微生物检查技术培训课件

微生物微生物检查技技术 曲霉菌检查曲霉菌检查n n形态学观察和直接涂片为主n n快速早期检查方法少n nG实验和GM实验22 曲霉菌检查技术曲霉菌检查技术基础基础烟曲霉烟曲霉 菌落特征：菌落特征：生长快，绒毛状或絮状，表面深绿色或烟绿色生长快，绒毛状或絮状，表面深绿色或烟绿色 背面苍白色或淡黄色背面苍白色或淡黄色 48 48生长良好生长良好 镜下特征：镜下特征：分生孢子头短柱状，分生孢子梗壁光滑，呈淡绿色分生孢子头短柱状，分生孢子梗壁光滑，呈淡绿色 顶囊呈烧瓶状顶囊呈烧瓶状 小梗单层、分布在顶囊的上半部分小梗单层、分布在顶囊的上半部分 分生孢子球形、绿色、有小刺分生孢子球形、绿色、有小刺33 曲霉形态曲霉形态n n烟曲霉菌落烟曲霉菌落44 曲霉形态曲霉形态n n烟曲霉棉兰染色烟曲霉棉兰染色55 黄曲霉黄曲霉n n黄曲霉形态黄曲霉形态66 黄曲霉形态黄曲霉形态n n黄曲霉黄曲霉 菌落特征：菌落特征：生长快，羊毛状或棉毛状，表面黄绿色或棕绿色生长快，羊毛状或棉毛状，表面黄绿色或棕绿色 背面无色或淡黄色背面无色或淡黄色 镜下特征：镜下特征：分生孢子头放射状或疏松状，分生孢子梗壁厚粗糙分生孢子头放射状或疏松状，分生孢子梗壁厚粗糙 顶囊呈球形或近球形顶囊呈球形或近球形 小梗单层、双层或同时存在、布满顶囊表面小梗单层、双层或同时存在、布满顶囊表面 分生孢子球形、近球形分生孢子球形、近球形77 黄曲霉黄曲霉n n黄曲霉分生孢子黄曲霉分生孢子n n棉兰染色棉兰染色88 黑曲霉黑曲霉 菌落特征：菌落特征：生长快，羊毛状或绒毛状，表面白色生长快，羊毛状或绒毛状，表面白色黄色黄色黑色黑色 背面无色或淡黄色背面无色或淡黄色 镜下特征：镜下特征：分生孢子头放射状，或列柱状分生孢子头放射状，或列柱状 分生孢子梗壁光滑，较厚分生孢子梗壁光滑，较厚 顶囊呈球形或近球形，小梗双层、密生于顶囊的全顶囊呈球形或近球形，小梗双层、密生于顶囊的全 部表面部表面 分生孢子球形、有褐色色素沉积在细胞壁，粗糙有分生孢子球形、有褐色色素沉积在细胞壁，粗糙有刺刺99 黑曲霉黑曲霉n n黑曲霉菌落黑曲霉菌落1010 土曲霉形态土曲霉形态 菌落特征：菌落特征：生长快，绒毛状，有浅放射状沟纹生长快，绒毛状，有浅放射状沟纹 表面肉桂色或黄褐色；培养基可呈污褐色，表面肉桂色或黄褐色；培养基可呈污褐色，背面淡黄色到棕色背面淡黄色到棕色 镜下特征：镜下特征：分生孢子头致密圆柱状分生孢子头致密圆柱状 分生孢子梗无色光滑分生孢子梗无色光滑 顶囊呈半球形，上顶囊呈半球形，上1/21/31/21/3处有双层小梗处有双层小梗 分生孢子球形或近球形，壁光滑，棕色分生孢子球形或近球形，壁光滑，棕色1111 土曲霉土曲霉n n土曲霉形态土曲霉形态1212 土曲霉土曲霉n n土曲霉分生孢子头土曲霉分生孢子头n n棉蓝染色棉蓝染色1313 构巢曲霉构巢曲霉 菌落特征：菌落特征：中等速度生长，绒毛状中等速度生长，绒毛状粉末状粉末状 表面：绿色或黄褐色表面：绿色或黄褐色 背面：紫色或橄榄色背面：紫色或橄榄色 镜下特征：镜下特征：分生孢子头呈密短圆柱形分生孢子头呈密短圆柱形 分生孢子梗短，弯曲，光滑无色分生孢子梗短，弯曲，光滑无色 顶囊呈半球形或烧瓶形，双层小梗顶囊呈半球形或烧瓶形，双层小梗 分生孢子球形，粗糙，有小刺或小皱褶分生孢子球形，粗糙，有小刺或小皱褶 壳细胞较多（球形、膜厚较大），可见闭囊壳（灰白壳细胞较多（球形、膜厚较大），可见闭囊壳（灰白紫红色）紫红色）1414 构巢曲霉构巢曲霉n n菌落形态菌落形态1515 构巢曲霉构巢曲霉n n分生孢子头分生孢子头1616 曲霉菌检查技术进展曲霉菌检查技术进展n n在曲霉感染的免疫学诊断中倍受青睐在曲霉感染的免疫学诊断中倍受青睐 标本可取血清、尿液、脑脊液及标本可取血清、尿液、脑脊液及BAL BAL 液等液等 