医学可见紫外分光光度法ppt课件

可见紫外分光光度法可见紫外分光光度法Vis-UV SpectrophotometryChapter 11 可见紫外分光光度法Vis-UV Spectrophoto第一节第一节 物质的吸收光谱物质的吸收光谱第二节第二节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法第四节第四节 提高测量灵敏度和准提高测量灵敏度和准 确度的方法确度的方法第一节 物质的吸收光谱1.掌握分光光度法基本原理掌握分光光度法基本原理Lambert-Beer 定律，能熟练运用定律，能熟练运用Lambert-Beer公式进行公式进行 有关计算。有关计算。2.掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸 光系数的概念。光系数的概念。3.熟悉标准曲线法及标准对照法。熟悉标准曲线法及标准对照法。4.了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。5.了解分光光度计的基本构造；提高测量灵了解分光光度计的基本构造；提高测量灵 敏度和准确度的方法。敏度和准确度的方法。本章教学要求本章教学要求1.掌握分光光度法基本原理Lambert-Beer本章教 分析方法的分类分析方法的分类 按方法的原理：可分为化学分析和仪器分析按方法的原理：可分为化学分析和仪器分析。化学分析：化学分析：凡主要利用化学原理进行分析的方凡主要利用化学原理进行分析的方法称为化学分析法；法称为化学分析法；仪器分析：仪器分析：主要利用物理学原理进行分析的方主要利用物理学原理进行分析的方法则称为仪器分析法。法则称为仪器分析法。如：光谱分析法如：光谱分析法，色谱分析法，色谱分析法，质谱分析，质谱分析（MS）法法，电化学分析法，电化学分析法，核磁共振（，核磁共振（NMR）分析法等。分析法等。光谱分析法：光谱分析法：常用的有可见、紫外分光光度法常用的有可见、紫外分光光度法（UV）、）、红外分光光度法（红外分光光度法（IR）、）、荧光光度法、荧光光度法、分析方法的分类 原子吸收法和原子吸收法和X射线原子荧光法等射线原子荧光法等。UV主要用于药物制剂的含量测定。主要用于药物制剂的含量测定。激光诱导荧光光谱的灵敏度已达激光诱导荧光光谱的灵敏度已达10-22克，达到克，达到了检测单个分子的水平，了检测单个分子的水平，可用于癌症的早期诊断。可用于癌症的早期诊断。分光光度法（吸光光度法）：分光光度法（吸光光度法）：根据物质的根据物质的吸收光谱吸收光谱和和光的吸收定律光的吸收定律，对物质，对物质进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。或者说它是基于被测物质的分子对光具有选择或者说它是基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。吸收的特性而建立的分析方法。原子吸收法和X射线原子荧光法等。分光光度法（吸光光度 分光光度法的特点：分光光度法的特点：灵敏度高灵敏度高-10-5 molL-1 10-6 molL-1 相对误差小相对误差小-2%5%应用广泛应用广泛-医药、卫生、环保、化工等领域。医药、卫生、环保、化工等领域。根据测定时所选用的光源根据测定时所选用的光源 紫外分光光度法紫外分光光度法可见分光光度法可见分光光度法红外分光光度法红外分光光度法 分光光度法的特点：根据测定时所选用的光源 紫外分光光第一节第一节 物质的吸收光谱物质的吸收光谱一一.物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收二二.物质的吸收光谱物质的吸收光谱第一节 物质的吸收光谱一.物质对光的选择性吸收二.物质 =c 光是以电磁波形式传播的光子流。电磁波能量大光是以电磁波形式传播的光子流。电磁波能量大小与波长和频率有关。小与波长和频率有关。辐射是量子化的，即不连续地、一份一份地发射辐射是量子化的，即不连续地、一份一份地发射或吸收，每一份称一个光子。或吸收，每一份称一个光子。光子的能量与辐射频率成正比、与波长成反比：光子的能量与辐射频率成正比、与波长成反比：E=h=hc 一、物质对光的选择性吸收一、物质对光的选择性吸收 =c 光是以电磁波形式传播的光子流。