取取沉沉淀淀提提取取DNADNA；水水样样的的脓脓液液则则直直接接离离心心,沉沉淀淀用用生生理理盐水洗盐水洗2 23 3次后次后,即可用于即可用于DNADNA提取。提取。n n对对于于用用于于非非分分枝枝杆杆菌菌测测定定的的脓脓液液标标本本,如如过过于于粘粘稠稠,则则加加入入适适量量生生理理盐盐水水,充充分分振振荡荡后后,静静置置,取取上上清清立立即即离离心心,沉沉淀淀用用于于DNADNA提提取取;如如为为水水样样,则则按上述直接离心取沉淀即可。按上述直接离心取沉淀即可。n n沉淀标本的保存条件同样为沉淀标本的保存条件同样为-70-70。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法18脓液脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测体液体液n临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法19体液临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本乳汁乳汁n n 乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法20乳汁 乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV 乳汁中分枝杆菌乳汁中分枝杆菌DNA的提取的提取n n试剂准备 裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA,2%Triton X-100,4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）,0.3 mol/L 醋酸钠。玻璃珠：（直径：425-600um）临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法21乳汁中分枝杆菌DNA的提取试剂准备 裂解液：50 m乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清脂质和沉淀用750ul裂解液重悬重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌煮沸5min，离心14000rpm，3min650ul上清转移到另一离心管中，等体积异丙醇沉淀70%乙醇洗涤沉淀，干燥50ul Tris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR扩增临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法22乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清脂质和沉淀用75组织组织 n n组组织织有有新新鲜鲜组组织织块块和和石石蜡蜡切切片片。新新鲜鲜组组织织块块的的处处理理步步聚聚首首先先用用生生理理盐盐水水洗洗两两次次,然然后后将将其其捣捣碎碎或或切切碎碎，加加入入生生理理盐盐水水后后剧剧烈烈震震荡荡混混匀匀,离离心心，弃弃上上清清，再再用用蛋蛋白白酶酶K K消消化化后后提提取核酸。取核酸。n n新新鲜鲜组组织织最最好好是是保保存存于于50%50%乙乙醇醇中中,具具体体作作法法是是，先先用用生生理理盐盐水水将将组组织织洗洗一一次次,切切成成宽宽度度小小于于1cm1cm的的小小片片,加加入入适适量量的的生生理理盐盐水水,然然后后,边边摇摇边边加加入入无无水水乙乙醇醇至至终终浓浓度度为为50%.50%.这这样固定的组织标本室温下可保存数日样固定的组织标本室温下可保存数日,4,4可保存可保存6 6年。年。n n石石蜡蜡切切片片用用于于核核酸酸提提取取,需需先先用用辛辛烷烷或或二二甲甲苯苯脱脱蜡蜡,再再用用蛋蛋白酶白酶K K消化后即可进行消化后即可进行DNADNA提取。提取。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法23组织 组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首先用临床标本的滤纸上保存临床标本的滤纸上保存n n临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为RNA，则可稳定数周。n n保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成影响。n n不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、分泌物等均可此种方法。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法24临床标本的滤纸上保存临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸临床标本中临床标本中PCR反应抑制物反应抑制物n n内源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。n n外源性的:如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法25临床标本中PCR反应抑制物内源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血肝素的作用机理肝素的作用机理 n n肝素对肝素对MLVMLV逆转录酶和逆转录酶和TAQ DNATAQ DNA聚合酶均很强的聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，纯化过程中，标本中的肝素可结合于标本中的肝素可结合于DNADNA和和RNARNA上上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。n n对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。作用。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法26肝素的作用机理 肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均肝素的作用机理肝素的作用机理n n每每gg核酸标本中加入核酸标本中加入0.1U0.1U的肝素的肝素,即可即可100%100%的抑的抑制酶活性。制酶活性。n n在标本中加入肝素酶在标本中加入肝素酶I I 或或13 U/g13 U/g核酸核酸(于于5 mM 5 mM Tris pH7.5,1 mM CaCl2,40 U RNase 25 2Tris pH7.5,1 mM CaCl2,40 U RNase 25 2小时小时)可去除肝素的抑制作用。可去除肝素的抑制作用。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法27肝素的作用机理每g核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100血红蛋白、乳铁蛋白n n血红蛋白和乳铁蛋白血红蛋白和乳铁蛋白分别是分别是红细胞红细胞和和白细胞白细胞内的内的主要主要PCRPCR抑制物抑制物,它们均含有铁。它们均含有铁。抑制机制抑制机制可能是：可能是：（1 1）与这些蛋白释放铁离子至与这些蛋白释放铁离子至PCRPCR混合物中有关。混合物中有关。研究铁的抑制效应时，发现其干扰研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNADNA合成，而合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（HeminHemin）等）等血红蛋白衍生物，也是血红蛋白衍生物，也是PCRPCR抑制物。