被检测的抗原成分主要是半乳甘露聚糖被检测的抗原成分主要是半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)(galactomannan,GM)脂多糖脂多糖n n GM GM在感染后在感染后24 h24 h即可检测出，与病情严重程即可检测出，与病情严重程度一致度一致 常用的是常用的是EL ISAEL ISA、RIA RIA 和乳胶凝集试验等和乳胶凝集试验等 敏感性和特异性因方法而异敏感性和特异性因方法而异1717曲霉半乳甘露聚糖抗原测定n n曲霉抗原乳胶凝集试验曲霉抗原乳胶凝集试验:特异性：特异性：90-100%90-100%；敏感性：；敏感性：26-76%(15ng/ml)26-76%(15ng/ml)曲霉抗原曲霉抗原EIAEIA试验试验:特异性：特异性：90%90%；敏感性：；敏感性：80-100%(1ng/ml)80-100%(1ng/ml)动态检测动态检测,每周二次每周二次 GM GM试验参考值：试验参考值：I I1.51.5阳性；阳性；1.01.01.51.5可疑；可疑；I I1.01.0阴性阴性1818 微生物检查技术和进展微生物检查技术和进展n n美国和欧洲判断标准不同(1.0,0.6)n n我国学者发现单次测定大于1.0，或连续两次大于0.8为阳性标准，敏感度和特异度均较高，分别为81.8%和93.3%n n纪宇等 中华血液学杂志，2007 28:83-861919 曲霉感染抗原检测的优点n n结果稳定：检测不受患者免疫功能状况的影响 敏感性强：在临床症状出现同时或之前,便可在体液中检测出特异性抗原,故适用于早期诊断 可判断预后及疗效：抗原浓度可随病情活动而变化,有助于疗效判定2020 微生物检查技术进展微生物检查技术进展n n血浆血浆 1 1，3 3D D葡聚糖检测（葡聚糖检测（G G试验）试验）目的：通过测定血浆、体液及支气管肺泡目的：通过测定血浆、体液及支气管肺泡 灌洗液中细胞壁成分（血浆灌洗液中细胞壁成分（血浆 1 1，3 3D D葡葡 聚糖），诊断深部真菌感染聚糖），诊断深部真菌感染 原理：利用鲎的原理：利用鲎的G G凝血因子被凝血因子被 葡聚糖激活葡聚糖激活 后形成凝固蛋白，以浊度定量标本中的真后形成凝固蛋白，以浊度定量标本中的真 菌菌 葡聚糖浓度葡聚糖浓度2222 微生物检查技术和进展微生物检查技术和进展n n参考临界值：参考临界值：13.7pg/ml13.7pg/mln n真菌定植：真菌定植：13.713.720pg/ml20pg/mln n深部真菌感染：深部真菌感染：20pg/ml20pg/mln n意义：意义：早期诊断除结合菌、隐球菌外的深部真菌早期诊断除结合菌、隐球菌外的深部真菌 感染，如念珠菌、曲霉等。感染，如念珠菌、曲霉等。敏感性与特异性为敏感性与特异性为606090902323 微生物检查技术和进展微生物检查技术和进展n n假阳性:n n运用纤维素膜进行血液透析患者、某些纱布或其他医疗用品中含有葡聚糖、某些静脉制剂含葡聚糖、某些细菌败血症患者(链球菌)、使用安美汀者n n动态监测可避免假阳性n n已有“三证”2424 微生物培养技术和进展微生物培养技术和进展n n现在国内已有生产厂家且北京、上海、天津、广东已有定价收费项目n n两种实验比较:国外研究表明：两种试验敏感性、特异性相当，其出现阳性的时间稍早于半乳甘露聚糖抗原，两者均早于影像学出现改变，联合检测可提高特异性 J Clin Mic，2005，43:299-3052525定量测定定量测定1-3-D-葡聚糖的意义葡聚糖的意义n n早期诊断：早期诊断：早期诊断：早期诊断：深部真菌感染增多且复杂，早期症状无特异深部真菌感染增多且复杂，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。n n快速诊断：快速诊断：快速诊断：快速诊断：真菌感染就医的患者，往往病情严重，传统真菌感染就医的患者，往往病情严重，传统的微生物分离、培养与鉴定需要时间较长，患者在等待的微生物分离、培养与鉴定需要时间较长，患者在等待期间有可能病情加重，甚至死亡。