医学基因工程和其医学应用培训ppt课件

医学基因工程和其医学应用医学基因工程和其医学应用1基因重组基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段2医学基因工程和其医学应用基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子2重组重组DNA技术发展史技术发展史3医学基因工程和其医学应用重组DNA技术发展史3医学基因工程和其医学应用3pSC101EcoRIBoyer 和和Cohen的实验的实验Boyer 和和Cohen的实验的实验pRpR6-56-5大肠杆菌大肠杆菌4医学基因工程和其医学应用pSC101EcoRIBoyer 和Cohen的实验Boye4pSC101pRpR6-56-5抗四环素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉抗卡那霉素基因素基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子分子5医学基因工程和其医学应用pSC101pR6-5抗四环素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素5培养平皿四环素平板四环素平板卡那霉素基因卡那霉素基因四环素四环素 卡那霉素基因卡那霉素基因大肠杆菌大肠杆菌6医学基因工程和其医学应用培养平皿四环素平板卡那霉素基因四环素卡那霉素基因大肠杆菌667医学基因工程和其医学应用第一节 基因工程概念7医学基因工程和其医学应用7克隆克隆 来自同一始祖的相同拷贝的集合。（一）（一）DNADNA克隆克隆分子克隆分子克隆细胞克隆细胞克隆动物克隆动物克隆8医学基因工程和其医学应用克隆 来自同一始祖的相同拷贝的集合。（一）DNA克隆分子8DNADNA克隆克隆 应用酶学方法，在体外将某些遗传物质的DNA与载体DNA结合，形成一种具有自我复制能力的DNA分子，转化至宿主细胞中，进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。9医学基因工程和其医学应用DNA克隆9医学基因工程和其医学应用9DNA克隆克隆目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取提取提取DNADNA分子分子分子分子10医学基因工程和其医学应用DNA克隆目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子110生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。（二）基因工程（二）基因工程11医学基因工程和其医学应用生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目11 SSSS基因基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表SS12医学基因工程和其医学应用 SS基因基因载体重组体分切接转筛表SS12医学基因工程和其12 按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。某功能蛋白某功能蛋白宿主细胞宿主细胞重组体重组体目的基因目的基因目的基因目的基因13医学基因工程和其医学应用 按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。某功能蛋白宿13第第 二二 节节自然界的基因自然界的基因重组重组 DNA Recombination14医学基因工程和其医学应用第 二 节自然界的基因重组 DNA Reco14一、接合作用一、接合作用当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细细菌菌）的的DNA转移称为转移称为接合作用接合作用(conjugation)。15医学基因工程和其医学应用一、接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DN15可接合质粒如可接合质粒如可接合质粒如可接合质粒如 F F 因子因子因子因子(F factor)(F factor)质粒质粒质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNADNA分子分子分子分子16医学基因工程和其医学应用可接合质粒如 F 因子(F factor)质粒 细菌16二、转化作用二、转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的 遗遗 传传 表表 型型，称称 为为 转转 化化 作作 用用 (transformation)。17医学基因工程和其医学应用二、转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养17例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNADNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。18医学基因工程和其医学应用例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。18医学基因工程1819医学基因工程和其医学应用19医学基因工程和其医学应用19三、转导作用三、转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（供供体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及及基基因因重重组组即即为为转转导导作作用用(transduction)。20医学基因工程和其医学应用三、转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另20噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)例例目目 录录21医学基因工程和其医学应用噬菌体的生活史溶菌生长途径例目 录21医学基因工程和其医学21目目 录录22医学基因工程和其医学应用目 录22医学基因工程和其医学应用22发发发发生生生生在在在在同同同同源源源源序序序序列列列列间间间间的的的的重重重重组组组组称称称称为为为为同同同同源源源源重重重重组组组组(homologous(homologous recombination)recombination)，又又又又称称称称基基基基本本本本重重重重组组组组。是是是是最最最最基基基基本本本本的的的的DNADNA重重重重组组组组方方方方式式式式，通通通通过过过过链链链链的的的的断断断断裂裂裂裂和和和和再再再再连连连连接接接接，在在在在两两两两个个个个DNADNA分分分分子子子子同同同同源源源源序序序序列列列列间间间间进进进进行行行行单单单单链或双链片段的交换。链或双链片段的交换。链或双链片段的交换。链或双链片段的交换。