抑制物。（2 2）1%(V/V)1%(V/V)血液可完全抑制血液可完全抑制TaqTaq酶活性酶活性临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法28血红蛋白、乳铁蛋白血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的IgG n nIgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得靶DNA不能与DNA聚合酶相互作用 n n使用煮沸作为标本处理方法或使用PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应的抑制 临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法29IgG IgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得去除或减轻抑制的一些方法去除或减轻抑制的一些方法nNaOH处理可中和临床标本中的Taq DNA聚合酶抑制剂，但这种方法不适用于DNA含量低的标本，因为NaOH处理可使DNA大量丢失。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法30去除或减轻抑制的一些方法NaOH处理可中和临床标本中的Taq去除或减轻抑制的一些方法去除或减轻抑制的一些方法n n加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通常血液含量只能是0.2%。n nBSA也可增加Taq DNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。n n单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法31去除或减轻抑制的一些方法加入0.6%(wt/vol)牛血清核酸纯化n n核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代，在七十年代和八十年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。n n传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法32核酸纯化核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代，在七十年代和一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理n n靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。n n一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法33一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理靶核酸可以与宿主核酸的分离纯化核酸的分离纯化 n n核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。n n经典方法n n硅吸附法n n对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法34核酸的分离纯化 核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩DNA提取的经典方法n即所谓的”酚-氯仿提取法”临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法35DNA提取的经典方法即所谓的”酚-氯仿提取法”临床PCR检临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法36临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法36RNA提取的独特性提取的独特性n n临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。n n如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法37RNA提取的独特性临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具 RNA提取所用器皿的处理提取所用器皿的处理n n经经高高压压灭灭菌菌的的一一次次性性使使用用的的塑塑料料制制品品如如试试管管,离离心心管管等等基基本上无本上无RNase,RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA.RNA.n n实实验验室室用用的的普普通通玻玻璃璃器器皿皿经经常常有有RNaseRNase污污染染,使使用用前前必必须须于于180180干干烤烤8 8小小时时以以上上,或或用用0.1%0.1%焦焦碳碳酸酸二二乙乙酯酯(DEPC)(DEPC)的的水水溶液浸泡用于制备溶液浸泡用于制备RNARNA的烧杯的烧杯,试管和其它用品。试管和其它用品。n nDEPCDEPC是是RNaseRNase的的强强烈烈抑抑制制剂剂。灌灌满满DEPCDEPC的的器器皿皿于于3737下下放放置置2 2小小时时，然然后后用用灭灭菌菌水水淋淋洗洗数数次次，并并于于100100干干烤烤1515分分钟钟，最最后后高高压压蒸蒸汽汽下下1515分分钟钟。上上述述处处理理可可除除去去器器皿皿上上痕痕量量的的DEPC,DEPC,以以防防DEPCDEPC通通过过羧羧甲甲基基化化作作用用对对RNARNA的的嘌嘌呤呤碱碱基基进行修饰。进行修饰。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法38 RNA提取所用器皿的处理经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如RNA提取所用溶液的准备提取所用溶液的准备 n n对对于于RNARNA提提取取所所需需溶溶液液的的配配制制,必必须须用用高高压压灭灭菌菌的的水水和和RNARNA研研究究专专用用的的化化学学试试剂剂配配制制溶溶液液,用用干干烤烤过过的的药药匙匙称称取取试试剂剂,将将溶溶液液装装入入无无RNaseRNase的的玻玻璃璃器器皿皿。可可能能的的话话,溶溶液液均均应应用用0.1%DEPC0.1%DEPC于于3737至至少少处处理理1212小小时时,然然后后于于100100加加热热1515分分钟钟或或高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌1515分钟。分钟。n n须须注注意意的的是是,DEPC,DEPC可可与与胺胺类类迅迅速速发发生生化化学学反反应应,因因此此不不能能用用来来处处理理含含有有TrisTris一一类类的的缓缓冲冲液液,因因此此可可存存几几瓶瓶新新的的,未未开开封封的的TrisTris试试剂剂以以制制备备无无RNaseRNase的的溶溶液。液。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法39RNA提取所用溶液的准备 对于RNA提取所需溶液的配制,必须RNA提取中提取中RNase 污染的控制污染的控制n n实验操作人员的手是RNase污染最主要的潜在来源。n n策略是：在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时,以及在涉及RNA的整个提取操作过程中,都应戴一次性手套。在RNA提取实验中，应勤换手套。