电磁波能量单色光单色光:单一波长的光束单一波长的光束复色光复色光:含有多种波长的光束含有多种波长的光束电磁波谱电磁波谱:以波长大小顺序排列的电磁波谱图以波长大小顺序排列的电磁波谱图波长波长 10pm 300pm 200nm 400nm 800nm 500m mm 1cm 1m光谱光谱 射线射线 X射线射线 紫外光紫外光 可见光可见光 红外光红外光 微波微波 无线电波无线电波方法方法 光谱法光谱法 分光光度法分光光度法 光谱法光谱法 核磁共振核磁共振 可可 见见 光光380nm 780nm单色光:单一波长的光束波长 10pm 3能能量量 E基态基态E0第一激发态第一激发态E1第二激发态第二激发态E2第三激发态第三激发态E3吸收吸收光谱光谱发射发射光谱光谱 E=h 当一束光照射到某当一束光照射到某物质或某溶液时，该物物质或某溶液时，该物质的分子、原子或离子质的分子、原子或离子与光子作用，光子的能与光子作用，光子的能量发生转移，物质中的量发生转移，物质中的这些粒子就会发生能级这些粒子就会发生能级跃迁，从较低能量状态跃迁，从较低能量状态（基态）跃迁到较高能（基态）跃迁到较高能量状态（激发态）：这量状态（激发态）：这一过程称为一过程称为物质对光的物质对光的吸收。吸收。能基态E0第一激发态E1第二激发态E2第三激发态E3吸收光谱 由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不连续的，连续的，只有光子的能量只有光子的能量(h)与被照射物质粒子的与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差基态和激发态能量之差(E)相等时，才能被吸收。相等时，才能被吸收。不同的物质，其内部结构不同，基态和激发态不同的物质，其内部结构不同，基态和激发态的能量差的能量差E不同，选择吸收光子的能量也不同，即不同，选择吸收光子的能量也不同，即吸收的波长吸收的波长(频率频率)亦不同。亦即亦不同。亦即不同物质只能选择不同物质只能选择性地吸收某一波长的光。性地吸收某一波长的光。由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不连续光的互补光的互补紫紫400红红660橙橙600黄黄560绿绿530蓝绿蓝绿500绿蓝绿蓝450蓝蓝420 光的互补：光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定的若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色的光。互补色的光。光的互补紫红橙黄绿蓝绿绿蓝蓝 光的互补：若两种物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现 溶液的颜色：溶液的颜色：是由于它选择性地吸收了一部分是由于它选择性地吸收了一部分光，而呈现它的补色。光，而呈现它的补色。例如：三例如：三(邻二氮菲邻二氮菲)合铁配合物溶液吸收了合铁配合物溶液吸收了 508 nm处的光，而呈现紫红色。处的光，而呈现紫红色。溶液的颜色：是由于它选择性地吸收了一部分光，将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射光，测定这一溶液吸光度光，测定这一溶液吸光度A。每种波长的单色光都每种波长的单色光都有其相对应的吸光度。然后以有其相对应的吸光度。然后以A为纵坐标，波长为纵坐标，波长 为为 吸收光谱中与吸收吸收光谱中与吸收峰相对应的波长称为峰相对应的波长称为最最大吸收波长，大吸收波长，max max=515 A480 520 560nm 二、物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱横坐标作图，所得曲线横坐标作图，所得曲线即为该溶液的即为该溶液的吸收光谱吸收光谱。将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射光，吸收光谱说明，一种物质对不同波长的光的吸吸收光谱说明，一种物质对不同波长的光的吸收程度是不同的收程度是不同的 如如P278 图图13-2，是是三三（邻邻二二氮氮菲菲）合合铁铁配配合合物物的的吸吸收收光光谱谱。表表明明一一种种物物质质的的不不同同浓浓度度的的溶溶液液，吸吸收收光光谱谱的的形形状状基基本本相相同同，最大吸收波长也一样最大吸收波长也一样 吸收光谱体现了物质的特性：吸收光谱体现了物质的特性：吸收曲线的形状和吸收曲线的形状和 max 是定性分析的基础是定性分析的基础 溶液的浓度愈大吸光度愈大溶液的浓度愈大吸光度愈大 是定量分析的基础是定量分析的基础 吸收光谱说明，一种物质对不同波长的光的吸收程第二节第二节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一一.透光率和吸光度透光率和吸光度二二.Lambert-Beer 定律定律第二节 分光光度法基本原理一.