（一）同源重组（一）同源重组四、基因重组四、基因重组23医学基因工程和其医学应用发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous r23（二）位点特异重组（二）位点特异重组位位位位点点点点特特特特异异异异重重重重组组组组(site-specific(site-specific recombination)recombination)是是是是由由由由整整整整合合合合酶酶酶酶催催催催化化化化，在在在在两两两两个个个个DNADNA序序序序列列列列的的的的特特特特异异异异位位位位点点点点间间间间发发发发生的整合。生的整合。生的整合。生的整合。24医学基因工程和其医学应用（二）位点特异重组24医学基因工程和其医学应用24例例 噬菌体噬菌体DNA的整合的整合 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的整整整整合合合合酶酶酶酶识识识识别别别别噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体和和和和宿宿宿宿主主主主染染染染色色色色体体体体的的的的特特特特异异异异靶靶靶靶位位位位点点点点发发发发生生生生选选选选择择择择性性性性整整整整合合合合；反反反反转转转转录录录录病病病病毒毒毒毒整整整整合合合合酶酶酶酶可可可可特特特特异异异异地地地地识识识识别别别别、整整整整合合合合反反反反转转转转录录录录病病病病毒毒毒毒cDNAcDNA的的的的 长长长长 末末末末 端端端端 重重重重 复复复复 序序序序 列列列列(long(long terminal terminal repeat,LTR)repeat,LTR)。25医学基因工程和其医学应用例 噬菌体DNA的整合25医学基因工程和其医学应用25（三）转座重组（三）转座重组由由由由插插插插入入入入序序序序列列列列和和和和转转转转座座座座子子子子介介介介导导导导的的的的基基基基因因因因移移移移位位位位或或或或重排称为重排称为重排称为重排称为转座转座转座转座(transposition)(transposition)。26医学基因工程和其医学应用（三）转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座26第第 三三 节节 基因工程的核心技术基因工程的核心技术27医学基因工程和其医学应用第 三 节 基因工程的核心技术27医学基因工程和其医学27一、重要的技术工具一、重要的技术工具n n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n n DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 n n 逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶n n T4DNAT4DNA连接酶连接酶连接酶连接酶n n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶n n 末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶n n TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶28医学基因工程和其医学应用一、重要的技术工具 限制性核酸内切酶28医学基因工程和其医学28重组重组重组重组DNADNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工工工 具具具具 酶酶酶酶功功功功 能能能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶催化催化催化催化DNADNA中相邻的中相邻的中相邻的中相邻的55磷酸基和磷酸基和磷酸基和磷酸基和33羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使酯键，使酯键，使DNADNA切口封合或使两个切口封合或使两个切口封合或使两个切口封合或使两个DNADNA分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 合成双链合成双链合成双链合成双链cDNAcDNA分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析填补填补填补填补33末端末端末端末端KlenowKlenow片段片段片段片段又名又名又名又名DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I大片段，具有完整大片段，具有完整大片段，具有完整大片段，具有完整DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I的的的的5 53 3 聚合、聚合、聚合、聚合、3 35 5 外切活性，而无外切活性，而无外切活性，而无外切活性，而无5 53 3 外切活外切活外切活外切活性。常用于性。常用于性。常用于性。常用于cDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3DNA 3 末端标记等末端标记等末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶合成合成合成合成cDNAcDNA替代替代替代替代DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I进行填补，标记或进行填补，标记或进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸55羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶在在在在33羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基29医学基因工程和其医学应用重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 29限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义定义定义限限限限制制制制性性性性核核核核酸酸酸酸内内内内切切切切酶酶酶酶(restriction(restriction endonuclease,endonuclease,RE)RE)是是是是识识识识别别别别DNADNA的的的的特特特特异异异异序序序序列列列列,并并并并在在在在识识识识别别别别位位位位点点点点或或或或其其其其周周周周围切割双链围切割双链围切割双链围切割双链DNADNA的一类内切酶。的一类内切酶。的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G G+Bam Bam HH30医学基因工程和其医学应用限制性核酸内切酶定义GGATCCGGATCC+Bam H330作用作用作用作用与与与与甲甲甲甲基基基基化化化化酶酶酶酶共共共共同同同同构构构构成成成成细细细细菌菌菌菌的的的的限限限限制制制制修修修修饰系统，限制外源饰系统，限制外源饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNADNA，保护自身保护自身保护自身保护自身DNADNA。