免疫沉淀技术课件

免疫沉淀技术免疫沉淀技术免疫沉淀技术免疫沉淀技术免疫沉淀技术免疫沉淀反1免疫沉淀技免疫沉淀技术一.免疫沉淀反免疫沉淀反应定定义二.免疫化学基免疫化学基础三.免疫沉淀技免疫沉淀技术分分类四.免疫沉淀技免疫沉淀技术的的应用用免疫沉淀技术免疫沉淀反应定义免疫沉淀技免疫沉淀技术一.免疫沉淀反免疫沉淀反应定定义二.免疫化学基免疫化学基础三.免疫沉淀技免疫沉淀技术分分类四.免疫沉淀技免疫沉淀技术的的应用用免疫沉淀技术免疫沉淀反应定义免疫沉淀反免疫沉淀反应可溶性抗原与相可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异性抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现的蛋白的蛋白质析出析出现象。象。与凝集反与凝集反应、中和反、中和反应、补体参与的抗原抗体反体参与的抗原抗体反应并称并称经典免疫学技典免疫学技术免疫沉淀反应可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异性免疫沉淀技免疫沉淀技术一.免疫沉淀反免疫沉淀反应定定义二.免疫化学基免疫化学基础三.免疫沉淀技免疫沉淀技术分分类四.免疫沉淀技免疫沉淀技术的的应用用免疫沉淀技术免疫沉淀反应定义沉淀反沉淀反应原理原理沉淀原沉淀原（precipitinogen）沉淀素沉淀素（precipitin）沉淀反应原理沉淀原（precipitinogen）沉淀素抗原抗体抗原抗体间的力的力抗原抗体间的力1.疏水性的改疏水性的改变2.电荷的改荷的改变3.分子量及分子量及结构的改构的改变沉淀的沉淀的发生生疏水性的改变沉淀的发生抗原的价抗原的价抗原的价抗体的价抗体的价IgG、IgA、IgD和IgE类抗体：两价分泌型IgA：四价IgM类抗体：十价抗体的价IgG、IgA、IgD和IgE类抗体：两价亲和力和和力和亲合力合力affinityavidity亲和力和亲合力affinityavidity抗原抗体反抗原抗体反应的特异性的特异性抗原抗体反应的特异性特异性的物特异性的物质基基础epitope特异性的物质基础epitope交叉反交叉反应交叉反应交叉反交叉反应的物的物质基基础1.抗原异抗原异质性性（antigen heterogeneity）2.共同抗原决定簇共同抗原决定簇（common antigenic determinant）3.决定簇相似决定簇相似 交叉反应的物质基础1.抗原异质性共同抗原的共同抗原的类型型1.同种抗原同种抗原2.嗜异性抗原（又称嗜异性抗原（又称Forssman抗原）抗原）共同抗原的类型1.同种抗原抗原抗体反抗原抗体反应的最适比例的最适比例抗原抗体反应的最适比例抗原抗体反抗原抗体反应的的阶段性段性1.抗原抗体抗原抗体结合合阶段段2.抗原抗体反抗原抗体反应阶段段抗原抗体反应的阶段性抗原抗体结合阶段抗原抗体反抗原抗体反应的影响因素的影响因素1中性中性盐的作用的作用2pH3温度温度4离子离子强度度抗原抗体反应的影响因素1中性盐的作用中性中性盐的作用的作用加入高浓度盐（如硫酸铵）以脱水，或者用分子量大约6000，浓度34%聚乙二醇（PEG6000），以其多聚物孔隙排阻脱水来大大降低抗原抗体复合物的溶解度。中性盐的作用加入高浓度盐（如硫酸铵）以脱水，pH值尽可能调节pH至复合物的等电点附近，通常此pH值是介于IgG等电点（约pH=7）和抗原等电点之间，也依赖于抗原与抗体的比例。pH值尽可能调节pH至复合物的等电点附近，通常温度温度温度与抗原抗体反应有密切的关系温度升高可促使分子运动加快，抗原与抗体碰撞机会多，容易结合，但也容易再解离;温度低，分子运动慢，撞击机会少，但一旦结合后则不易再分开。温度温度与抗原抗体反应有密切的关系离子离子强度度（1）有利于抗原抗体结合的条件：中等或较低离子强度（2）有利于抗原抗体解离的条件：高离子强度离子强度（1）有利于抗原抗体结合的条件：免疫沉淀技免疫沉淀技术一.免疫沉淀反免疫沉淀反应定定义二.免疫化学基免疫化学基础三.免疫沉淀技免疫沉淀技术分分类四.