透光率和吸光度二.Lam一、透光率和吸光度一、透光率和吸光度I0 =Ia+It+Ir透射光的强度透射光的强度 It与入射光的强度与入射光的强度I0的比值称为的比值称为透光率透光率I0It 实验中，被测溶液和参比溶液分别置于同样质实验中，被测溶液和参比溶液分别置于同样质地和厚度的比色皿中，反射光强度大小近似可相互地和厚度的比色皿中，反射光强度大小近似可相互抵消抵消(以参比溶液校正以参比溶液校正)，则上式简化为则上式简化为 I0 =Ia+It 透光率愈大，溶液对光的吸收愈少透光率愈大，溶液对光的吸收愈少IrIa一、透光率和吸光度I0 =Ia+It+Ir透射光 溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还与入射溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还与入射光波长、溶液浓度、液层厚度及温度等因素有关。光波长、溶液浓度、液层厚度及温度等因素有关。透光率的负对数称为透光率的负对数称为 吸光度吸光度 A(absorbance)吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多二、二、Lambert-Beer 定律定律 溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还与入射光 1760年，年，Lambert从实验中找到了从实验中找到了A与液层厚度的与液层厚度的关系式：关系式：A=k1b k1为与被测物性质、入射光波长、溶剂、溶液浓为与被测物性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度和温度有关的常数度和温度有关的常数 当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、浓度和当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、浓度和溶液的温度都一定时，该溶液的吸光度只与液层厚溶液的温度都一定时，该溶液的吸光度只与液层厚度成正比度成正比 1852年，年，Beer从实验中找到了从实验中找到了A与溶液浓度的关与溶液浓度的关系式：系式：A=k2 c k2为与被测物性质、入射光波长、溶剂、液层为与被测物性质、入射光波长、溶剂、液层厚度和温度有关的常数厚度和温度有关的常数 当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、液层厚当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、液层厚度和溶液的温度都一定时，该溶液的吸光度只与溶度和溶液的温度都一定时，该溶液的吸光度只与溶液浓度成正比液浓度成正比 1760年，Lambert从实验中找到了A与 合并这两个式子，得到合并这两个式子，得到单位单位b 液层厚度：液层厚度：cmc 物质的量浓度：物质的量浓度：mol L-1 摩尔吸光系数：摩尔吸光系数：L mol-1 cm-1Lambert-Beer Low吸光度吸光度=吸光系数吸光系数 介质厚度介质厚度 浓度浓度A=a b 若浓度的单位改为质量浓度，则若浓度的单位改为质量浓度，则单位单位b 液层厚度：液层厚度：cm 质量浓度：质量浓度：g L-1a 质量吸光系数：质量吸光系数：L g-1 cm-1A=b c 合并这两个式子，得到单位b 液层厚度：cmL所以，所以，a 和和 的换算关系为：的换算关系为：=a MT 和和 c（b）的关系为：的关系为：T=10-bc 解：（解：（1）A=a b 0.22=a 2 140 10-6 a=785.7(L g-1 cm-1)（2）=a M=785.7 112.4 =8.83 104（Lmol-1 cm-1）（3）A=-lgT=0.22 lgT=-0.22，T=10-0.22=0.60=60%例例13-1 Cd2+浓度为浓度为140 g L-1，双硫腙法显双硫腙法显色测定波长为色测定波长为520nm，液层厚度液层厚度2cm，吸光度为吸光度为0.22，求，求a、和和T所以，a 和 的换算关系为：=a MT 例例13-2 一有色溶液的浓度为一有色溶液的浓度为c，透光率为透光率为T。求浓度为原来的求浓度为原来的1/2时，透光率为多少？时，透光率为多少？解：解：T=10-bc c T 例例13-3 有色溶液的液层厚度增加一倍后，透有色溶液的液层厚度增加一倍后，透光率和吸光度的改变为多少？光率和吸光度的改变为多少？解：解：T=10-bc b T A 1/2cT 1/2T2 2A2bA=b c 例13-2 一有色溶液的浓度为c，透第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法一一.