分类分类分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）型）型）31医学基因工程和其医学应用作用分类31医学基因工程和其医学应用31第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名命名命名Hin d 属属属属 系系系系 株株株株 序序序序HHaemophilus aemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株的第三种酶株的第三种酶株的第三种酶株的第三种酶32医学基因工程和其医学应用第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名Hin d 32类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGATCCCCTAGG33医学基因工程和其医学应用类酶识别序列特点 回文结构(palindrome)33Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口34医学基因工程和其医学应用Bam HGTCGGATCC+GGATCCHindGTC34同功异源酶同功异源酶来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst35医学基因工程和其医学应用同功异源酶GGATCCGGATCC+Bam HGGATCC35同尾酶同尾酶有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A36医学基因工程和其医学应用同尾酶Bam HBg l GGATCC AGATCTG 36（二）基因载体（二）基因载体定义定义定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分分分分子。子。子。子。常用载体常用载体常用载体常用载体质粒质粒质粒质粒DNADNA噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA病毒病毒病毒病毒DNADNA37医学基因工程和其医学应用（二）基因载体定义常用载体37医学基因工程和其医学应用37克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为为为为使使使使插插插插入入入入的的的的外外外外源源源源DNADNA序序序序列列列列被被被被扩扩扩扩增增增增而而而而特特特特意意意意设计的载体称为设计的载体称为设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体。表达载体表达载体表达载体表达载体(expression vector)(expression vector)为为为为使使使使插插插插入入入入的的的的外外外外源源源源DNADNA序序序序列列列列可可可可转转转转录录录录翻翻翻翻译译译译成成成成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体表达载体表达载体。38医学基因工程和其医学应用克隆载体(cloning vector)38医学基因工程和其38载体的选择标准载体的选择标准载体的选择标准载体的选择标准n n能自主复制；能自主复制；能自主复制；能自主复制；n n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；n n有克隆位点（外源有克隆位点（外源有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入点），常具有插入点），常具有插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；n n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。39医学基因工程和其医学应用载体的选择标准能自主复制；39医学基因工程和其医学应用391.1.质粒质粒(plasmid)特点特点特点特点 能能能能在在在在宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞内内内内独独独独立立立立自自自自主主主主复复复复制制制制；带带带带有有有有某某某某些些些些遗遗遗遗传传传传信信信信息息息息,会会会会赋赋赋赋予予予予宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞一一一一些些些些遗遗遗遗传传传传性状。性状。性状。性状。40医学基因工程和其医学应用1.质粒(plasmid)特点40医学基因工程和其医学应40目目 录录41医学基因工程和其医学应用目 录41医学基因工程和其医学应用4142医学基因工程和其医学应用42医学基因工程和其医学应用42 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统改造系统改造系统 gtgt系列（插入型，适用系列（插入型，适用系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNAcDNA克隆）克隆）克隆）克隆）EMBLEMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phage)M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA改造系统（含改造系统（含改造系统（含改造系统（含lacZlacZ基因）基因）基因）基因）M13mpM13mp系列系列系列系列pUCpUC系列系列系列系列43医学基因工程和其医学应用噬菌体DNA改造系统 2.噬菌体(phage)M13噬433.粘性质粒粘性质粒(cosmid)44医学基因工程和其医学应用3.粘性质粒(cosmid)44医学基因工程和其医学应用44酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他45医学基因工程和其医学应用酵母人工染色体其他45医学基因工程和其医学应用45（一）核酸探针与分子杂交（一）核酸探针与分子杂交二、常用技术的原理和用途二、常用技术的原理和用途核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)(nucleic acid hybridization)在在在在DNADNA复复复复性性性性过过过过程程程程中中中中，如如如如果果果果把把把把不不不不同同同同DNADNA单单单单链链链链分分分分子子子子放放放放在在在在同同同同一一一一溶溶溶溶液液液液中中中中，或或或或把把把把DNADNA与与与与RNARNA放放放放在在在在一一一一起起起起，只只只只要要要要在在在在DNADNA或或或或RNARNA的的的的单单单单链链链链分分分分子子子子之之之之间间间间有有有有一一一一定定定定的的的的碱碱碱碱基基基基配配配配对对对对关关关关系系系系，就就就就可可可可以以以以在在在在不不不不同同同同的的的的分分分分子子子子之之之之间间间间形形形形成成成成杂杂杂杂化化化化双双双双链链链链(heteroduplexheteroduplex)。