期间有可能病情加重，甚至死亡。n n指导用药：指导用药：指导用药：指导用药：快速确定真菌感染后，积极使用抗真菌药物。快速确定真菌感染后，积极使用抗真菌药物。为临床选用副作用小，疗效高，价格昂贵的药物提供准为临床选用副作用小，疗效高，价格昂贵的药物提供准确的依据。确的依据。n n评价用药：评价用药：评价用药：评价用药：应用抗真菌药物后，检测葡聚糖变化，评价应用抗真菌药物后，检测葡聚糖变化，评价选用药物的正确性。选用药物的正确性。n n监护病程：监护病程：监护病程：监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。监护深部真菌感染易感人群的病发状态。n n动态观察：动态观察：动态观察：动态观察：易感人群，临床疗效易感人群，临床疗效2626定量测定定量测定1-3-D-葡聚糖的葡聚糖的设备设备n nMB-80 MB-80 微生物快速动态测定系统：主机反微生物快速动态测定系统：主机反应器，数据处理分析软件，计算机，打印应器，数据处理分析软件，计算机，打印机，电子恒温加热仪等。机，电子恒温加热仪等。2727定量测定定量测定1-3-D-葡聚糖的葡聚糖的设备设备n nT01智能恒温仪n n真菌检测专用真空采血管，采尿杯n n无热原平底专用试管2828n n测定葡聚糖可以很快得到结果，在实践中不必等待真菌测定葡聚糖可以很快得到结果，在实践中不必等待真菌培养的结果，对临床医生采取积极的治疗提供依据。培养的结果，对临床医生采取积极的治疗提供依据。n n动态快速检测，不受血中抗生素和酶等的影响。动态快速检测，不受血中抗生素和酶等的影响。n n所有真菌的细胞膜上都含有所有真菌的细胞膜上都含有1-3-D1-3-D葡聚糖，而其他微葡聚糖，而其他微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分，生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分，因此在机体的体液中检测到因此在机体的体液中检测到1-3-D1-3-D葡聚糖是诊断深部葡聚糖是诊断深部真菌感染的有效依据。真菌感染的有效依据。n n不能确定菌种，但能肯定是否有真菌感染。指导临床科不能确定菌种，但能肯定是否有真菌感染。指导临床科学合理的使用抗真菌药物。当检测到标本中葡聚糖含量学合理的使用抗真菌药物。当检测到标本中葡聚糖含量较高时，即刻予以系统治疗，不必等鉴定出种属。较高时，即刻予以系统治疗，不必等鉴定出种属。定量测定定量测定1-3-D-葡聚糖特点葡聚糖特点n n样品来源：血浆，血清，腹水，尿液，脑脊液样品来源：血浆，血清，腹水，尿液，脑脊液2929定量测定定量测定1-3-D-葡聚糖的葡聚糖的原理原理凝固蛋白原凝固蛋白动态浊度法凝固酶凝固酶原活化因子G因子G1-3-D-葡聚糖全过程全过程2小时内完成，可及时小时内完成，可及时提供结果，指导临床提供结果，指导临床3030定量测定定量测定1-3-D-葡聚糖的葡聚糖的原理原理n n不同浓度反应体系引起不同的浊度不同浓度反应体系引起不同的浊度变化，当透光率达到法线时，该时变化，当透光率达到法线时，该时间的对数（间的对数（LgTgLgTg），与葡聚糖的浓），与葡聚糖的浓度（度（LgCLgC），呈直线关系），呈直线关系定量依据3131定量测定定量测定1-3-D-葡聚糖的葡聚糖的设备设备国内外现状国内外现状国外现状国外现状国内现状国内现状n n美国、日本等国均美国、日本等国均已出现专用的已出现专用的1-3-1-3-D-D葡聚糖检测仪葡聚糖检测仪器及配套的检测试器及配套的检测试剂盒，而且获得剂盒，而且获得FDAFDA及厚生省批准及厚生省批准文号，作为一种日文号，作为一种日常检测项目。常检测项目。