免疫沉淀技免疫沉淀技术的的应用用免疫沉淀技术免疫沉淀反应定义沉淀反沉淀反应的种的种类1溶液中沉淀反溶液中沉淀反应2凝胶中沉淀反凝胶中沉淀反应沉淀反应的种类1溶液中沉淀反应溶液中沉淀反溶液中沉淀反应是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。溶液中沉淀反应是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的絮状沉淀絮状沉淀试验康氏反应（Kahnstest）:心肌提取的类脂质抗原+反应素（Aegagin）敏感性高，特异性差，易出现假阳性。(1991年首批淘汰)性病研究实验室法(venerealdiseaseresearchlaboratory，VDRL)心拟脂及卵磷酯+反应素（Aegagin）不需加热的血清反应素试验(unheatedserumreagin)心拟脂及卵磷酯+氯化胆碱+反应素（Aegagin）絮状沉淀试验康氏反应（Kahnstest）:反反应最适比最适比测定定（1）抗原稀释法（Dean-Webb法）（2）抗体稀释法（Ramon法）（3）方阵法或棋盘格滴定法（checkerboardtitration）反应最适比测定（1）抗原稀释法（Dean-Webb法）环状沉淀状沉淀试验（ringprecipitationtest）Ascoli于于1902年建立年建立用于用于检查兽类内内脏、毛皮浸液等毛皮浸液等标本中的本中的炭疽杆菌抗原炭疽杆菌抗原环状沉淀试验（ringprecipitationtes免疫比免疫比浊法法（immunoturbidimetry）优点：校正曲点：校正曲线稳定，定，简便快速，易便快速，易于自于自动化，无放射性核素化，无放射性核素污染染缺点：特异性、灵敏度稍差缺点：特异性、灵敏度稍差免疫比浊法（immunoturbidimetry）优点：校免疫比免疫比浊法的分法的分类（1）透射比浊法（transmissionturbidimetry）（2）散射比浊法（nephelometry）（3）免疫胶乳浊度测定法（immunolatexturbidimetry）（4）速率抑制免疫比浊法（rateinhibitionimmunoturbidimetry）免疫比浊法的分类（1）透射比浊法（transmission免疫沉淀技免疫沉淀技术（Immunoprecipitationassay）免疫沉淀技术（Immunoprecipitationas关关键因素因素1.抗原的丰度抗原的丰度2.抗体的抗体的结合能力合能力3.蛋白和抗体的可接触性蛋白和抗体的可接触性关键因素抗原的丰度应用范用范围应用范围免疫共沉淀技免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitationassay）免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitatio结果分析果分析Nat Immunol.2008 Apr;9(4):369-77.结果分析NatImmunol.2008Apr;9(4)GSTPULLDOWNGSTPULLDOWN结果分析果分析PNAS February 26,2008 vol.105 no.8 2836-2841 结果分析PNASFebruary26,2008vol应用范用范围1.寻找新的相互作用蛋白2.验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用应用范围寻找新的相互作用蛋白免疫共沉淀的局限性免疫共沉淀的局限性（1）难以检测低亲和力和短暂的相互作用（2）不能够确切分辨第三种蛋白的桥联作用（3）灵敏度不如亲和色谱高（4）需对未知蛋白的相关信息有一定了解免疫共沉淀的局限性（1）难以检测低亲和力和短暂的相互作用基因基因转录调控控基因转录调控染色染色质免疫共沉淀免疫共沉淀染色质免疫共沉淀染色染色质免疫共沉淀免疫共沉淀染色质免疫共沉淀结果分析果分析Mol Cancer Ther June 2010 vol.9 no.6 1764-1774 结果分析MolCancerTherJune2010RNA免疫沉淀免疫沉淀在生理状态下对结合在RNA上的蛋白质进行免疫沉淀，然后通过基因芯片或者其它手段检测目的RNA的含量。RNA免疫沉淀在生理状态下对结合在RNA上的蛋白应用范用范围1.研究蛋白与DNA的动态作用2.