46医学基因工程和其医学应用（一）核酸探针与分子杂交二、常用技术的原理和用途核酸分子杂交46复性复性RNADNA47医学基因工程和其医学应用复性RNADNA47医学基因工程和其医学应用47探针技术探针技术 探针探针探针探针 (probe)(probe)一一一一小小小小段段段段用用用用同同同同位位位位素素素素、生生生生物物物物素素素素或或或或荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料标标标标标标标标记记记记其其其其末末末末端端端端或或或或全全全全链链链链的的的的已已已已知知知知序序序序列列列列的的的的多多多多聚聚聚聚核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸，与与与与固固固固定定定定在在在在NCNC膜膜膜膜上上上上的的的的核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸结结结结合合合合，判判判判断断断断是是是是否否否否有同源的核酸分子存在。有同源的核酸分子存在。有同源的核酸分子存在。有同源的核酸分子存在。48医学基因工程和其医学应用探针技术 探针(probe)48医学基因工程和其医学应48 DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。49医学基因工程和其医学应用 DNA印迹技术(Southern blotting)49 其他其他斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)50医学基因工程和其医学应用 其他50医学基因工程和其医学应用50三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较51医学基因工程和其医学应用三种印迹技术的比较51医学基因工程和其医学应用51DNA点阵点阵52医学基因工程和其医学应用DNA点阵52医学基因工程和其医学应用525 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5（二）聚（二）聚 合合 酶酶 链链 反反 应应53医学基因工程和其医学应用5Primer 15Primer 2Cycle 2Cyc53Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。54医学基因工程和其医学应用Cycle 355 555 5 555 554n n模板模板DNAn n 特异性引物特异性引物n n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n n dNTPsn n Mg2+PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分55医学基因工程和其医学应用模板DNAPCR体系基本组成成分55医学基因工程和其医学应用55PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C56医学基因工程和其医学应用PCR的基本反应步骤变性延伸退火56医学基因工程和其医学应用561 目的基因的克隆目的基因的克隆2 基因的体外突变基因的体外突变3 DNA和和RNA的微量分析的微量分析4 DNA序列测定序列测定5 基因突变分析基因突变分析PCR的主要用途的主要用途57医学基因工程和其医学应用1 目的基因的克隆PCR的主要用途57医学基因工程和其医学应57三、重组三、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取DNADNA导入受体菌导入受体菌导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达克隆基因的表达克隆基因的表达 58医学基因工程和其医学应用三、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受58 以以以以 质质质质 粒粒粒粒 为为为为 载载载载 体体体体 的的的的DNADNA 克克克克 隆隆隆隆 过过过过 程程程程59医学基因工程和其医学应用 以59医学基因工程和其医学应用59（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.1.化学合成法化学合成法化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列氨基酸序列氨基酸序列 。2.2.基因组基因组基因组基因组DNADNA文库文库文库文库(genomic DNA library)(genomic DNA library)3.cDNA3.cDNA文库文库文库文库(cDNA library)(cDNA library)4.4.聚合酶链反应聚合酶链反应聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)(polymerase chain reaction,PCR)（见第（见第（见第（见第2222章）章）章）章）60医学基因工程和其医学应用（一）目的基因的获取1.化学合成法60医学基因工程和其医学60*化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNADNA序列序列序列序列61医学基因工程和其医学应用*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序61组织或细胞染色体组织或细胞染色体组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断基因片断基因片断克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体重组重组重组重组DNADNA分子分子分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌受体菌受体菌基因组基因组基因组基因组DNADNA文库文库文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组有基因组有基因组DNADNA的集合的集合的集合的集合*从基因组从基因组从基因组从基因组DNADNA文文文文库获取目的基因库获取目的基因库获取目的基因库获取目的基因62医学基因工程和其医学应用组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分62mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制*从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T63医学基因工程和其医学应用mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 