分光光度计分光光度计二二.测定方法测定方法第三节 可见分光光度法一.分光光度计二.测定方法一、分光光度计一、分光光度计一、分光光度计分光光度计四大系统分光光度计四大系统光源系统光源系统检测器检测器吸收池吸收池分光系统分光系统数据处理器数据处理器分光光度计四大系统光源系统检测器吸收池分光系统数据处理器 1.光源系统光源系统：提供波长范围为提供波长范围为3601000nm的连续光谱。的连续光谱。可见光光源为钨灯，要求强度高，可见光光源为钨灯，要求强度高，稳定性好。稳定性好。2.分光系统分光系统：提供所需波长的单色光。：提供所需波长的单色光。单色单色器由狭缝、光栅和准直镜组成，要求适当宽度的器由狭缝、光栅和准直镜组成，要求适当宽度的狭缝，以保证单色光光强和纯度。狭缝，以保证单色光光强和纯度。3.吸收池吸收池：用来盛放溶液的容器：用来盛放溶液的容器。可见光区。可见光区用光学玻璃，要求光洁、透明、相互匹配。用光学玻璃，要求光洁、透明、相互匹配。4.检测系统检测系统：进行光电转换、信号放大及输：进行光电转换、信号放大及输出。出。由光电管、放大器、指示器、数字显示器和由光电管、放大器、指示器、数字显示器和打印器等装置构成打印器等装置构成 1.光源系统：提供波长范围为3 二、测定方法二、测定方法 可见可见-紫外分光光度法主要用于定量分析。紫外分光光度法主要用于定量分析。（一）（一）标准曲线法标准曲线法根据根据 Lambert-Beer Law，以该物质吸收光谱图中的以该物质吸收光谱图中的 max为入射光，测定被为入射光，测定被测物质标准品配制的一系列浓度溶液的测物质标准品配制的一系列浓度溶液的A。以以A为纵为纵坐标，以溶液浓度为横坐标，可得一条通过坐标原坐标，以溶液浓度为横坐标，可得一条通过坐标原点的直线。然后，在相同的实验条件下测定被测液点的直线。然后，在相同的实验条件下测定被测液的的A，在标准曲线上查出被测液的浓度。在标准曲线上查出被测液的浓度。c（mg/L）A=550nm 40 80 120 2000.60.40.20.0 二、测定方法 （一）标准曲 为消除溶剂或其他有色物质对入射光的吸收，为消除溶剂或其他有色物质对入射光的吸收，消除光在溶液中的散射和比色皿对光的反射等的因消除光在溶液中的散射和比色皿对光的反射等的因素的影响，必须采用空白溶液作对照。素的影响，必须采用空白溶液作对照。测定时，首先将空白溶液置于光路，调节仪器测定时，首先将空白溶液置于光路，调节仪器的的“Zero”键，使键，使A=0或或T=100%，然后开始测定然后开始测定标准溶液或被测液的标准溶液或被测液的A。1.溶剂空白溶剂空白除被测物以外，其他溶除被测物以外，其他溶 剂均为无色时，可用溶剂作空白溶液。剂均为无色时，可用溶剂作空白溶液。2.试剂空白试剂空白显色剂有色时，按显色显色剂有色时，按显色 条件加入各种试剂和溶剂，只是不含条件加入各种试剂和溶剂，只是不含 有被测物的标准品。有被测物的标准品。空白溶液空白溶液 为消除溶剂或其他有色物质对入射光的吸收，消除 （二）标准对照法二）标准对照法根据根据 Lambert-Beer Law，以该物质吸收光谱图中的以该物质吸收光谱图中的 max为入射光，首先配制为入射光，首先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cS，测其测其AS，再再将样品溶液推入光路，测其将样品溶液推入光路，测其AX，则试样溶液的浓度则试样溶液的浓度cX为：为：此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。曲线法。（二）标准对照法根据 Lambert-B第四节第四节 提高测量灵敏度和准提高测量灵敏度和准确度的方法确度的方法一、分光光度法的误差一、分光光度法的误差二、选择适当的显色剂二、选择适当的显色剂三、选择合适的测定条件三、选择合适的测定条件四、共存离子的干扰及其消除四、共存离子的干扰及其消除五、紫外分光光度法简介五、紫外分光光度法简介本节内容可自学，不作要求本节内容可自学，不作要求作业：作业：P249 111，13第四节 提高测量灵敏度和准一、分光光度法的误差二、选择作业题 P234 2，5，6（第一次课，幻灯片126杂化轨道）10，11，12（第二次课，幻灯片2755）13，14（第三次课，幻灯片5666+习题6、11、12 分光光度第一节）第四次课，分光光度第二、三节胶体第一节幻灯片5666+习题6、11、12作业：P249 3，5，7，8第五次课，胶体第二节作业P271 2、3、4第六次课，胶体第三、四节化学学习方法作业P271 6作业题 P234 2，5，6（第一次课，幻灯片126