研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系3.研究蛋白与RNA的相互作用应用范围研究蛋白与DNA的动态作用免疫沉淀中抗体的免疫沉淀中抗体的选择免疫沉淀中抗体的选择免疫共沉淀技免疫共沉淀技术的的应用用免疫共沉淀技术的应用凝胶中沉淀反凝胶中沉淀反应以一定浓度（12%）的琼脂（或琼脂糖）凝胶作为介质，将抗原、抗体溶液分别放在琼脂凝胶板上并使它们彼此在凝胶中自由扩散，形成浓度梯度，当抗原与抗体相遇且比例适当时，在相应位置即可出现可见的沉淀环或沉淀线。凝胶中沉淀反应以一定浓度（12%）的琼脂（或琼沉淀沉淀线特点特点1.形成沉淀线的特异性抗原抗体无法通过沉淀线，只能在沉淀线周围形成沉淀2.与沉淀线无关的抗原和抗体分子则可以自由通过3.沉淀线的位置与抗原抗体的浓度和迁移率有直接关系沉淀线特点形成沉淀线的特异性抗原抗体无法通过沉淀线，只能在沉单相免疫相免疫扩散散试验（singleimmunodiffusion）单相免疫扩散试验（singleimmunodiffusi双向免疫双向免疫扩散散试验（doubleimmunodiffusion）双向免疫扩散试验（doubleimmunodiffusi沉淀沉淀线分析分析A B C D E F AgAb沉淀线分析ABC沉淀沉淀线分析分析沉淀线分析免疫免疫电泳泳（immunoelectrophoresis）免疫电泳（immunoelectrophoresis）对流免疫流免疫电泳泳（counterimmunoelectrophoresis）对流免疫电泳（counterimmunoelectrop火箭免疫火箭免疫电泳泳（rocketimmunoelectrophoresis）火箭免疫电泳（rocketimmunoelectroph交叉免疫交叉免疫电泳泳（crossedimmunoelectrophoresis）交叉免疫电泳（crossedimmunoelectrop免疫固定免疫固定电泳泳（immunofixationelectrophoresis）首先将蛋白质抗原进行电泳分离，电泳后直接将抗体加于蛋白质区带表面，抗体与对应的抗原就会直接结合，形成的复合物嵌于固相支持物中。Urine Immunofixation Electrophoresis免疫固定电泳（immunofixationelectro免疫印迹技免疫印迹技术（immunoblotting）免疫印迹技术（immunoblotting）基本流程基本流程一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）1.收集蛋白样品：贴壁细胞、组织、药物处理细胞2.蛋白质浓度测定：BCA3.电泳：10分离胶、4的浓缩胶4.电泳结果检查二.电转移毛细管印迹法和电泳印迹法基本流程一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）转移膜的移膜的选择NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低较高低结合能力80110ug/cm2400ug/cm2125200ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿,避免气泡缓冲液润湿100%甲醇润湿检测方式常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测适用范围0.45um一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中)糖蛋白检测和蛋白质测序价格价格较便宜便宜较贵转移膜的选择NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高基本流程基本流程三酶免疫定位1.封闭：2.抗体的的选择：来源、标记、效价、二抗3.标记的选择：HRP、AP基本流程三酶免疫定位技技术优势1.灵敏度高2.特异性高3.方法简便4.无需纯化5.易于观察、保存技术优势灵敏度高应用范用范围1.蛋白质相对含量检测2.蛋白质修饰水平分析3.蛋白质相互作用研究应用范围蛋白质相对含量检测谢谢谢谢66