63（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：方式：方式：(1)(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建64医学基因工程和其医学应用（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接（二）克隆载体的64Bam Bam HH切割反应切割反应切割反应切割反应 GGATCCGGATCC CCTAGG CCTAGGT4T4 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶1515CCGATCCGATCC G GG GCCTAGCCTAG+目的基因用目的基因用目的基因用目的基因用 Bam Bam HH切割切割切割切割载体载体载体载体DNADNA用用用用Bam Bam HH切割切割切割切割重组体重组体重组体重组体载体自连载体自连载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接65医学基因工程和其医学应用Bam H切割反应 GGATCCT4 DNA连接酶GATC652.平端连接平端连接适用于：适用于：适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端66医学基因工程和其医学应用2.平端连接66医学基因工程和其医学应用66目的基因目的基因目的基因目的基因载体载体载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶连接酶连接酶1515CC重组体重组体重组体重组体载体自连载体自连载体自连载体自连目的基因目的基因目的基因目的基因 自连自连自连自连67医学基因工程和其医学应用目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶重组体673.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)(terminal transferase)的的的的作用下，在作用下，在作用下，在作用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。68医学基因工程和其医学应用3.同聚物加尾连接68医学基因工程和其医学应用6855333355载体载体载体载体DNADNA55333355目的基因目的基因目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶限制酶限制酶 5 533 3 355 5 5 3 3 T(T)T(T)n nT T T(T)T(T)n nT T 3 355 5 5 33 3 355 5 5 3 3 A(A)A(A)n nA A A(A)A(A)n nA A 3 355-核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶+dATPdATP末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶+dTTPdTTPT(T)T(T)n nT TA(A)A(A)n nA AA(A)A(A)n nA A T(T)T(T)n nT TT4T4 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶1515CC重组体重组体重组体重组体69医学基因工程和其医学应用53载体DNA53目的基因限制酶或机械剪切限制酶 694.4.人工接头人工接头(linker)(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。70医学基因工程和其医学应用4.人工接头(linker)连接70医学基因工程和其医学应70人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R71医学基因工程和其医学应用人工接头及其应用CCGAATTCG 5-Eco REco71受体菌条件受体菌条件受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态处于感受态处于感受态(competent)(competent)导入方式导入方式导入方式导入方式转化转化转化转化 (transformation)(transformation)转染转染转染转染 (transfection)(transfection)感染感染感染感染 (infection)(infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌72医学基因工程和其医学应用受体菌条件导入方式（四）重组DNA导入受体菌72医学基因工程72（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1.直接选择法直接选择法(1)(1)抗药性标记选择抗药性标记选择抗药性标记选择抗药性标记选择(2)(2)标志补救标志补救标志补救标志补救(marker rescue)(marker rescue)(3)(3)分子杂交法分子杂交法分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交SouthernSouthern印迹印迹印迹印迹 2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等73医学基因工程和其医学应用（五）重组体的筛选73医学基因工程和其医学应用73医学基因工程和其医学应用培训ppt课件74原原原原位位位位杂杂杂杂交交交交75医学基因工程和其医学应用原位杂交75医学基因工程和其医学应用75Southern印迹印迹目目 录录76医学基因工程和其医学应用Southern印迹目 录76医学基因工程和其医学应用76重组重组重组重组DNADNADNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分分分离目的基因分离目的基因分离目的基因分离目的基因 切切切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接接接拼接重组体拼接重组体拼接重组体拼接重组体 转转转转转入受体菌转入受体菌转入受体菌转入受体菌 筛筛筛筛筛选重组体筛选重组体筛选重组体筛选重组体 77医学基因工程和其医学应用重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结分分离目的基77重组重组重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体载体载体质粒质粒质粒质粒噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体病毒病毒病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组基因组基因组DNADNA cDNA cDNA人工合成人工合成人工合成人工合成PCRPCR产物产物产物产物限制酶消化限制酶消化限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体开环载体开环载体DNADNA目的基因目的基因目的基因目的基因连接酶连接酶连接酶连接酶重组体重组体重组体重组体转化转化转化转化体外包装，转染体外包装，转染体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选筛选筛选表型筛选表型筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交菌落原位杂交菌落原位杂交78医学基因工程和其医学应用重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源78表达体系的建立表达体系的建立表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达79医学基因工程和其医学应用表达体系的建立（六）克隆基因的表达79医学基因工程和其医学应791.1.