n nMB-80MB-80微生物动态微生物动态快速测定系统（金快速测定系统（金山川公司）山川公司）n n首家获得首家获得SDASDA认证认证n n普及面广普及面广,影响大影响大.n n国内独创专利产品国内独创专利产品n n计算机软件著作权计算机软件著作权3232使用使用MB-80的临床评价的临床评价关于真菌葡聚糖试剂的比对试验-病人 细菌培养结果 金山川试剂 和光试剂-65/M 白色念珠菌 86.2 84.676/M 热带念珠菌 36.2 33.522/F 毛霉菌 480.9 476.675/M 烟曲霉菌 265.1 235.481/M 热带念珠菌 31.5 36.278/F 光滑念珠菌 54.2 55.761/M 白色念珠菌 22.4 20.268/F 近平滑念珠菌 8.6 5.6-3333使用使用MB-80的临床评价的临床评价n n正常对照组血浆正常对照组血浆1-3-D1-3-D葡聚糖含量为葡聚糖含量为2.832.57 pg/ml2.832.57 pg/ml；深部真菌感染组为；深部真菌感染组为54.0636.13 pg/ml54.0636.13 pg/ml。经。经t-t-检验分析，对照组检验分析，对照组与深部真菌感染组与深部真菌感染组1-3-D1-3-D葡聚糖平均值差异葡聚糖平均值差异非常显著（非常显著（t=7.741,Pt=7.741,P0.0010.001）。）。n n血浆葡聚糖检测可在拟诊早期为临床医生提供血浆葡聚糖检测可在拟诊早期为临床医生提供是否感染真菌的可靠信息，是一种实用的真菌是否感染真菌的可靠信息，是一种实用的真菌感染早期诊断方法。感染早期诊断方法。n n第四军医大学西京医院检验科第四军医大学西京医院检验科MB-80MB-80微生物微生物快速动态检测仪研究深部真菌感染患者血快速动态检测仪研究深部真菌感染患者血浆浆1-3-D1-3-D葡聚糖检测与临床意义时发现：葡聚糖检测与临床意义时发现：-中华医院感染学杂志中华医院感染学杂志,2005,15(3):354-355,2005,15(3):354-3553434深部真菌感染的病例分析深部真菌感染的病例分析n n患者，男患者，男,41,41岁岁,因双下肢关节疼痛因双下肢关节疼痛1 1月余月余,发热、咳嗽、痰血发热、咳嗽、痰血1010余天于余天于20062006年年9 9月月1212日入院日入院.入院前曾予以青霉素抗感染治疗入院前曾予以青霉素抗感染治疗,无好转无好转,随后出现随后出现,体温在体温在3939度左右波动度左右波动,并有咳痰并有咳痰,痰中血丝痰中血丝症状症状.胸部胸部CTCT检查检查,发现左肺阴影。入院后发现左肺阴影。入院后9 9月月1818日进行支气管日进行支气管镜检查及作病理活检镜检查及作病理活检,显示肺左上方叶管口真菌感染显示肺左上方叶管口真菌感染.诊断为侵诊断为侵袭性肺曲菌病袭性肺曲菌病.实验室检查实验室检查:入院当天化验血常规显示白细胞入院当天化验血常规显示白细胞 10.1*109/L(10.1*109/L(中性粒细胞中性粒细胞71%,71%,淋巴细胞淋巴细胞18.2%,18.2%,单核细胞单核细胞9.3%).9.3%).血沉加快血沉加快,C,C反应蛋白反应蛋白(CRP)(CRP)和降钙素原均升高和降钙素原均升高.9.9月月1414日痰培养日痰培养结果为阴性结果为阴性.9.9月月2222日再一次进行痰培养和血浆日再一次进行痰培养和血浆(1,3)-(1,3)-葡聚糖葡聚糖检测检测,培养结果依然为阴性但血浆培养结果依然为阴性但血浆(1,3)-(1,3)-葡聚糖检测为阳性葡聚糖检测为阳性 (1806 pg/ml).(1806 pg/ml).治疗：入院后给予哌拉西林治疗：入院后给予哌拉西林/他唑巴坦和西米替他唑巴坦和西米替丁作抗菌治疗丁作抗菌治疗,高热未有好转高热未有好转,随后随后9 9月月2121日给予氟康唑静点日给予氟康唑静点,高热好转高热好转,体温在体温在3737度左右波动度左右波动,以后继续予以抗真菌治疗以后继续予以抗真菌治疗,情情况逐渐好转况逐渐好转,9,9月月3030日出院日出院.3535