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法40RNA提取中RNase 污染的控制实验操作人员的手是RNasRNA提取的常用方法提取的常用方法 n n表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。n n胍盐提取结合氯仿-酚抽提法。n n胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法41RNA提取的常用方法 临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸异硫氰酸胍结合氯仿异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法酚提取法 临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法42异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法 临床PCR检验标本的采集处理保核酸提取的改良方法核酸提取的改良方法 n n旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法n n玻璃粉吸附法 n n二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 n n微量全血核酸提取法：NaI 方法n n其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自动核酸纯化仪临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法43核酸提取的改良方法 旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法旋转离心柱（旋转离心柱（SPIN COLUMN）n n属于硅吸附方法的一种。在原理上现行的旋转离属于硅吸附方法的一种。在原理上现行的旋转离心柱系统通常可分为三个部分：心柱系统通常可分为三个部分：（1 1）利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释）利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来放出来（2 2）把释放的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，）把释放的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，当然这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力当然这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力而对其它的生化组分如蛋白质、多糖、脂类则不而对其它的生化组分如蛋白质、多糖、脂类则不相亲和也不吸附相亲和也不吸附（3 3）把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得）把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。到纯化的核酸。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法44旋转离心柱（SPIN COLUMN）属于硅吸附方法的一种。在临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法45临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法45临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法46临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法46临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法培训ppt课件47二氧化硅（二氧化硅（Se）或硅藻吸附法）或硅藻吸附法 临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法48二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 临床PCR检验标本的采集处理保使用使用NaI的微量全血核酸提取法的微量全血核酸提取法 临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法49使用NaI的微量全血核酸提取法 临床PCR检验标本的采集处理全自动核酸纯化仪全自动核酸纯化仪n n雅培m2000系统 该仪器主要由两个机械臂和八个单道移液器构成，将样品放入样品该仪器主要由两个机械臂和八个单道移液器构成，将样品放入样品管中后，仪器就可以自动工作，利用磁珠法进行核酸（管中后，仪器就可以自动工作，利用磁珠法进行核酸（DNA/RNADNA/RNA）提取。在样品提取完成后，仪器还可以进行提取。在样品提取完成后，仪器还可以进行PCRPCR试剂混合步骤。基本试剂混合步骤。基本上没有手工的操作步骤上没有手工的操作步骤 ，最大样本量：，最大样本量：9696 临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法50全自动核酸纯化仪雅培m2000系统 临床PCR检验标本的采集全自动核酸纯化仪全自动核酸纯化仪n n美国贝克曼库尔特有限公司 SPRI-TE小型化的自动提取：1-10个样品 Vidiera NsP大型化的自动提取:96 样本 临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法51全自动核酸纯化仪美国贝克曼库尔特有限公司 临床PCR检验标本全自动核酸纯化仪全自动核酸纯化仪n nQIAGEN公司生产的 BioRobot MDx Workstation的96通道自动化提取工作站。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法52全自动核酸纯化仪QIAGEN公司生产的 BioRobot M全自动核酸纯化仪全自动核酸纯化仪n n此外还有罗氏推出的MagNA Pure LC 2.0 System，金麦格自动核酸提取系统。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法53全自动核酸纯化仪此外还有罗氏推出的MagNA Pure LC靶核酸提取的质量靶核酸提取的质量 n n纯化的靶核酸的完整性：纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。n n核酸提取的产率：核酸提取的产率：可在A260读数测定。n n核酸纯度：核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定n n血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果 临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法54靶核酸提取的质量 纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本谢谢！谢谢！临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法55谢谢！