原核表达体系原核表达体系原核表达体系原核表达体系 （E.coliE.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：标准：标准：选择标志选择标志选择标志选择标志强启动子强启动子强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点多接头克隆位点多接头克隆位点E.coliE.coli表达体系的不足表达体系的不足表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNADNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion(inclusion body)body)很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白80医学基因工程和其医学应用1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）80医学80优点：优点：优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的可表达克隆的可表达克隆的cDNAcDNA及真核基因组及真核基因组及真核基因组及真核基因组DNADNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染磷酸钙转染磷酸钙转染DEAEDEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射显微注射显微注射 2.2.真核表达体系真核表达体系真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞81医学基因工程和其医学应用优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA转染 将表81 第四节第四节基因工程在医学中的应用基因工程在医学中的应用82医学基因工程和其医学应用 第四节82医学基因工程和其医学82（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。（二）生（二）生物制药物制药83医学基因工程和其医学应用（一）疾病基因的发现与克隆（二）生物制药83医学基因工程和其83 重组重组重组重组DNADNA医药产品医药产品医药产品医药产品产产产产 品品品品功功功功 能能能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝抗凝抗凝血液因子血液因子血液因子血液因子VIIIVIII促进凝血促进凝血促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子生长因子生长因子(bFGF,EGF)(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素干扰素干扰素(1b,1b,2a,2a,2b,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,(CHO,酵母酵母酵母酵母)预防乙肝预防乙肝预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组口服重组口服重组B B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱预防霍乱预防霍乱84医学基因工程和其医学应用 重组DNA医药产品产 品功 能组织胞浆素原激84基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断(genetic(genetic diagnosis)diagnosis)是是利利利利用用用用分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学及及及及分分分分子子子子遗遗遗遗传传传传的的的的技技技技术术术术和和和和原原原原理理理理，在在在在DNADNA水水水水平平平平分分分分析析析析、鉴鉴鉴鉴定定定定遗遗遗遗传传传传疾疾疾疾病病病病所所所所涉涉涉涉及及及及基基基基因因因因的的的的置置置置换换换换、缺缺缺缺失失失失或插入等突变。或插入等突变。或插入等突变。或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定区分或鉴定区分或鉴定DNADNA的异常的异常的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNADNA片断片断片断片断85医学基因工程和其医学应用基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物85标准标准标准标准.能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNADNA的鉴定的鉴定的鉴定的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。大人群普查。大人群普查。86医学基因工程和其医学应用标准86医学基因工程和其医学应用86（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义定义定义基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗(gene therapy)(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)(germ line gene therapy)87医学基因工程和其医学应用（四）基因治疗定义方式87医学基因工程和其医学应用871.1.产前诊断产前诊断产前诊断产前诊断2.2.携带者测试携带者测试携带者测试携带者测试3.3.症候前诊断症候前诊断症候前诊断症候前诊断4.4.遗传病易感性遗传病易感性遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防88医学基因工程和其医学应用1.产前诊断（五）遗传疾病的预防88医学基因工程和其医学应88