临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法55临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法56临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法56一、标本收集、运送、保存一、标本收集、运送、保存1、标本收集、标本收集 临床基因扩增检测实验临床基因扩增检测实验室对各种临床标本的收集应按检测要室对各种临床标本的收集应按检测要求建立标准操作程序，并对临床标本求建立标准操作程序，并对临床标本采集人员培训。标本采集的时间，应采集人员培训。标本采集的时间，应在患者疾病发展过程中，标本采集过在患者疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。早或过晚都可能会给出假阴性结果。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法57一、标本收集、运送、保存1、标本收集 临床基因扩增检测实验（1）标本采集部位的准备）标本采集部位的准备 标本采集部标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其它杂物，但应适度，故标本采集部位的它杂物，但应适度，故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。准备应由训练有素的人员进行。（2）标本的类型和采集量）标本的类型和采集量 标本的类型标本的类型 和采集量应根据所测病原体而定。如：和采集量应根据所测病原体而定。如：定量定量PCR对结核分枝杆菌的检测，应选对结核分枝杆菌的检测，应选择患者血脑脊液、胸腹水等标本，不宜择患者血脑脊液、胸腹水等标本，不宜用痰标本，因为痰中结核分枝杆菌分布用痰标本，因为痰中结核分枝杆菌分布不均。不均。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法58（1）标本采集部位的准备 标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的PCR检测衣原体时，由于衣原体感染上检测衣原体时，由于衣原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞，无皮细胞，因此取材一定要取到细胞，无论男女取材均应用特制的拭子，男性应论男女取材均应用特制的拭子，男性应进入尿道进入尿道2-3cm，女性应进入子宫颈口，女性应进入子宫颈口2cm并停留片刻后取出，在分泌物或尿并停留片刻后取出，在分泌物或尿沉渣中检出的阳性率均较低。一般来说，沉渣中检出的阳性率均较低。一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的话，如果样本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。增检测。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法59PCR检测衣原体时，由于衣原体感染上皮细胞，因此取材一定要取（3）采样质量的评价可通过几个方面来）采样质量的评价可通过几个方面来评价标本采集质量，即细胞组成，所需类评价标本采集质量，即细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。评价方法包括型细胞的数量和核酸总量。评价方法包括肉眼观察、显微镜下观察和化学分析等。肉眼观察、显微镜下观察和化学分析等。（4）标本采集中的防污染）标本采集中的防污染 标本采集最好标本采集最好采用一次性无菌器材，采集中要特别注意采用一次性无菌器材，采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发，表皮细胞、污染，防止混入操作者的头发，表皮细胞、痰液等。如使用玻璃器皿，必须经高压灭痰液等。如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的菌，以使可能存在的RNAase失活。失活。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法60（3）采样质量的评价可通过几个方面来评价标本采集质量，即细胞（5）采样及运输容器）采样及运输容器 标本的采集材料标本的采集材料应一次性使用，运输容器亦应为密闭的应一次性使用，运输容器亦应为密闭的一次性装置，采样所用的防腐剂，抗凝一次性装置，采样所用的防腐剂，抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，首先要抗凝，抗凝剂的选择很重标本，首先要抗凝，抗凝剂的选择很重要。一般应使用要。一般应使用EDTA和枸橼酸盐作为和枸橼酸盐作为抗凝剂，肝素因其对抗凝剂，肝素因其对PCR扩增有很强的扩增有很强的抑制作用。抑制作用。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法61（5）采样及运输容器 标本的采集材料应一次性使用，运输容器亦2、标本运送、标本运送 标本一经采集，应尽可能快的送标本一经采集，应尽可能快的送至检测实验室，实验室应根据待测靶核酸的至检测实验室，实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件作出相应特性，对各种临床标本的运送条件作出相应的规定。的规定。3、标本保存、标本保存 由于靶核酸（尤其是由于靶核酸（尤其是RNA）易）易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。为存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。为使临床样本中可能存在的核酸酶失活，可加使临床样本中可能存在的核酸酶失活，可加入入chao tropic物质，最常用的是物质，最常用的是4mol/L异硫异硫氰酸胍盐氰酸胍盐(Guanidinium isothiocyanae,GITC),并同时与还原剂如并同时与还原剂如巯基乙醇或二巯基乙醇巯基乙醇或二巯基乙醇一起使用。一起使用。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法622、标本运送 标本一经采集，应尽可能快的送至检测实验室，实验使用终浓度为使用终浓度为5mol/L的的GITC，可使，可使RNase不可逆地失活，加浓度不可逆地失活，加浓度4mol/L则失去对则失去对RNase的抑制作用，而使的抑制作用，而使RNA迅速降解。使用迅速降解。使用GITC作为稳定剂保存作为稳定剂保存标本，标本可在室温下稳定约标本，标本可在室温下稳定约7天。此天。此外，如测定的靶核酸为血循环中的外，如测定的靶核酸为血循环中的RNA，为避免室温放置过久而致，为避免室温放置过久而致RNA的降解，的降解，最好不要使用血清标本，而应使用最好不要使用血清标本，而应使用EDTA抗凝后尽快分离后的血浆标本。抗凝后尽快分离后的血浆标本。临床体液标本长期保存应在临床体液标本长期保存应在70以下。以下。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法63使用终浓度为5mol/L的GITC，可使RNase不可逆地失如为提取核酸后用于如为提取核酸后用于DNA扩增分析的扩增分析的标本，可于标本，可于10mmol/LTris,lmmol/LEDTA(pH7.58.0)缓冲液中缓冲液中4保存。用于保存。用于RNA扩增分扩增分析的标本，则应于上述缓冲液中析的标本，则应于上述缓冲液中80或液氮下保存。核酸的乙醇沉淀或液氮下保存。核酸的乙醇沉淀物则可于物则可于20下保存。下保存。临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法64如为提取核酸后用于DNA扩增分析的标本，可于10mmol/L